模式植物拟南芥T
拟南芥TDNA插入突变体的鉴定
遗传学实验报告拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定一、实验目的：1、学习和掌握基本的植物DNA的CTAB提取法，掌握PCR、琼脂糖凝胶电泳等基本实验操作技能2、了解T-DNA插入突变体的鉴定原理，掌握其方法。
二、实验原理1、拟南芥（Arabidopsis thaliana）十字花科，植物遗传学、发育生物学和分子生物学的模式植物。
植株形态个体小，高度只有30cm左右；生长周期快，从播种到收获种子一般只需8周左右；种子多，每株可产生数千粒种子；形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；遗传转化简单，转化效率高；基因组小，只有5对染色体，125MB；在2000年，拟南芥成为第一个基因组被完整测序的植物。
2、突变体突变体是遗传学研究的最重要材料。
突变体可以通过自然突变和人工诱变的方法获得。
拟南芥诱变常用方法有EMS诱变、T-DNA插入突变、激活标签。
由于T-DNA插入突变体便于对突变基因进行追踪，目前拟南芥、水稻中已经有大量的T-DNA插入突变体；SALK中心提供的拟南芥T-DNA插入突变体超过十万种。
3、T-DNA插入突变原理T-DNA，转移DNA（transferred DNA ），是根瘤农杆菌Ti质粒中的一段DNA序列，可以从农杆菌中转移并稳定整合到植物基因组。
人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，获得转基因植株。
除用于转基因以外，T-DNA插入到植物的基因中可引起基因的失活，从而产生基因敲除突变体，T-DNA大多为单拷贝插入，使其利于进行遗传分析。
4、T-DNA插入突变体PCR鉴定图 1 结果鉴定图 2 PCR引物设计三、实验材料1、材料：T-DNA插入的突变拟南芥植株；2、仪器：离心管，离心机，水浴锅，移液枪，PCR仪，电泳槽等；3、试剂：液氮，CTAB提取液，氯仿/异戊醇（24：1），无水乙醇，70%乙醇，10xTaq buffer，MgCl2，引物，琼脂糖，溴化乙锭（EB）。
模式植物拟南芥
模式植物拟南芥个体特征拟南芥英文名Thale Cress拉丁名Arabidopsis thaliaba,又名鼠耳芥，阿拉伯芥，阿拉伯草。
是一种细长而直立的植物，羽状多叶，茎高度达40厘米。
二年生草本，基生叶有柄呈莲座状，叶片倒卵形或匙形；茎生叶无柄，披针形或线形。
总状花序顶生，花瓣4片，直径约3毫米，白色，匙形，雄蕊6枚，花药黄色，雌蕊圆柱状，花柱短，柱头凹陷；花期3～5月。
拟南芥是在植物科学，包括遗传学和植物发育研究中的模式生物之一。
其在植物学中所扮演的角色正仿佛小白鼠在医学和果蝇在遗传学中的一样，其原因主要基于该植物具有以下特点：●植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵；●生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需6周左右；●种子多，每株每代可产生数千粒种子；●形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；●基因与大多数植物基因具有很高的同源性，能代表大多数的特点。
●拟南芥的基因组是目前已知植物基因组中最小的。
每个单倍染色体组（n=5）的总长只有7000万个碱基对，即只有小麦染色体组长的1/80，这就使克隆它的有关基因相对说来比较容易。
●拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型。
例如用含杀草剂的培养基来筛选，一般获得抗杀草剂的突变率是1/100000。
由于有上述这些优点，所以阿拉伯芥是进行遗传学研究的好材料，被科学家誉为“植物中的果蝇”。
[在植物形态建成研究中，经典的例子是花发育的ABC模型。
在结构上，拟南芥的花与大多数开花植物相似，由四轮基本的花器官组成：从外向里分别为花萼、花瓣、雄蕊及雌蕊。
ABC模型中的A、B、C分别指的是控制不同花器官发育的三大类基因，其中A类基因决定了花萼的特征；A类+B类基因共同作用决定了花瓣特征；B类+C类基因共同作用决定了雄蕊特征；C类基因单独作用决定了雌蕊心皮的特征，同时也终止花器官在第四轮形成之后继续分化(A)。
实验十、模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定-23页精选文档
模式植物拟南芥
拟南芥（Arabidopsis thaliana ）又称为阿拉伯芥，是一种十字花 科植物，广泛用于遗传、发育和分子生物学的研究，已成为一种典 型的模式植物。该植物具有以下特点：
植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵； 生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需8周左右； 种子多，每株可产生数千粒种子； 形态特征简单，生命力强，用普通培
养基就可作人工培养； 基因组小，只有5对染色体。 拟南芥是严格的闭花自花受粉植物，
基因高度纯合。易获通过理化处理 获得各种功能的突变体。
外成像仪
实验步骤-拟南芥的栽培
一.在播种前将种子进行消毒，然后置于4℃冰箱中，使 种子在湿润条件下春化2至3天。
二.将春化好的种子播种于有麦氏培养基（MS培养基）的 培养皿中，置于培养室内培养。
三.待幼苗长出后，再选择茁壮的幼苗移栽到土壤中，置 于培养室内培养。
实验步骤-拟南芥T-DNA插入突变体PCR鉴定法
1. CATB法提取DNA：液氮、2×CTAB抽提缓冲溶液、氯仿：异戊醇 =24：1、无水乙醇、70%乙醇、TE
2. PCR：ddH2O、Buffer、MgCl2、dNTP、引物（LP、RP、BP） 、DNA模版、Taq DNA聚合酶
3. 电泳：琼脂糖、Maker、Buffer、EB、TAE
❖ 仪器：离心机，水浴锅，移液器，PCR仪，电泳槽，紫
每小组按10倍准备混合体系； 每个同学需做一颗植株的鉴定（两管PCR）。
LP: JDM17-1NR2 RP: JDM17-1F2 BP: LBb1.3
拟南芥作为模式植物的生物学研究
拟南芥作为模式植物的生物学研究近年来，拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为模式植物在生物学领域得到了广泛应用，被誉为“植物界的小鼠”。
拟南芥不仅长得小巧玲珑，生长周期短，而且基因组完全测序，基因、蛋白质相互作用关系和生命过程得以较为完整地研究。
本文将从拟南芥的基本特征，其重要性及应用领域、拟南芥重要的生命过程研究、拟南芥基因和基因组研究等方面进行阐述。
一、拟南芥的基本特征与应用背景拟南芥是一种小型双子叶植物，生长周期为6周左右，在2月左右可以开始种植，到4月底即可形成完整的植株。
它的体型较小，只有20～25cm高，通常在实验室中以种子的形式进行繁殖和种植，研究人员可以在一个小生长舱中同时培育多个拟南芥植株，在不同条件下进行研究。
这些特点使拟南芥成为了理想的研究对象，成为了许多遗传学、生物学和生命科学实验室中的重要实验材料。
利用拟南芥进行生物学研究的典型应用有：发掘新基因、获得新信号途径、了解蛋白质互作和调节、解析生长发育过程、药物发现和创新等。
基于基因和生命科学的研究日益深入，机理的解析和发现正波及到其他领域，拟南芥的作用也因此被赋予越来越重要的价值。
二、拟南芥的生命过程研究研究拟南芥的生活过程，可以深入了解植物的形态构造，生长发育过程、生物功能及其实现机制。
拟南芥的主要发育过程包括种子萌发、茎叶生长、坐果发育及成熟等。
其中种子萌发是拟南芥生命周期中的第一个重要生命过程。
种子萌发过程中与植物的干细胞和分化状态相关的基因也得到了广泛的研究。
例如，与植物根发育有关的基因MSMs，在拟南芥的生长中已被证明是非常重要的基因之一。
MSMs基因没有被完全表达，它通过抑制大部分细胞分化，使得未分化的细胞在生长中不断繁殖。
另外，拟南芥花部的结构也是研究重要的一部分。
拟南芥属于十字花科，花中包含着可供探究的遗传变异和繁殖机制。
现代遗传学的研究证实，在拟南芥的花部有许多性状与基因程度的相互关系，使科学家能够深入探究基因和生命的奥秘，同时为育种学和环境学提供了理论基础。
模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的PCR鉴定资料讲解
▪ 第一管：
▪
10xTaq buffer
min，再转移上清入新管。 5. 向上清液中加等体积的冷异丙醇，小心混匀。-20 ℃ 放置30 min，12000 rpm离心10 min，
弃上清。 6. 用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm稍离心，弃上清。 7. 将沉淀在超净工作台上吹干，或空气中晾干。加50 μl TE (pH 8.0)放4 ℃缓慢溶解。 8. 电泳检测DNA的浓度和质量。
▪
81.8 g NaCl
▪
0.2%(V/V)β-巯基乙醇
▪注：先将除巯基乙醇之外的药品配好，高压蒸汽灭菌后加入巯基乙醇
▪酚/氯仿/异戊醇： 25：24：1
▪氯仿/异戊醇： 24：1
▪TE缓冲液：Tris-HCl (pH 8.0) 10 mmol/L，EDTA 1 mmol/L
▪3 M NaAc（pH 5.2）
左引物 LP： TCATCCACCATGGAAGAAAAG 右引物 RP：
TTGGATACGATGCGAGTAACC 中间引物LB: TGGTTCACGTAGTGGGCCATCG 用LP+RP产生大带：1107bp 用LB+RP产生小带：560-860bp
三、实验步骤
▪ 实验材料：拟南芥T-DNA插入突变体分 离群体30个株号的植株。
3. 用PCR方法鉴定T-DNA插入纯合突变体
▪ 农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中， 有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在 突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分 离群体中将纯合突变体鉴定出来。
▪ PCR方法为鉴定纯合突变体提供了有利手段。它利用三 个引物LP、RP和BP，其中LP和RP是植物基因组上TDNA插入位点两测的引物，BP是T-DNA区段上的引物。 经过PCR，在野生型植株，LP和RP这对引物扩增出分子 量较大的产物（野生型基因，大带）；在杂合突变体， LP和RP能扩增出分子量较大的产物（野生型基因，大 带），另外BP和RP还能扩增出分子量较小的产物（小 带）；在纯合突变体，只有BP和RP能扩增出分子量较小 的产物（小带）。因此，利用以上三种引物做PCR，根 据扩增结果能够容易地从群体中区分出纯合突变体。
模式植物拟南芥T
模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定摘要当农杆菌侵染植物细胞时，土壤农杆菌的天然质粒—Ti质粒上T-DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入染色体DNA中。
拟南芥的T-DNA插入变异是反向遗传学进行植物生物学研究的重要手段之一，在获得的Ti质粒转化植物细胞后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型，在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。
本实验以拟南芥植株的特定基因突变体作为实验材料，提取DNA，并通过PCR扩增及SDS-PAGE电泳分离检测鉴定，检测该拟南芥是否为转基因的拟南芥，并判断其是纯合突变还是杂合突变。
本次实验目的在于了解拟南芥T-DNA插入突变体鉴定的原理，掌握DNA提取技术、PCR技术以及电泳鉴定技术，对拟南芥的基因型做出判断。
关键词T-DNA插入突变体拟南芥 PCR 琼脂糖凝胶电泳1.引言1.1遗传研究途径（1）正向遗传学研究杂交或诱变→表型观察→遗传规律→确定存在的基因及数目→基因的功能及作用性质。
（2）反向遗传学研究在已知DNA序列的基础上，通过DNA重组、定点突变、插入/缺失等遗传修饰手段创造突变体并研究突变所造成的表型效应，从而研究基因的生物学功能，阐明生命的本质现象与规律。
拟南芥的T-DNA插入变异是反向遗传学进行植物生物学研究的重要手段之一。
1.2模式生物——拟南芥拟南芥广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物，其原因主要基于该植物具有以下特点：①植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵；②生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需6周左右；③种子多，每株每代可产生数千粒种子；④形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；⑤基因组小，只有5对染色体；⑥拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型。
模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定摘要：通过本次实验，了解了拟南芥T-DNA插入突变体鉴定的原理，掌握了DNA提取技术、PCR技术以及电泳鉴定技术，对拟南芥的基因型做出判断。
实验首先提取拟南芥的DNA，将获得的DNA进行PCR扩增，将扩增好的DNA加入上样缓冲液后与DNAmarker一起进行电泳，用凝胶成像系统对凝胶进行处理，可以看到大小不同的DNA条带分离。
通过这种方法鉴定出拟南芥是否为突变体。
关键词：T-DNA插入突变体、DNA提取、PCR、电泳鉴定、凝胶成像系统1.前言拟南芥作为生物学研究的模式植物，由于其易于种植、生活周期短、遗传背景清晰、易于转基因操作等特点，已被广泛应用于植物学的各种基础和应用研究领域中。
同时，拟南芥T—DNA饱和突变体库的建立和T-DNA侧翼序列的确定，为功能基因组学提供了丰富、有效的遗传材料。
2.实验2.1实验目的（1）提取植物基因组DNA的方法；（2）PCR操作方法；（3）琼脂糖凝胶分离核酸方法。
2.2实验原理Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。
所以Ti质粒上的这一段能够转移的DNA被叫做T-DNA。
将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中没通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。
T-DNA插图到植物染色体上的什么位置，是随机的。
如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。
所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
用PCR方法鉴定T-DNA插入船和突变体。
农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体汇总，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体和野生型。
在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。
“三引物法”的原理如图1所示，即用三种引物（LP、BP、RP）进行PCR扩增，野生型植株目的基因的两条染色体上均为发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有一种，分子量约为900bp（即从LP到RP）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，而T-DNA 本身的长度约为17kb，过长的模版会阻抑目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到1种以LB与LP（或RP）为引物进行扩增的产物，分子量约为410+N bp（即从LP或RP到T-DNA 插入位点的片段），长度为300+N bp,再加上从LB到T-DNA载体左边界的片段，长度为110bp）；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA插入，所以PCR扩增后可同时得到410+N bp和900bp两种产物。
拟南芥作为模式植物的优势及其在研究中的应用
拟南芥作为模式植物的优势及其在研究中的应用拟南芥是一种小型草本植物，属于十字花科，被广泛应用于遗传学和植物学领域，成为了模式植物之一。
一、拟南芥的生物学特征拟南芥是一种小型植物，常见高度约在10-20厘米，全年生长期长，大约需要5-7周时间来完成生命周期。
拟南芥生长速度很快且容易培养，因此被广泛应用于生物学研究中。
二、拟南芥在遗传学研究领域的优势1. 遗传变异丰富：拟南芥存在着大量的基因和遗传变异类型，因此可以用于研究不同基因的功能和调控机制。
2. 易于繁殖：拟南芥的生长速度快，繁殖能力强，可以在基因编辑和纯化操作中大量繁殖，可用于复杂的基因分析。
3. 可进行基因操作：拟南芥的基因组序列已被完整测序，可以进行基因编辑操作，易于研究基因在不同环境下的表达和功能。
4. 易于观察：拟南芥的花和叶片易于观察和分辨，方便识别基因的表达范围和影响，研究其作用和机制。
三、拟南芥在植物学研究中的应用1. 功能基因研究：拟南芥可以通过诱导突变或基因编辑等方法轻松筛选出与特定功能相关的基因，并进一步研究其作用机制和调控途径。
2. 发育与形态建成研究：拟南芥具备三次元的器官构建、花序追踪和形态指纹等优势特征，是研究植物的形态和结构生物奥秘的理想模型。
3. 生理学研究：拟南芥可以用作生理学研究的实验材料，如光周期调节生长、温度、水分和营养素等因素对植物生长的影响等，还可以用于药物等物质的研究。
四、结论总之，作为模式植物，拟南芥在遗传学和植物学研究领域中具有独特的优势和应用价值。
随着植物科学的不断发展，相信未来植物学领域中的众多问题将慢慢被拟南芥所揭示。
实验十、模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定
仪器：离心机，水浴锅，移液器，PCR仪，电泳槽，紫
一提取植物DNA；
二.PCR反应；
三.琼脂糖凝胶电泳；
一.提取植物DNA的步骤
(略)
二.PCR鉴定
1.制作反应体系（先混合在分装最后单独加模板）
试剂 ddH2O 10×Tap buffer(Mg2+ free) 模板DNA（3050ng/ul） 引物LP（10um） 引物RP（10um） 引物BP（10um） dNTP(各2.5mM) Tap酶（5U/ ul） 反应体系总体积 单管I（μl） 16 2.5 2 1 1 NO 2 0.5 25 20 5 混合I 160 25 10 10 单管II（μl） 16 2.5 2 NO 1 1 2 0.5 25 10 10 20 5 混合II 160 25 -
杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移，插入植物染色体DNA 中，Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。 T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。如果T-DNA插入某个功 能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。利用
农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
实验目的
1．熟练掌握植物基因组DNA快速提取的方法； 2．掌握利用PCR方法鉴定拟南芥T-DNA插入突变 体的方法。
实验材料
野生型（Col）、ibm1突变体（SALK_023533）拟南 芥植株 IBM1(AT3G07610)是拟南芥中组蛋白修饰酶的编码基 因，能影响植物的诸多的发育和生殖过程。
植物生理学课件：第十三章 植物分子生物学模式植物拟南芥
1980 年公布了拟南芥的详细遗传图谱；
1987年在美国密歇根洲立大学召开了专 门国际会议；
1990年确立了拟南芥的长期研究目 标。到2000年底完成基因组测序， 并强调要把其研究成果得到应用；
1996年成立的一个拟南芥基因组测 序的国际合作组开始工作。
周期8/16h or 12/12h
拟南芥的突变体类型
形态突变株 生物化学突变株 以生理和激素为特征的突变株
aba mutant
WUS mutant
图片来自：中科院植物研究所种康实验室的徐云远研究员
拟南芥的遗传转化方法
•真空渗入法 •速蘸法
拟南芥的准备
培养室内的拟南芥（Arabidopsis
2000年底公布了5条染色体的测序 结果和分析报告
拟南芥的生物学特性
植株个体小15-20cm，栽培方便，占地 面积小；
生育期短40天，种子小(0.2ug)，结实 多
自花受粉，人工授粉容易 整个植株由下面根 及莲座叶 、茎、茎生
叶和总状花序组成，花由4个花瓣呈十字 对称排列、花萼4片、花药6枚，2个心 皮。
thaliana gl1）苗长至抽薹1cm高时，剪去苔的尖端使次生花
序生长（勿剪去整个苔），剪时刀口应位于最高茎生叶的 上方（使腋生花序的茎位于茎生叶的基部），4天后植株有 侧枝并已经有一些花蕾，就可以进行农杆菌转化。
农杆菌的培养 分别接种含目的质粒的农杆菌GV3101于10mlYEB的 液体培养基（含125mg/l Rif, 100mg/l Kan）中预
制备kan抗性的MS选择平板，T0代种子消 毒后，用无菌水清洗3次后，将种子平铺在MS 选择培养基上（50ug/l Kan），4℃下春化3 天 后 ， 移 入 生 长 箱 中 （ 22℃ 恒 温 ， 光 强 为 130-140 umol.m-2s-1）,7天后挑选T1代阳 性植株。阳性植株特征：真叶健康成深绿色， 根伸长至培养基中，而非抗Kan植株叶发黄， 且苗小。将抗Kan的植株从选择培养基上挑出， 转移到正常MS培养基上，继续生长一周后移
神奇的模式植物--拟南芥
神奇的模式植物--拟南芥拟南芥与油菜、萝卜、卷心菜等同为十字花科植物，向下细分为鼠耳芥属。
拟南芥又名鼠耳芥、阿拉伯芥、阿拉伯草，拉丁文名为Arabidopsis thaliala (L.) Heynh。
拟南芥作为一种草本植物广泛分布于欧亚大陆和非洲西北部。
在我国的内蒙、新疆、陕西、甘肃、西藏、山东、江苏、安徽、湖北、四川、云南等省区均有生长。
我国古人常将身边的一些卑微、低贱之物“视若草芥”，拟南芥早先也就是一种无声无息、名不见经传的小草。
拟南芥既不好吃、也不好看，对人类毫无经济价值。
但近一百年来，随着生物学和经典遗传学的蓬勃发展，科学家们逐渐注意到它的研究价值。
长期以来，科学家一直希望在植物中找到像动物中的黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）那样繁殖快、易于在实验室培养、适于遗传操作的实验材料，进而从根本上改变植物遗传学研究的长期落后状况。
拟南芥植株较小（一个8cm见方的培养钵可种植4-10株）、生长周期短（从发芽到开花约4-6周）、结实多（每株植物可产生数千粒种子）。
拟南芥的形态特征分明（图1），莲座叶着生在植株基部，呈倒卵形或匙形；茎生叶无柄，呈批针形或线形。
侧枝着生在叶腋基部，主茎及侧枝顶部生有总状花序，四片白色匙形花瓣，四强雄蕊。
长角果线形，长约1-1.5cm，每个果荚可着生50-60粒种子。
图1 拟南芥的形态这些特点使得拟南芥的突变表型易于观察，为突变体筛选提供了便利。
拟南芥是典型的自交繁殖植物，易于保持遗传稳定性。
同时，可以方便的进行人工杂交，利于遗传研究。
拟南芥的另一个优点是易于转化。
经过不断的实践，浸花法（floral tip）已成为拟南芥转化最常用的方法。
对生长5-6周已抽苔的拟南芥打顶来促进侧枝生长（图2A），待花序大量产生时将其在含有转化辅助剂silwet和蔗糖的农杆菌溶液中浸泡几分钟（图2B），3-4周后对转化植株收种子（图2C）。
在含有合适抗生素的平板上对种子进行筛选，能够健康生长的幼苗为转基因植株（图2D）。
拟南芥作为模式生物的研究价值
拟南芥作为模式生物的研究价值拟南芥，又称为矮地茉莉，是一种小型草本植物，常被用作模式生物进行基因遗传学和发育生物学研究。
近年来，随着基因编辑技术的发展，拟南芥更加受到科学家的重视。
本文将探讨拟南芥作为模式生物的研究价值。
一、拟南芥的基因组大小和基因数量拟南芥的基因组大小约为1.5亿个碱基对，仅有5条染色体，其中共编码了约2.4万个基因。
这么小的基因组使得拟南芥的基因与其它物种相对应比较容易，使我们更容易理解基因之间在调控上的作用。
同时，基因数目较少，使得进行基因突变或基因编辑等技术研究时成本更低，操作更为简便。
二、拟南芥的生命周期短拟南芥的生命周期只有6-8周。
小生命周期的优势在于可以在短时间内观察许多世代之间的变化，从而探寻基因在生物发育方面的作用。
同时，其种子数量也非常的庞大，每个成熟花序大约可产出200-300颗种子，大大增加了对基因编辑技术的容错率。
三、拟南芥的代表性拟南芥被认为是植物中最标准的模式生物。
其基因组已经被广泛肯定并广泛研究，其更受欢迎的原因之一是其遗传学的简单性，其生命周期快速，易于获取突变库; 另外，拟南芥是一种常绿植物，因此它的发芽和生长具有简便性和可重复性，能够极大的促进科学家在较短时间内完成显微操作来获取正确的数据。
四、拟南芥的遗传多样性拟南芥在全球有1000多个遗传品种。
这些遗传品种对于环境的适应力不同，能够为基因解读提供极多的参考。
科学家可以获取不同的拟南芥种类进行相关实验，观察它们的遗传变异产生的差异，结合现代分子遗传学、全基因组测序和生物信息学分析，确立基因和表型之间的相关类别。
五、拟南芥在基因编辑和转基因技术中的应用近年来，CRISPR-Cas9基因编辑技术的出现让科学家们对拟南芥进行更深入的研究。
利用CRISPR基因编辑一些目的基因，也可以揭示该物种基因修正的影响。
科学家利用CRISPR-Cas9引发基因的突变，观察不同基因变异与个体表型的关系，探究基因和个体因素间的关联性，进一步为物种学和发育生物学提供了庞大的数据库。
t-DNA鉴定1
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• DNA经溴乙锭（EB）染色，溴乙锭可以插入 DNA经溴乙锭（EB）染色， 经溴乙锭 DNA双螺旋结构两个碱基之间 双螺旋结构两个碱基之间， DNA双螺旋结构两个碱基之间，与核酸形成 络合物，在紫外（300nm,360nm）激发下， 络合物，在紫外（300nm,360nm）激发下， 产生桔黄色荧光（ nm可见光 可见光）。 产生桔黄色荧光（590 nm可见光）。
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• 利用三个引物做PCR鉴定纯合突变体 利用三个引物做PCR鉴定纯合突变体 PCR
• LP和RP是植物基因组上T-DNA插入位点两测的引物 LP和RP是植物基因组上 DNA插入位点两测的引物 是植物基因组上T • BP是T-DNA区段上的引物 BP是 DNA区段上的引物
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PCR由变性 退火 延伸三个基本反应步骤构成： 由变性--退火 延伸三个基本反应步骤构成： 由变性 退火--延伸三个基本反应步骤构成
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步骤
• 1.用液氮将100 mg 幼嫩叶片研磨成细粉，置于1.5 ml 离 1.用液氮将100 幼嫩叶片研磨成细粉，置于1.5 用液氮将 心管中加入预热至65℃ 65℃的 CTAB提取液 提取液， 心管中加入预热至65℃的600 μl 的2×CTAB提取液，轻 摇混匀。 摇混匀。 • 2.65℃水浴30 min，其间轻摇混匀。 2.65℃水浴 水浴30 min，其间轻摇混匀。 • 3.向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），室温下 3.向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24： ），室温下 向上清液加入等体积的氯仿 轻轻混匀10 min， rpm离心 离心15 min， 轻轻混匀10 min，12000 rpm离心15 min，再转移上清入 新管。 新管。 • 4.向上清液中2倍无水乙醇或等体积的异丙醇，小心混匀， 4.向上清液中 倍无水乙醇或等体积的异丙醇，小心混匀， 向上清液中2 rpm离心 离心15 min，弃上清。 -20 ℃ 下30 min ，12000 rpm离心15 min，弃上清。 • 5.用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm稍离心，弃上清。 5.用70%乙醇洗涤沉淀一次 乙醇洗涤沉淀一次， rpm稍离心 弃上清。 稍离心， • 6.将沉淀晾干，加20-50 μl TE (pH 8.0)， 65℃水浴30 6.将沉淀晾干 将沉淀晾干， 208.0)， 65℃水浴 水浴30 min溶解DNA。 溶解DNA min溶解DNA。 • 7. 琼脂糖凝胶电泳检测或用紫外分光光度计检测 琼脂糖凝胶电泳检测或用紫外分光光度计检测DNA的浓 度和质量。
模式植物-拟南芥
模式植物-拟南芥拟南芥（Arabidopsis thaliana）是模式植物之一，也是分子生物学和遗传学重要的实验材料。
它属于十字花科（Brassicaceae）植物，原产于欧洲和亚洲中部，是一种小型多年生草本植物，生长期为6个月。
拟南芥是一种快速生长的植物，在开花前只需要6周时间即可从种子生长成成熟植物。
它具有矮小、生长迅速、繁殖能力强、遗传特征简单、基因组小而完整等特点，可作为研究其他植物的模板，也可以作为土壤污染等环境研究的生物示范材料。
拟南芥在1980年代开始被广泛应用于基因组学研究，2000年发布的拟南芥完整基因组序列为基因组学研究提供了有力的支持。
目前，拟南芥的基因库已经非常完整，其中包括大量的突变体和遗传工程材料，可以用于研究不同基因和基因组之间的相互作用和调控机制。
此外，拟南芥可通过遗传和分子技术手段进行快速改良，也被用于育种工作。
拟南芥的生长周期短、遗传特性简单，因此被广泛应用于植物生理学、生态学、分子生物学、遗传学等多个方面的研究。
如拟南芥叶绿体基因组组装和基因组类固醇酮化学转录组分析、氮素吸收相关基因的分析、根系分泌物分析等等。
此外，随着人们对环境污染越来越关注，拟南芥还被广泛应用于环境污染与修复领域，如土壤重金属污染与植物修复等研究。
拟南芥的基因组为自交亲缘关系，可通过自交纯化基因型并选择突变体进行研究。
同时，拟南芥的基因转换技术也非常成熟，使得科学家可以通过基因编辑等技术精细化操纵基因。
这为新生物技术与转基因技术的应用提供了一个良好的平台。
拟南芥的研究逐渐发展为高通量技术、系统生物学和生物信息学结合发展的领域。
随着新兴科技的不断推进，拟南芥因其性质独特，目前已融入多个科学领域。
相信在未来的研究中，拟南芥这一模式植物，将会有更加广泛而深入的应用。
模式植物拟南芥TDNA插入突变体的鉴定
T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。如果T-DNA插入某个功 能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。利用 农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
2012.11.28
4
模式植物拟南芥
拟南芥全部基因组测序已经完成，每个单倍染色体组 （n=5）的总长只有7000万个碱基对（只有小麦染色 体组长的1/80），预测共有29,454个基因。这样科 学家就可以准确定位插入DNA的位置。
DIFF_TM 0.55 LP TCTAGGAAATCGATCGGGTTC
Len 21 TM 60.40 GC 47.62 SELF_ANY_COMPL 0.55
3'_COMPL 0.00 RP GAGAGCATGTAAGGATGCTGG
Len 21 TM 59.85 GC 52.38 SELF_ANY_COMPL 0.55
模式植物拟南芥T-DNA插 入突变体的鉴定
201L2.O11G.2O8
目录
实验设计思路和原理
拟南芥的栽培
拟南芥T-DNA插入突变体 的PCR鉴定
2012.11.28
1
实验设计的思路和原理
经典遗传学是从生物的性状、表型到遗传物质来研
究生命的发生与发展规律。
反向遗传学则是是在获得生物体基因组全部序列的
打开NCBI主页： http://www.ncbi.nl / 打开的页面如下： 在上面的search内查找 基因名称APETALA1：
从上面可以看到一共有19 个结果，其中第一个是拟 南芥中的，点击AP1：
根据上面的信息我们可以
得到基因在拟南芥内的系
统名称：AT1G69120
拟南芥模拟植物实验报告(3篇)
第1篇一、实验背景拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为一种重要的模式植物，在植物遗传学、分子生物学和发育生物学等领域的研究中发挥着举足轻重的作用。
由于其生长周期短、繁殖速度快、基因组相对较小、易于转化和遗传操作等特点，拟南芥成为科学家们研究植物生命现象的理想材料。
本实验旨在通过模拟拟南芥的生长过程，了解其生物学特性，并掌握相关实验技术。
二、实验目的1. 了解拟南芥的生长周期和生物学特性。
2. 掌握拟南芥种子萌发、移栽、生长和观察的基本实验技术。
3. 熟悉拟南芥的遗传转化和基因编辑方法。
三、实验材料1. 拟南芥种子2. 培养基（MS培养基）3. 培养皿、移栽盘、水培箱等容器4. 电转化仪、PCR仪、凝胶成像系统等仪器5. 相关试剂（如DNA提取试剂盒、PCR试剂等）四、实验方法1. 种子萌发（1）将拟南芥种子用70%乙醇消毒2分钟，然后用无菌水冲洗3次。
（2）将消毒后的种子接种到MS培养基上，置于培养箱中，保持适宜的温度和光照条件。
（3）观察种子萌发情况，记录萌发时间和生长状况。
2. 移栽（1）待拟南芥幼苗长到2-3片真叶时，将其移栽到移栽盘中。
（2）在移栽盘中加入适量的营养土，保持土壤湿润。
（3）观察移栽后的生长状况，记录生长时间和生长情况。
3. 生长和观察（1）将移栽后的拟南芥放置于水培箱中，定期更换营养液。
（2）观察拟南芥的生长状况，包括叶片、茎、根的生长速度和形态变化。
（3）记录生长数据，分析生长规律。
4. 遗传转化和基因编辑（1）利用电转化法将目的基因导入拟南芥细胞。
（2）通过PCR和DNA测序验证基因转化成功。
（3）利用CRISPR/Cas9技术对拟南芥基因进行编辑，观察基因编辑效果。
五、实验结果与分析1. 种子萌发实验结果显示，拟南芥种子在消毒后2-3天内开始萌发，5-7天内大部分种子萌发，生长状况良好。
2. 移栽移栽后的拟南芥生长迅速，叶片展开，茎、根生长良好。
3. 生长和观察实验过程中，观察到拟南芥在适宜的生长条件下，生长速度较快，叶片、茎、根的生长状况良好。
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模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定摘要当农杆菌侵染植物细胞时，土壤农杆菌的天然质粒—Ti质粒上T-DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入染色体DNA中。
拟南芥的T-DNA插入变异是反向遗传学进行植物生物学研究的重要手段之一，在获得的Ti质粒转化植物细胞后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型，在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。
本实验以拟南芥植株的特定基因突变体作为实验材料，提取DNA，并通过PCR扩增及SDS-PAGE电泳分离检测鉴定，检测该拟南芥是否为转基因的拟南芥，并判断其是纯合突变还是杂合突变。
本次实验目的在于了解拟南芥T-DNA插入突变体鉴定的原理，掌握DNA提取技术、PCR技术以及电泳鉴定技术，对拟南芥的基因型做出判断。
关键词T-DNA插入突变体拟南芥 PCR 琼脂糖凝胶电泳1.引言1.1遗传研究途径（1）正向遗传学研究杂交或诱变→表型观察→遗传规律→确定存在的基因及数目→基因的功能及作用性质。
（2）反向遗传学研究在已知DNA序列的基础上，通过DNA重组、定点突变、插入/缺失等遗传修饰手段创造突变体并研究突变所造成的表型效应，从而研究基因的生物学功能，阐明生命的本质现象与规律。
拟南芥的T-DNA插入变异是反向遗传学进行植物生物学研究的重要手段之一。
1.2模式生物——拟南芥拟南芥广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物，其原因主要基于该植物具有以下特点：①植株形态个体小，高度只有30cm左右，1个茶杯可种植好几棵；②生长周期快，每代时间短，从播种到收获种子一般只需6周左右；③种子多，每株每代可产生数千粒种子；④形态特征简单，生命力强，用普通培养基就可作人工培养；⑤基因组小，只有5对染色体；⑥拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的缺陷型。
拟南芥全部基因组测序已经完成，每个单倍染色体组（n=5）的总长只有7000万个碱基对（只有小麦染色体组长的1/80），预测共有29,454个基因。
这样科学家就可以准确定位插入DNA的位置。
1.3 Ti质粒和T-DNA插入突变技术Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。
所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。
T-DNA插入基因内部导致基因突变：T-DNA插入到植物染色体上的什么位置，是随机的。
如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。
所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。
T-DNA插入突变技术是反向遗传学的重要手段之一。
T-DNA能稳定地整合到植物基因组中并稳定地表达。
T-DNA在植物中一般都以低拷贝插入，多为单拷贝。
单拷贝T-DNA一旦整合到植物基因组中，就会表现出孟德尔遗传特性，在后代中长期稳定表达，且插入后不再移动，便于保存。
由于插入的T-DNA序列是已知的，因此可以通过已知的外源基因序列，利用反向PCR、TAIL-PCR、质粒挽救等方法对突变基因进行克隆和序列分析，并对比突变的表型研究基因的功能。
还可以利用扩增出的插入位点的侧翼序列，建立侧翼序列数据库，对基因进行更全面的分析。
由此可见，T-DNA插入标签技术已成为发现新基因、鉴定基因功能的一种重要手段。
T-DNA插入突变技术应用：⑴获得转基因植株⑵引起基因失活，产生基因敲除突变体。
1.4植物基因组DNA提取提取植物基因组DNA的原理：液氮研磨植物组织破壁去污剂（CTAB）裂解细胞膜，变性蛋白释放DNA氯仿—异戊醇除去变性蛋白质乙醇或异丙醇沉淀DNA。
CTAB的主要作用是破膜。
CTAB属阳离子表面活性剂，能溶解膜蛋白与脂类，也可解聚核蛋白。
在高离子强度的溶液里，CTAB与蛋白质和大多数酸性多聚糖以外的多聚糖形成复合物，但是不能沉淀核酸。
因此，CTAB可以用于从大量产生粘多糖的有机体如植物以及某些革兰氏阴性菌（包括E.coli的某些株）中制备纯化DNA 。
1.5 PCRPCR技术，即聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction），是一种体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法,故又称为基因的体外扩增法。
参与PCR反应的物质主要为五种：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。
基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3’末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，主要步骤是变性、退火、延伸三步，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。
PCR反应有两个重要特征：一是经PCR扩增后，扩增产物片段大小由两个引物与模板的结合位点决定；二是经过PCR扩增，产物以指数级数增加，可达到目的片段的大量扩增。
本实验中农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。
在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体，所以必须从分离群体中将纯合突变体鉴定出来。
可以通过PCR的方法鉴定出来。
1.51三引物法原理即用三种引物（LP、BP、RP）进行PCR扩增，LP和RP是植物基因组上T-DNA插入位点两测的引物，BP是T-DNA区段上的引物（见图1）。
在野生型植株，目的基因的两条染色体上均为发生T-DNA插入，所以其PCR产物仅有一种，分子量约为900bp，即为LP和RP这对引物扩增出分子量较大的产物（大带）；在杂和突变体，只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA插入，因此LP和RP能扩增出分子量较大的产物（大带），另外BP和RP还能扩增出分子量较小的产物（小带）；在纯合突变体，植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA 插入，而T-DNA本身的长度约为17kb，过长的模板会阻抑目的基因特异扩增产物的形成，所以也只能得到由BP和RP能扩增出分子量较小的产物（小带）。
上述3种情况的电泳结果差异明显，能有效区分不同基因型的植株。
此法的有点事可同时鉴定出纯合突变体并确证T-DNA的插入情况。
1.52 双引物法基本原理与“三引物法”相似，即采用特异引物扩增目的基因片段和T-DNA插入片段，通过比对扩增结果进行突变体的鉴定。
首先以基因组DNA为模版，用一对特意产物（LP和RP）扩增目的基因片段，初步鉴定；然后再以基因组DNA为模版，由T-DNA片段的特异引物（LB）与LP或RP组成一对引物，扩增目的基因T-DNA插入片段，以确证所获得突变体为T-DNA插入目的基因的突变体。
此法的不足之处是完成最终鉴定需要进行两轮PCR扩增。
1.6琼脂糖凝胶电泳DNA含有PO43-基团，在pH8.0Buffer中带负电，在电场中向正极移动。
自由电泳时，由于不同大小的DNA片段的电荷密度大致相同，各核酸分子难以分开；选用适当浓度的琼脂糖凝胶作为支持物，使之具备一定的孔径，即可发挥分子筛效应，使大小不同的核酸片段迁移率出现较大差异，达到分离的目的；DNA经溴乙锭（EB）染色，溴乙锭可以插入DNA 双螺旋结构两个碱基之间，与核酸形成络合物，在紫外（300nm,360nm）激发下，产生桔黄色荧光（590nm可见光）。
这样就可对DNA的分离情况进行直接观察。
2.材料及方法2.1.材料2.1.1器材1.5ml离心管，水浴锅，微量移液器，离心机，PCR仪，微波炉，电泳仪，电泳槽，梳子，三角瓶，微量天平，手套，染色盘，凝胶成像仪。
2.1.2试剂及配制：液氮，2*CTAB提取液，氯仿-异戊醇（24：1），无水乙醇，70%乙醇，TE，PCR反应体系（DNA模板（基因组DNA），引物LP、RP、BP， 10*Taq buffer（MgCl2free），MgCl2，dNTP mixture，ddH2O，Taq酶），琼脂糖凝胶电泳（琼脂糖，1×TAE缓冲液，Loading buffer，DL 2,000 DNA Marker，溴化乙锭）。
2.1.3实验材料：拟南芥特定基因突变体2.1.4溶液配制2*CTAB提取液(PH8.0) 配制2% CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）1.4M Nacl20Mm EDTA(PH8.0)100Mm Tris-cl(PH8.0)0.2%巯基乙醇2.2 方法2.2.1 CTAB法提取拟南芥基因组DNA1.用液氮将100 mg 幼嫩叶片研磨成细粉，置于1.5 ml 离心管中加入预热至65℃的600μl 的2×CTAB提取液，轻摇混匀。
2.65℃水浴30 min，其间轻摇混匀。
3.向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），室温下轻轻混匀10 min，12000 rpm离心15 min，再转移上清入新管。
4.向上清液中2倍无水乙醇或等体积的异丙醇，小心混匀，-20 ℃下30 min ，12000 rpm离心15 min，弃上清。
5.用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm稍离心，弃上清。
6.将沉淀晾干，加20-50 μl TE (pH 8.0)， 65℃水浴30 min溶解DNA。
2.2.2 PCR扩增2.2.2.1引物设计LP和RP是植物基因组上T-DNA插入位点两测的引物，BP是T-DNA区段上的引物。
LP:CAGCGAATTTAGCTTTCGTTGRP：GGGCCTTTTGATTTCTACTGG中间引物BP：ATTTTGCCGATTTCGGAAC用LP+RP产生大带：900bp左右用LBa1+RP产生小带：400bp2.2.2.2反应体系三引物法双引物法本实验采用双引物法，每个样品根据引物不同分加入2个体系，对应2个离心管（RP+BP/RP+LP）2.2.2.3反应条件PCR有变性--退火--延伸三个基本反应步骤，选取适当的PCR条件对提取的DNA进行扩增（扩增条件如下）进行37个循环扩增产物冷却至室温可于4℃保存。
2.2.3琼脂糖凝胶电泳→正确组装制胶槽+制胶板+样品梳；→取40mL1×TAE至250mL干净红盖瓶（或三角瓶）中，称0.8g琼脂糖(配制2%琼脂糖凝胶)，倒入三角瓶混匀，轻旋瓶盖，微波炉加热沸腾3-4次，至澄清无颗粒；→向20ul DNA样品加5 ul 6*Loading Buffer混匀；→将凝胶连同制胶板一同放入电泳槽中，添加1×TAE至高出胶面约1mm；→将上述混合好的DNA样品，按照一定顺序，取18μl DNA样品上样，点样到凝胶中。
→打开电泳仪，调节电压和电泳时间，开起开关开始电泳；→当上样缓冲液中的指示剂快要跑出胶时停止电泳；→取出胶用EB染液染色；→在凝胶成像仪下显像。
3.实验结果3.1 CTAB法提取拟南芥基因组DNA的实验现象1、加入CTAB提取液后，溶液变为绿色澄清溶液，其原理是CTAB提取液裂解细胞膜，变性蛋白，释放DNA，释放色素使溶液呈绿色。