环境微生物技术复习

第一章绪论

环境生物技术的定义：中国生物技术发展中心对环境生物技术概括为：环境生物技术是现代生命科学与环境工程技术相结合而形成的前沿交叉学科。环境生物技术采用现代分子生物学和分子生态学的原理和方法，充分利用各种环境生物的特殊功能，进行生物净化、生物修复、生物转化和生物催化，从污染治理、清洁生产到可再生资源利用，多层面、全方位地解决工业和生活污染、农业和农村面源污染、荒漠化和海水污染等问题。

基本特征（环境生物技术）：见定义

研究内容：环境生物技术的研究内容，国内某些学者从技术难度和理论深度的角度，将其分为三个部分或三个层次：

第一层次为现代环境生物技术，是指以基因工程为主导的近代防治污染生物技术，包括构建降解杀虫剂、除草剂、多环芳烃类化合物等污染物的高效基因工程菌，创造抗污染型转基因植物等。这一层次知识密集，为快速、有效地防治污染开辟了新途径，使解决日益出现的大量环境难题成为可能。

第二和第三层次为传统的环境生物技术。

第二层次是以废物的生物处理为主要内容，包括在新的理论和技术支撑下开发出的一系列废物强化处理工艺。这是目前广泛使用的治理污染的生物技术。仍在不断强化和改进，已为控制现时的环境质量起到了极其重要的作用。

第三层次主要包括氧化塘、人工湿地和农业生态工程等，其特点是最大限度地发挥自然界的生物环境功能，投资运行费用少，易于操作管理。

发展趋势：１.降解污染物的工程菌和抗污染型转基因植物的相关研究；２.金属去除；3.植物补救；４.固体废物处理；５.石油生物污染生物补救；６.废水生物处理；７.氯化有机物生物降解；８.Ｎ、Ｐ代谢去除；９.CO２、SOＸ、NOＸ固定化生物去除；10.生物监测；11.清洁生产、清洁能源；12.再生能源；13.厌氧条件下化合物降解。

第二章环境微生物分离筛选技术

富集培养原则（环境微生物）：

(1)控制培养基的营养成分——在分离该类菌株之前，可在增殖培养基中人为加入相应的底物作惟一碳源或氮源。那些能分解利用的菌株因得到充足的营养而迅速繁殖，其他微生物则由于不能分解这些物质，生长受到抑制。

(2)控制培养条件——筛选某些微生物时，除通过培养基营养成分的选择外，还可通过它们对pH、温度及通气量等其他一些条件的特殊要求加以控制培养，达到有效的分离目的。(3)抑制不需要的菌类——在分离筛选的过程中，除了通过控制营养和培养条件，增加富集微生物的数量以有利于分离外，还可通过高温、高压、加入抗生素等方法减少非目的微生物的数量，使目的微生物的比例增加，同样能够达到富集的目的。

(4)DGGE探测——利用变性梯度凝胶电泳技术首先对待富集的环境样品进行检测，判定样品中究竟有哪些微生物种类，进而选择和改进培养方法，富集目的菌株。

分离原则：

纯培养：微生物学中把从一个细胞或一群相同的细胞经过培养繁殖而得到的后代,称纯培养获得纯培养方法：（1）液体稀释法（2）平板划线分离法（Streak Plate）（3）平板涂布分离法（Spread Plate）（4）选择性培养分离法（5）单细胞（单孢子）分离法。

有机污染物降解菌的基本培养方法：

1 .水溶性有机污染物——梯度压力法，苯胺、DDT、甲基对硫磷、环己烷。不断加大污染物浓度，增强培养体系的选择压力。

2.具挥发性高毒有机污染物——气相法，氯苯、甲苯等。A、在培养皿中放入蘸有有毒物质

的滤纸；B、把盛有有毒物质的容器放入干燥器内；C、补充含有有毒物质的气流。——以有毒物质的蒸汽作为微生物生长的碳源或氮源。

3 .疏水性有机污染物——乳化法、惰性吸附法，PCBs、联苯、多环芳烃等。A、通过分散作用或使用惰性亲水载体增加界面，如使用不能被微生物生长利用的惰性分散剂。B、利用超声波或高速搅拌机产生稳定的乳浊液。C、将疏水性物质溶解在溶剂中，与多孔性材料（如硅藻土）混合后，蒸发掉溶剂，将吸附有疏水性污染物的多孔性材料投加到液体培养基中。

4.作为共代谢基质的污染物——类似物富集法， DDT、3，4-二氯苯胺等。利用类似物与目标污染物具有相同的碳骨架，但不会阻断生物降解和对基质的利用原理，对降解菌进行富集和分离。

环境中未培养微生物不可培养的原因：

1.采用高浓度的营养基质——产生微生物自身难以调节的过氧化物、超氧化物和羟基自由基等“毒性氧物质（Reactive oxygenspecies）；

2.实验室中无法完全模拟自然界的环境条件——将微生物置于恒温、恒湿、黑暗等环境中，将微生物限制在“板结”的琼脂或不扰动的液体介质中；

3.环境微生物之间的相互关系被忽略——纯培养技术将待培养的微生物与其它微生物群体、以及生存环境人为地分离开，种间的共生关系和信息交流被阻断，微生物缺乏必需的生长因子和信号分子而死亡，表现出微生物的不可培养性；

4.生长缓慢的微生物被忽视——环境中很多微生物都聚集生长，当将这些微生物接种至培养基时，适合生长的微生物由于生长快而占据优势地位，它们对营养成分的大量摄取使生长缓慢的微生物得不到充足营养而生长受到抑制。此外，对微生物生长状况进行判断的常规标准存在的缺陷，也导致某些微生物生长不被发觉，表现为“不可培养”。

第三章典型有机污染物生物降解转化原理与途径

有机污染物代谢的基本过程：1.向基质接近；2.吸附在固体基质上；3.分泌胞外酶；4.可渗透物质的吸收；5. 胞内代谢。

生物氧化与化学氧化的异同：

1.生物氧化与化学氧化的相同点：⑴. 都需要O2，放出CO2和H2O；⑵.放出的总能量相同；

⑶.反应的实质是电子或H+的转移。

2.生物氧化与化学氧化的不同点：⑴.反应的条件不同，化学氧化一般在高温和干燥的环境中进行，生物氧化则在常温（一般为30~37℃）的水溶液中进行；⑵.反应的速度不同，化学氧化一般是高速进行的，而生物氧化则是缓慢的匀速进行的。

共代谢原理：

共代谢(cometabolism)又称协同作用，是指利用一种容易降解的物质作为支持微生物生长繁殖的营养物质，微生物同时又降解另一种物质，而被降解和转化的物质并不能使共代谢的微生物获得能量、碳源或其他的任何营养。

共代谢产物在培养液中能够积累，在自然界中却不一定积累。共代谢产物在第二个菌株的作用下继续共代谢或完全矿化。

混合菌株能使基质完全矿化，实际上是互补分解代谢，使得基质完全降解。

菌株互补分解代谢途径的出现，在通常情况下，一种有机污染物可以被微生物转化为另一种有机物，但它们却不能被微生物所利用，常有以下几个方面的原因。

(1) 缺少进行反应的酶

微生物第一个酶或酶系可以将基质转化为产物，但该产物不能被这个微生物的其他酶系进一步转化,故代谢中间产物不能供生物合成和能量代谢用。

(2) 中间产物的抑制作用

最初基质的转化产物抑制了在以后起矿化作用酶系的活性或抑制该微生物的生长。(3) 某些特殊其它基质的缺乏

链烃生物氧化方式：

链烃的最初降解作用有四种氧化方式

(1)单末端氧化 (终端基氧化)

在加氧酶的作用下，氧化作用需要分子氧存在，氧直接结合到碳链末端的碳上，形成对应的伯醇，伯醇进一步氧化成为对应的醛和脂肪酸，脂肪酸按β-氧化方式氧化分解，形成乙酰 CoA 后进入中央代谢途径，每次氧化有两个碳被氧化,对于长链脂肪烃,上述过程重复进行，直至烃类彻底氧化。

(2)双末端氧化 ( diterminal 氧化 )

烷烃氧化可以在两端同时发生，这种氧化的产物为二羧酸。

(3)次末端氧化 (次终端基氧化)

有的微生物能氧化烷烃末端的第二个碳，即次末端氧化形成仲醇，再依次氧化成酮和酯，酯被水解为伯醇和乙酸，然后进一步分解。

(4)直接脱氢

在厌氧条件下脂肪烷烃可以直接脱氢，以 NO3-作为受氢体，由烷烃变为烯烃，进一步转变为仲醇, 酮和酸。

单环芳烃的好氧降解途径：

在苯环上引入两个羟基后形成一种顺式二氢二羟化合物，然后脱氢形成儿茶酚,儿茶酚可以两种方式裂解，一种是在两个羟基之间裂解，称为正位裂解 (ortho-劈开) ，形成顺，顺-粘康酸；另一种是在羟基化碳原子与非羟基化碳原子之间裂解，称为偏位裂解 (meta-劈开) ，形成 2-羟基粘康酸半醛。

正位裂解是由双加氧酶催化，有分子氧掺入，形成的粘康酸在环化异构酶的作用下形成粘康内酯，再进一步异构为烯醇化内酯,内酯在水解酶作用下形成 3- 氧己二酸。在 CoA 转移酶作用下， 3 -氧己二酸被激活分裂为琥珀酸和乙酰CoA 。

偏位裂解也是在双加氧酶催化下进行的，形成的 2- 羟基粘康酸半醛有两条降解路线：

一条是在脱氢酶的催化下氧化为 2-羟基粘康酸，然后再脱羧形成 2-羟基-2 ,4-戊二烯酸；另一条是在水解酶作用下去除甲酸直接形成 2-羟基-2,4-戊二烯酸, 2-羟基-2,4-戊二烯酸在水合酶作用下加水形成 4-羟基-2-氧戊酸，再在醛缩酶作用下形成丙酮酸和乙醛。

多环芳烃的好氧微生物代谢途径：

萘是最简单的表示多环芳烃,降解由双加氧酶催化生成顺-萘二氢二醇，然后脱氢形成 1,2-二羟基萘；再环氧化裂解，接着去除侧链，形成水杨酸；水杨酸进一步转化成儿茶酚或龙胆酸后开环。

卤代脂肪烃的降解途径

四氯乙烯在产甲烷条件下还原性脱卤，经过四个步骤产生乙烯，降解的中间产物为三氯乙烯、顺/反-二氯乙烯和氯乙烯。

第四章环境分子微生物技术

基因(gene)的概念：

基因是有遗传效应的DNA片断，是决定生物性状的基本单位。

基因的功能：基因能够储存、传递和表达遗传信息，也都可能发生突变，从而决定生物体的性状。

基因生物性状：通过转录、翻译，控制合成具有一定氨基酸顺序的蛋白质，从而控制生物的性状。

原核细胞基因和真核细胞基因的异同

DNA提取的基本步骤：

1）核酸的释放：破裂细胞→释放核酸

2）核酸的分离与纯化：

将含有核酸分子复杂复合物中，把核酸与其他物质分离。

非核酸的大分子污染物：蛋白质、多糖和脂类分子、非需要的核酸分子、试剂和溶液。

3）核酸的浓缩、沉淀与洗涤：加入一定的盐类（醋酸钠、氯化钠等）后，使用有机溶剂（如乙醇、异丙醇等）沉淀可去除部分杂质与某些盐离子，少数盐类可使用70-75%的乙醇洗涤。4）DNA鉴定：浓度鉴定，纯度鉴定，完整性鉴定

5）核酸的贮存—DNA保存：

A、短期贮存：4℃或-20℃存放于TE（tris 和 EDTA ）缓冲液中。TE缓冲液的PH与DNA 贮存有关，PH为8时，可减少DNA脱氨反应，PH低于7.0时DNA容易变性。

B、长期贮存：TE缓冲液中-70℃保存数年；在DNA溶液中加一滴氯仿可有效防止细菌和核酸的污染。

DNA的沉淀：

1）无水乙醇沉淀

沉淀前往往加入NaCl等盐离子，作用是中和核酸分子表面的负电荷，有助于分子之间的聚集。无水乙醇可以吸收分子之间的水，使DNA沉淀析出，无水乙醇使用前冰冻，可以减少DNA沉淀析出过程释放热量对DNA的损伤。

2）异丙醇沉淀

除了使DNA沉淀外，还可以溶解少量的小的RNA分子

质粒(plasmid)：是细菌内独立于染色体并能自我复制的小环状DNA分子，其大小范围从lkb至200kb以上不等。

细菌的裂解和质粒DNA的提取：碱裂解法——1.在NaOH存在的强碱性（pH12.0～12.6）条件下，用SDS破坏细胞壁和裂解细胞，并使细胞的蛋白质与DNA发生变性，释放出质粒DNA；

2.细胞被裂解后，细胞壁、膜的碎片、变性的蛋白质和染色体DNA形成大的复合物，在pHl2.0-12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环(CC)质粒DNA 仍为自然状态；

3.将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构。大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而CC质粒DNA仍然为可溶状态。

4.通过离心，可去除大部分细胞碎片染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用酚、氯仿抽提进一步纯化质粒DNA。

重组DNA操作一般步骤：（1）获得目的基因；（2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；（3）用重组DNA分子转化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；（4）对转化子筛选和鉴定；（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。

获得需要的目的基因常用的方法：（1）利用聚合酶链式反应（PCR）特异性地扩增所需要的目的基因片段，等等；（2）直接从生物体中提取总DNA，构建基因组DNA文库(genomic DNA library)，从中调用目的基因；（3）以mRNA为模板，反转录合成互补的DNA片段，建立cDNA 文库；（4）化学合成。

基因工程在环保方面的应用：⑴用于环境监测。基因工程做成的DNA探针能够十分灵敏地检测环境中的病毒、细菌等污染。⑵用于被污染环境的净化。基因工程做成的“超级细菌”能吞食和分解多种污染环境的物质。科学家还培育出能吞食转化汞、镉等重金属，分解DDT 等毒害物质的细菌。利用基因工程培育的“指示生物”能十分灵敏地反映环境污染的情况，却不易因环境污染而大量死亡，甚至还可以吸收和转化污染物。

PCR技术的基本原理： PCR技术就是在体外中通过酶促反应有选择地大量扩增（包括分离）一段目的基因的技术。

PCR技术的原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性—退火—延伸3个基本反应步骤构成。

变性：双链DNA解链成为单链DNA

退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合

延伸：以目的基因为模板，合成互补的新DNA链

第五章活性污泥法处理废水

活性污泥──活性污泥是一种绒絮状小泥粒，它是由需氧菌为主体的微型生物群，以及有机性和无机性胶体、悬浮物等组成的一种肉眼可见的细粒。它具有很强的吸咐与分解有机质的能力。

生物相──活性污泥是由多种多样好氧微生物和兼性厌氧微生物（可能有厌氧微生物）与污（废）水中有机的和无机的固体物混凝交织在一起，形成的絮状体或称绒粒，它均匀分布在曝气池中。

活性污泥菌胶团的形成主要有以下三种假说：

1、荚膜学说：认为活性污泥中微生物处于内源呼吸期或减速增殖期后段时，运动性能微弱、动能很低，不能与范德华力相抗衡，并且在布朗运动作用下，菌体互相碰撞、结合。大多数细菌体外有荚膜样物质，当细菌进入老龄后细胞外多糖类聚合物分泌增加，同荚膜一样都能使细菌凝聚在一起，形成菌胶团。

2、PHB学说：认为动胶菌产生的聚β-羟丁酸颗粒（PHB）是一种聚酯类物质，当它们积累时，细菌细胞的分裂就不彻底，它们彼此粘连结合时，细胞便由小凝快形成了大的絮凝体。

3、胞外聚合物学说：认为活性污泥中的一些细菌能产生直径很小的细长纤维类聚合物，这些细纤维由于以多糖为主，并含有少量的蛋白质和核酸，化学性质与纤维类似。絮凝体的形成是由于这些相互间细纤维的不规则缠绕而结合在一起，同时，它们还可能利用粘性纤维将那些不分泌胞外聚合物的细菌及其他颗粒碎片通过搭桥作用粘连在一起，从而使细胞失去原来的胶体稳定性，紧密地聚合成大块的絮凝体。在细菌密度较小的情况下，能够积聚胞外聚合物的细菌通过增加聚合物纤维的方式增大菌体表面积，细菌间相互碰撞的概率增大，加速絮凝速度。

还有人认为： Ca2+、Mg2+等二价金属离子也可能通过金属键促成菌胶团的形成。

厌氧微生物群体间的关系：

(1) 产酸菌为产甲烷菌提供生长和产甲烷所需要的基质：产酸菌把各种复杂的有机物质进行降解，通过其生命活动，为产甲烷菌提供了合成细胞物质和产甲烷所需的碳前体和电子供体、氢供体和氮源。产甲烷菌充当厌氧环境有机物分解中微生物食物链的最后一个生物体。

(2) 产酸菌为产甲烷菌创造诗意的厌氧还原条件：厌氧发酵初期，由于加料会使空气进入发酵池，原料、水本身也携带有一定量的氧或氧化还原剂，这对于产甲烷菌是有害的。它的去除需要依赖产酸菌中需氧和兼性厌氧微生物的活动。产酸菌中通常约有1%的兼性厌氧菌存在于厌氧环境中，这些兼性厌氧菌能够起到保护产甲烷菌这样的专性厌氧菌免受氧的损害与抑制。各种厌氧微生物对氧化还原电位的适应也不相同，通过它们有顺序地交替生长和代谢活动，使发酵液氧化还原电位不断下降，使反应期内的环境逐步形成适合于产甲烷菌的绝对厌氧环境。

(3) 产酸菌为产甲烷菌清除有毒物质：在工业废水中常常含有对产甲烷菌有毒害作用的物质。产酸菌能裂解苯环，降解氰化物等，从中获得能源和碳源。这些作用不仅解除了对甲烷菌的毒害，而且给它提供养分。另外，产酸菌的产物硫化氢，可与重金属离子作用生成不溶性的金属硫化物沉淀，从而解除一些重金属的毒害作用。

(4) 产甲烷菌为产酸菌的生化反应解除反馈抑制：产酸菌的发酵产物对其本身的不断形成产生反馈抑制。在正常的厌氧发酵中，产甲烷菌连续利用由产酸菌产生的氢、二氧化碳、乙酸等，使厌氧系统中不致有氢和酸的积累，就不会产生反馈抑制，使产酸菌的生长和代谢能够正常进行。

(5) 产酸菌和产甲烷菌共同为耻环境中适宜的pH值：在厌氧发酵初期，产酸菌首先降解原料中的糖类、淀粉等有机物，生成大量的有机酸、产生的二氧化碳也部分溶于水，使发酵液的pH值明显下降。同时，产酸菌类群中的氨化细菌能够分界蛋白质产生氨，中和部分酸；产甲烷菌利用乙酸、甲酸、氧和二氧化碳形成甲烷，消耗算和二氧化碳。两个类群的共同作用使pH值稳定在一个适宜范围内。

第七章脱氮除磷

氮的危害：

1.刺激地表水中植物和藻类的过渡生长

2.通过硝化作用引起水体缺氧

3.氨对水生生物产生毒害

4.硝酸盐影响人类健康，诱发蓝儿症和胃癌

生物脱氮原理：

A氨化作用

氨化作用是指含氮有机物经微生物降解释放的过程。这里的含氮有机物一般指动植物和微生物残体及它们的排泄物、代谢物中所含的有机氮化合物。

①蛋白质的分解

蛋白质的氨化过程是指在微生物产生的蛋白酶作用下进行水解，生成多肽与二肽，然后由肽酶进一步水解生成氨基酸：

氨基酸在氨化菌的作用下，有机氮化合物分解、转化为氨态氮，其反应式为：

RCHNH2COOH十O2→RCOOH+CO2＋NH3

②核酸的分解

③其他含氮有机物的分解

除了蛋白质、核酸外，还有尿素、尿酸、几丁质、卵磷脂等含氮有机物，它们都能被相应的微生物分解释放出氨。

B硝化作用

C反硝化作用

磷的危害：磷是造成水体富营养化的重要因子。受磷污染的水体，藻类大量繁殖，藻体死亡后分解会使水体产生霉味和臭味；许多种类还会产生毒素，进而通过食物链影响人类的健康。生物除磷原理：

污水生物除磷的本质是通过聚磷菌过量地、超出其生理需要地摄取废水中的磷，以聚磷酸盐的形式积累于胞内，形成高磷污泥，作为剩余污泥排出，从而达到从废水中除磷的效果。(一)聚磷菌的磷过量摄取

在好氧条件下聚磷菌为有氧呼吸，不断地从外部摄取有机物，加以氧化分解，并产生能量，能量为ADP所获得，并结合H3PO4合成ATP(三磷酸腺苷)，即：

ADP+H3PO4十能→ATP十H2O

(二)聚磷菌的放磷

在厌氧条件下，聚磷菌体内的ATP进行水解，放出H3PO4和能量，形成ADP，即：

ATP十H2O→ADP十H3PO4＋能

在好氧条件下，聚磷菌过量地摄取磷，在厌氧条件下，又释放磷。生物除磷技术就是利用聚磷菌的这一功能而开创的。

第八章有机固体废物微生物处理技术

堆肥与堆肥化的概念和区别：

堆肥化（composting）是指在控制条件下，依靠自然界广泛分布的细菌、放线菌、真菌等微生物，人为的促进可生物降解的有机物向稳定的腐殖质生化转化的过程叫堆肥化。

堆肥化的产物称作堆肥（compost）。使用堆肥后，能够增加土壤中稳定的腐殖质，形成土壤的团粒结构，并具有改良土壤结构、增大土壤溶水性、减少无机氮流失、促进难溶磷转化、增加土壤缓冲能力、提高生物肥料的肥效等多种功效的廉价、优质土壤改良肥料。废物经过堆制，体积一般只有原体积的50～70%。

堆肥化过程：

有机固体废物好氧堆肥过程，依据温度变化，大致可分成三个阶段，而且每一阶段都有其独特的微生物种类。

(1) 中温阶段（亦称产热阶段）

堆肥初期，堆层基本呈中温（15～45℃），嗜温性微生物较为活跃，它可利用堆肥中可溶性有机物质（糖类、淀粉等）旺盛繁殖。它们在转换和利用化学能的过程中，有一部分变成热能。因堆料有良好的保温作用，堆料温度不断上升。适合于中温阶段的微生物种类极多，以中温、需氧型为主，通常是一些无芽孢细菌，其中最主要是细菌、真菌和放线菌。

(2) 高温阶段

当堆料温度上升到45℃以上时，即进入高温阶段。在这个阶段，嗜温性微生物受到抑制甚至死亡，嗜热性微生物逐渐代替了嗜温性微生物的活动，堆肥中残留的和新形成的可溶性有机物质（糖类、淀粉等）被继续分解转化，复杂的有机化合物如半纤维素、纤维素和蛋白质等开始被强烈分解。通常在50℃左右进行活动的微生物主要是嗜热性真菌和放线菌；温度上升到60℃时，真菌几乎完全停止活动，仅有嗜热性放线菌与细菌在活动；温度升到70℃以上时，对大多数嗜热性微生物已不适宜，微生物大量死亡或进入休眠状态。

在高温阶段，嗜热性微生物按其活性，又可分为三个时期：对数增长期、减速增长期、内源呼吸期。

(3) 降温阶段（腐熟阶段）

在内源呼吸后期，只剩下部分较难分解及难分解的有机物和新形成的腐殖质，此时微生物活性下降，发热量减少，温度下降。在此阶段嗜温微生物再占优势，使残留难溶解的有机物进一步分解，腐殖质不断增多且趋于稳定化。此时，堆肥进入腐熟阶段。

第九章有机废气生物处理技术

有机废气的三种生物处理方法：

(1) 生物洗涤法：利用由微生物、营养物和水组成的微生物吸收液处理废气，适合于吸收可溶性气态物。吸收了废气的微生物混合液再进行好氧处理法，去除液体中吸收的污染物，经处理后的吸收液再重复使用。在生物洗涤法中，微生物及其营养物配料存在于液体中，气体中的污染物通过与悬浮液接触后转移到液体中，从而被微生物所降解，其典型的形式有喷淋塔和鼓泡塔等生物洗涤器。

(2) 生物过滤法：其基本原理是，过滤器中的多孔填料表面覆盖有生物膜，废气流经填料床时，通过扩散过程，把污染成分传递到生物膜，并与膜内的微生物相接触而发生生物化学反应，从而使废气中的污染物得到降解。较典型的有生物滤池和生物滴滤池两种形式。 (3) 生物滴滤池：与生物滤池的区别：①使用的填料不同，不具吸附性，空隙大；②回流水由滴滤池上部喷淋到填料床层上，并沿填料上的生物膜滴流而下。

第十章污染场地的生物修复技术

1.生物修复的概念与生物修复技术

i. 生物修复(bioremediation)

是指利用生物的生命代谢活动减少存在于环境中有毒有害物质的浓度或使其完全无害化，从而使污染环境能够部分或完全恢复到原来状态的过程。分为原位生物修复(in-situ bioremediation)和异位生物修复(ex-situ bioremediation)以及联合生物修复（combined remediation）。

原位生物修复是指在基本不破坏土壤和地下水自然环境的条件下，对受污染的环境不作搬运或输送，而在原场所进行生物修复。

ii. 原位生物修复

(1) 现场调查和可行性分析

①现场调查

查明污染源的位置和污染的深度、污染地区污染物的种类、要处理的污染物的数量以及采用合理的修复技术进行修复所需的费用和时间等。现场调查如地下水应当充分考虑含水层的一些重要的地理特性，它们包括含水层物质的组成和异同点、特殊物质和其它含水层的水力联系、地下水水位的升降情况、地下水的流动速率和方向、水力传导、渗透性、总体密度和空隙率等等。

②可行性分析

可处理性研究的具体目的有以下几点：评价整个过程的可行性；任何生物修复项目的第一步都是评价污染物生物降解的可能性，并确定进行降解的代谢系统。确立处理可以达到的浓度；确定处理过程设计的标准；估算处理过程的设备和运行费用；决定控制参数和最优化实施的限制条件；评价物料供应处理技术和设备；证实现场运行情况和污染物的最终转归；评价处理运行中的问题；提供在现场净化中连续优化运行的方法。

第二步利用这些评价所提供的信息来预测可能达到的处理水平。如果处理水平令人满意，接着研究设计标准。

(2) 设计和实施生物修复工艺及工艺评价

如果通过小试和中试都表明生物修复技术在技术上和经济上是可行的，就可以开始生物修复项目的具体设计，包括处理设备、井位、井深、营养物和氧源(或其他受体)等。设计完毕后，按照要求进行污染物的生物原位修复。

(3) 原位生物修复微生物及制剂

①土著微生物

②外来微生物

③基因工程菌

④原位生物修复酶制剂

⑤原位生物表面活性剂

(4) 原位生物修复技术的影响因素

①营养物质

②电子受体

③共代谢机制

④污染物与污染环境的物化性质

⑤其他环境因素：土壤（地下水）酸碱度、湿度、温度、孔隙率等。

课堂内容总结

考点1环境微生物的富集培养原则

考点2、有机污染物降解菌的基本培养方法

会设计实验方案：富集——筛选——检测微生物降解能力（显色法、透明圈法、分析污染物残留量）

考点3微生物不可培养的原因

考点4、生物氧化的特点

1. 生物氧化是在生物细胞内进行的酶促氧化过程，反应条件温和（水溶液，中性pH和常温）。

2. 氧化进行过程中，必然伴随生物还原反应的发生。

3. 水是许多生物氧化反应的氧供体。通过加水脱氢作用直接参予了氧化反应。

4. 在生物氧化中，碳的氧化和氢的氧化是非同步进行的。氧化过程中脱下来的氢质子和电子，通常由各种载体，如NADH等传递到氧并生成水。

5. 生物氧化是一个分步进行的过程。每一步都由特殊的酶催化，每一步反应的产物都可以分离出来。这种逐步进行的反应模式有利于在温和的条件下释放能量，提高能量利用率。

6. 生物氧化释放的能量，通过与ATP合成相偶联，转换成生物体能够直接利用的生物能ATP。考点5、电子传递链的概念

课件：概念及位置

呼吸链又叫电子传递体系或电子传递链，它是代谢物上的氢原子被脱氢酶激活脱落后，经过一系列的传递体，最后传递给被激活的氧原子，而生成水的全部体系。在真核生物细胞内，它位于线粒体内膜上，原核生物中，它位于细胞膜上。

课本：电子传递系统又称呼吸链，是指一系列氧化还原电势不同的氢传递体（或电子传递体）组成的链状传递系统，它能把氢或电子从低氧化还原电位的化合物传递给的分子氧或其他无机和有机氧化物。

考点6、正位裂解、偏位裂解

考点7、共代谢原理

考点8、萘的细菌生物降解（耗氧）

考点9、四氯乙烯厌氧脱氯

考点10、提取DNA的总则

1) 保证核酸一级结构的完整性；

2) 其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降低到最低程度；

3) 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；

4) 其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。

考点11、重组DNA

1、获得目的基因；（2）与克隆载体连接，形成新的重组DNA分子；（3）用重组DNA分子转

化受体细胞，并能在受体细胞中复制和遗传；（4）对转化子筛选和鉴定；（5）对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。

载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具

（1）能够自我复制，并带动插入的外源基因一起复制（2）具有合适的限制性酶切位点（3）具有合适的筛选标记（4）细胞内拷贝数要多（5）载体的分子量要小（6）细胞内稳定性高

将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤：

1．获得目的基因和质粒载体；

2．形成重组质粒；

3．制备感受态细胞，用重组质粒转化大肠杆菌细胞；

4．培养大肠杆菌，让重组质粒及外源目的基因形成大量拷贝；

5．筛选含重组质粒的大肠杆菌细胞，进行检查或鉴定。

考点12、活性污泥的定义(必考)

活性污泥──活性污泥是一种绒絮状小泥粒，它是由需氧菌为主体的微型生物群，以及有机性和无机性胶体、悬浮物等组成的一种肉眼可见的细粒。它具有很强的吸咐与分解有机质的能力。

考点13、污泥沉降比（SV）

污泥沉降比是指将曝气池流出来的混合液在量筒中静置30min，其沉淀污泥与原混合液的体积比，以%表示。正常的活性污泥经30min静沉，可以接近它的标准密度。

该指标能够相对地反映污泥浓度和污泥的凝聚、沉降性能，用以控制污泥的排放量和早期膨胀。本指标测定方法简单易行，处理城市污水活性污泥的沉降比介于20%~30%之间。

考点14、厌氧微生物群体间的关系

考点15、生物修复

生物修复(bioremediation)：

是指利用生物的生命代谢活动减少存在于环境中有毒有害物质的浓度或使其完全无害化，从而使污染环境能够部分或完全恢复到原来状态的过程。

原位生物修复是指在基本不破坏土壤和地下水自然环境的条件下，对受污染的环境不作搬运或输送，而在原场所进行生物修复。

异位生物修复是移动污染物到邻近地点或反应器内进行，进行集中修复。

考点16、采样的注意事项

1、采样时应尽可能保持相对无菌；

2、所采集的样本必须具有某种代表性；

3、采好的样必须完整地标上样本的种类及采集日期、地点以及采集地点的地理、生态参数等；

4、应充分考虑采样的季节性和时间因素，因为真正的原地菌群的出现可能是短暂的；

5、采好的样应及时处理，暂不能处理的也应贮存于4℃下，但贮存时间不宜过长。这是因为一旦采样结束，试样中的微生物群体就脱离了原来的生态环境，其内部生态环境就会发生变化，微生物群体之间就会出现消长。

考点17、琼脂凝胶电泳的原理及其应用

琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。其分析原理与其他支持物电泳的最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。

琼脂糖凝胶具有网络结构，物质分子通过时会受到阻力，大分子物质在涌动时受到的阻力大，因此在凝胶电泳中，带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。但由于其孔径相当大，对大多数蛋白质来说其分子筛

效应微不足道，现广泛应用于核酸的研究中。

蛋白质和核酸会根据pH不同带有不同电荷，在电场中受力大小不同，因此跑的速度不同，根据这个原理可将其分开。电泳缓冲液的pH在6~9之间，离子强度0.02~0.05为最适。常用1%的琼脂糖作为电泳支持物。琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广。普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。

DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速率向正极方向移动。

应用：

检验DNA完整性，纯化DNA片段，分离DNA片段

考点18、基因工程菌构建的原理和一般步骤

基因工程是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。

基因工程的主要过程包括：目的基因的获得；载体的选择与准备；目的基因与载体连接成充足DNA；重组体的筛选。

基因组DNA的提取

为什么用无水乙醇沉淀DNA？

这是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶，乙醇与核酸不会起任何化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。

DNA溶液是DNA以水合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般实验中，是加2倍体积的无水乙醇与DNA相混合，其乙醇的最终含量占67％左右。

染色时为什么在50℃左右加入EB：

将电泳后的胶板小心推进含溴化乙锭【EB，50℃左右，温度太高了对EB不好，太低了，胶就开始凝了，EB可能摇不匀】（0.5μg/mL）的染色液中，室温下浸泡约30min。