TRPC3在61例重症肌无力伴胸腺增生患者肌肉的表达及意义

TRPC3在61例重症肌无力伴胸腺增生患者肌肉的表达及意义

发表时间：2016-10-27T14:22:33.807Z 来源：《中国医院药学杂志》2016年8月作者：姚世源程超

[导读] 电视胸腔镜胸腺扩大切除术对于治疗重症肌无力伴随胸腺增生的患者具有较好的疗效。

中山大学附属第一医院胸外科广东广州510080 摘要：目的:分析我院61例行电视胸腔镜胸腺扩大切除术的重症肌无力患者的膈肌的TRPC3表达情况和临床预后，探讨TRPC3作为作为MG临床诊断及治疗预后指标的可能性。方法：本研究选取了2011.02.28-2014.12.01期间于本院就诊的重症肌无力患者61例手术治疗资料进行研究分析，该61名患者入住本院之后均确诊患有重症肌无力疾病，CT确认为胸腺增生，术前接受正规内科治疗疗效不佳后转入我科行电视胸腔镜胸腺扩大切除术，追踪记录了所有患者的治疗效果和结果，并对患者的年

龄、性别、病理类型和重症肌无力的严重程度等因素进行分析。术中均行胸腔镜下取膈肌活检。结果：顺利行胸腔镜下手术为59例，中转开胸2例；围手术期因危象发作5例；随访期内（12-52个月）病症完全得到缓解的患者共有18例；病症部分改善的患者共有2例；治疗后完全无改善或继续恶化的患者共有17例。其中有43例患者TRCP3蛋白表达下降，18例表达不变或升高。TRPC3表达下降与患者年龄、性别、激素治疗和胆碱酯酶抑制剂治疗无关，与病程及术前的疾病危重程度有关，但是与术后的病情改善无关。结论：电视胸腔镜胸腺扩大切除术对于治疗重症肌无力伴随胸腺增生的患者具有较好的疗效，TRCP3的表达与病情的严重程度相关，将其作为治疗靶点联合激素和胆碱酯酶抑制剂可能取得更好疗效。

关键词：电视胸腔镜胸腺扩大切除术；重症肌无力；胸腺摘除；TRCP3

【中图分类号】R4【文献标识码】A【文章编号】1001-5213(2016)08-0366-02

重症肌无力（myasthenia gravis, MG）被认为是一种自身抗体介导的自身免疫性疾病，主要由于神经肌肉接头（neuromuscular junction，NMJ）功能受损引起的一系列疲乏和肌肉无力症状1。抗原抗体反应激活补体系统形成的膜攻击复合物（membrane attack complex，MAC）对 NMJ 突触后膜的损害导致 AChR 受体和群集（clusters）数量的减少是 MG 的主要病理生理特征2。目前认为在 MG 疾病早期多表现为眼肌受累称为眼肌型 MG,随着疾病进展而全身多处肌肉受累称为全身型 MG。免疫功能异常为其发病机制之一，且对于全身型的MG患者可以从切除胸腺这一免疫器官中获益3。因此目前研究仍集中在患者的免疫和异常血清抗体谱，较少涉及受累肌肉本身的病变。然而临床工作中仍经常碰到肌无力危象发作的患者，其四肢肌力正常，但伴随呼吸肌麻痹。因此循环免疫性性抗体来说难以解释受累肌肉选择性。对于肌肉组织来说，兴奋偶联收缩异常仍是肌无力的原因。瞬时电位受体通道3型（transient receptor potential canonical type-3 ，TRPC3)与RyR1相互作用，共同控制兴奋偶联收缩时肌质网内（SR）的Ca2+释放。有报道称MG合并胸腺瘤患者中血清中存在TRPC3的抗体，且其阳性情况主要和患者的MGFA分级相关。4本研究通过分析61例行胸腔镜手术的MG伴随胸腺增生的患者的膈肌中TRPC3的表达情况，结合患者的临床资料分析其表达情况及可能意义。

1 、材料和方法

1.1、病人资料

本次试验选取了2011.02.28-2014.12.01期间于本院就诊的重症肌无力患者61例手术治疗资料进行研究分析，所选取患者均在本院接受了电视胸腔镜胸腺扩大切除术。患者中共有男性22例，女性39例；年龄11-69岁；患者患病历程在6个月到7年之间，平均病程在19个月。手术前，所有患者均进行了神经内科诊断及治疗。53例患者口服胆碱酯酶抑制剂（溴吡斯的明）；25例口服类固醇制剂（甲泼尼龙），其中2例患者在术前进行了2次血浆置换，2例行丙种球蛋白冲击治疗。术前对患者行Osserman分型：I型为单纯眼肌型，IIa为轻度全身型，IIb为中度全身型，III为急性爆发型，IV为肌无力危象。本课题研究无V型患者。

1.2、手术方法

麻醉前行双腔气管插管，常规以右侧胸腔入路，患者左侧45。斜卧，取右腋中线第7肋间隙切口作为镜孔，腋前线第3、5肋间各作2 cm大小切口为操作孔。入右侧胸腔后于胸骨后-上腔静脉-右心房交界处剪开纵隔胸膜，自下而上分离胸腺右叶外缘，自颈根部游离右叶上级，显露左无名静脉；剪开胸骨后纵隔胸膜，将胸腺整片游离达胸腺右叶下极，清理周围脂肪组织。解剖胸腺静脉，超声刀离断。仔细游离左颈根部，牵出左侧胸腺上级，自上而下沿左肺门游离直至将整个胸腺切除。清理主一肺动脉间隙组脂肪一异位胸腺及向下清除心包周围脂肪。注意清除颈根部周围残留脂肪组织。手术完成后，于右膈胸腔面，超声刀烙取5mm*5mm的膈肌组织。迅速保存至液氮，留待后续检测。

1.3、western检测TRPC3

（1）蛋白提取

将约0.1ug组织加入PIPA细胞裂解液100μl，4℃冰上放置30min，匀浆器匀浆，将悬液收集至2ml离心管中，4℃，12000×g，10min，取上清液放入-80℃冰箱保存待用。

（2）BCA法蛋白定量

根据样品数量，按50体积BCA试剂A加入1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，充分混匀。将标准蛋白（0.5mg/ml）按

0,1,2,4,8,12,16,20μl加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20μl，加2μl体积样品到96孔板样品孔中，加标准品稀释液到20μl，标准蛋白孔和样品蛋白孔加入200μl的BCA工作液，37℃放置30min，用酶标仪波长560nm测定吸光度值。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。

（3）Western blot

制胶：用洁净玻板配置好12％PAGE分离胶，将分离胶约4ml注入准备好的玻璃板中间隙。轻轻在顶层加异丙醇作为覆盖物。待凝胶完全聚合后，倒掉覆盖层，用吸水纸吸干凝胶顶端残留的异丙醇。配制浓缩胶2ml，并注入分离胶上端，插入梳子，小心避免气泡。等分离胶凝聚后，拔去梳子。

电泳：将每组蛋白按照上样总量20μg计算出上样体积，加入10× 蛋白上样缓冲液，沸水煮5min后，3000 rpm离心3min，然后上样，并加入5μl蛋白maker作分子量指示。先恒压80v，30min；然后100v，90min。电转：电泳完毕后，按“夹心三明治”方式（分别放置海绵、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸和海绵）将胶与PVDF膜（使用前在甲醇中浸泡5sec左右）夹在一起，冰浴中电转，恒压90v，

90min。