3.第三章 细菌感染的实验室诊断(上)
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第三章 细菌感染的病原学诊断
第一节 标本的采集和处理原则
一、标本采集的一般原则
1.早期采集
2.无菌采集
无菌部位:严格无菌操作
有正常菌群部位：明确目的菌；选择合适的 选择培养基
3.采用不同方法采集
需氧菌或兼性厌氧菌 厌氧菌：穿刺法采集 采集有明显病变的标本 根据病程采集不同的临床标本
4.采集适量标本和适当标本
1. 革兰染色法（Gram stain） （1）原理
1）细胞壁学说：两种细菌细胞壁通透性不同 2）等电点学说 3）化学学说：两种细菌含有RNA镁盐不同
（2）方法：制片→结晶紫初染→碘液媒染→ 酒精脱色→复红复染→结果
革兰阳性菌﹙G＋﹚：紫色 革兰阴性菌﹙G－﹚：红色
（3）影响染色结果的因素
1. 营养物质 碳源、氮源、无机盐、水、生长因子 （1）蛋白胨 提供氮源
植物胨: 大豆 动物胨：牛肉、动物组织等
（2）肉浸液 碳源、氮源 （3）牛肉膏 氮源 （4）糖（醇）类 碳源和能源
（5）血液 提供特殊生长因子、观察溶血 （6）无机盐类
常用元素：P、S、K、Na、Mg、Ca、Fe等 微量元素：Co、Zn、Mn、Cu、Mu等
5.安全采集
二、标本的处理 1.及时送检 2.运送与保存 1）根据待检菌特点对标本进行冷藏、保 温或保持厌氧状态
脑脊液、血液、厌氧菌保存不能冷藏
2）注意安全防护
第二节 细菌形态学检查
显微镜种类
1.普通光学显微镜（light microscope） 光源：可见光 2. 暗视野显微镜（ darkfield microscope ） 暗背景，菌体发光
用于检查不染色的活细菌和螺旋体的形态及运 动观察
3. 相差显微镜
检查不染色活细菌的形态及某些内部结构
4. 荧光显微镜 光源：100W~200W的高压汞灯 5. 电子显微镜 光源：电子流
透射电镜：观察细菌内部超微结构 扫描电镜：对细菌表面结构及附件观察
一、 不染色标本的检查
wenku.baidu.com
常用方法
（二）培养基的种类
1.按培养基的物理性状 （1）液体培养基：增菌
不含琼脂 琼脂：1.5%~2.0%
（2）固体培养基：纯化，增菌
（3） 半固体培养基：动力检测，保种
琼脂：0.3%~0.5%
液体培养基
固体斜面培养基
半固体培养基
2. 按营养成分和用途分类
（1）基础培养基：只有基本营养成分
（2）营养培养基：加有血液 、血清等
（7）鸡蛋与动物血清
用于某些特殊培养基
（8）生长因子
维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等
2.凝固物质 即赋形剂
（1）琼脂 （2）明胶 动物胶原组织熬制而成
3. 抑制剂和指示剂
（1）抑制剂：胆盐、煌绿、染料、抗生素等 选择培养基：加入一定种类的抑制剂，以抑 制杂菌生长或减少生长，有利于检出菌生长 的培养基。 （2）指示剂： 酚红、中性红、中国蓝等 鉴别培养基：加入特定底物和指示剂
（四）培养基的制备
1. 常用各种器具灭菌前的准备 （1）培养皿：用纸包裹 （2）试管：加塞后用纸包好 （3）吸管和毛细管 （4）三角烧瓶
2. 培养基制备的一般程序
（1）调配
根据培养基组成，准确称取各组分，先加需要蒸 馏水的一部分，再加培养基干粉，最后补足水量。
（2）溶化 液体培养基不需加热 （3）调整pH值 一般7.4~7.6 （4）过滤澄清
液体培养基： 滤纸 固体培养基： 纱布
（5）分装 分装量不超过容器的2/3
平板：灭菌后冷却至50 ℃~ 60℃时倾倒 90mm 25~30ml（4mm）：药敏用 90mm 13~15ml(3mm)：培养用 琼脂斜面：分装量为试管的1/5，灭菌后趁热制 成斜面， 斜面长度2/3 高层、半固体、液体：分装量为试管长度 1/4~2/3
压滴法 悬滴法 毛吸管法 用于检查厌氧菌动力
用途 动力试验——检查细菌有无动力 制动试验——初步鉴定细菌
三、 染色标本的检查
（一）常用染料
色基：决定染料的颜色 助色基：决定染料的酸碱性
1. 碱性染料
电离后色基带正电荷 细菌染色常用，如美蓝、结晶紫、碱性复红等
2. 酸性染料
用于细胞浆染色，如伊红、酸性复红、刚果红
细胞壁染色、荚膜染色、芽胞染色、 鞭毛染色、 异染颗粒染色
5.负染法 背景着色
肺炎链球菌荚膜染色
墨汁负染法
芽胞染色
第三节 细菌分离培养和鉴定
一、培养基的种类和选择 培养基（culture medium）：由人工方法 配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的 混合营养物制品。
（一）培养基的组成成分
操作技术：涂片和脱色 染色液： 细菌：18~24h培养物为好
（4）意义:
鉴别细菌 选择药物 与致病性有关
2. 抗酸染色法
细菌着色后不被盐酸酒精脱色的染色方法 染料：石炭酸复红、盐酸酒精、美蓝 方法 初染：5%石炭酸复红加热染色5min 脱色：3%盐酸酒精 复染：吕氏美蓝
3.荧光染色 金胺O法 4.特殊染色法
（3）鉴别培养基：含有特定底物和指示剂
（4）选择培养基：含有抑制剂
（5）特殊培养基：厌氧、细菌L型
（三）培养基的选择
1.血平板 最常用 2.巧克力血平板 奈瑟菌属、流感嗜血杆菌 3.肠道选择培养基 分离肠道细菌
常用中国蓝、EMB、MAC、SS
4.碱性琼脂或TCBS 分离霍乱弧菌 5.血液增菌培养基 血液、骨髓增菌用 6.营养肉汤 增菌用
3. 复合染料（中性染料）
碱性染料与酸性染料的复合物，如瑞氏染料、 姬姆萨染料等
4. 单纯染料
如苏丹染料，溶于脂肪溶剂，不溶于水，化 学亲和力低
（二）常用的细菌染色法
单染色法
只用一种染料，如吕氏美蓝
复染色法
用两种或两种以上不同颜色的染料
细菌染色的一般程序
1. 涂片 2. 干燥：自然干燥为好 3. 固定 4. 初染 5. 媒染 媒染剂 6. 脱色 脱色剂 7. 复染
临床标本常规选择培养基
1.除粪便标本外常规选择血平板 2.粪便标本选择肠道选择培养基
3.有正常菌群存在的部位除血平板外，另外再选择 1~2种相应的选择培养基
4.骨髓、血液需增菌 5.怀疑奈瑟菌属、嗜血杆菌属感染选择巧克力色血 平板（骨髓、血液、脑脊液）
6.除粪便血液外需涂片提示，特殊培养需临床提示
第一节 标本的采集和处理原则
一、标本采集的一般原则
1.早期采集
2.无菌采集
无菌部位:严格无菌操作
有正常菌群部位：明确目的菌；选择合适的 选择培养基
3.采用不同方法采集
需氧菌或兼性厌氧菌 厌氧菌：穿刺法采集 采集有明显病变的标本 根据病程采集不同的临床标本
4.采集适量标本和适当标本
1. 革兰染色法（Gram stain） （1）原理
1）细胞壁学说：两种细菌细胞壁通透性不同 2）等电点学说 3）化学学说：两种细菌含有RNA镁盐不同
（2）方法：制片→结晶紫初染→碘液媒染→ 酒精脱色→复红复染→结果
革兰阳性菌﹙G＋﹚：紫色 革兰阴性菌﹙G－﹚：红色
（3）影响染色结果的因素
1. 营养物质 碳源、氮源、无机盐、水、生长因子 （1）蛋白胨 提供氮源
植物胨: 大豆 动物胨：牛肉、动物组织等
（2）肉浸液 碳源、氮源 （3）牛肉膏 氮源 （4）糖（醇）类 碳源和能源
（5）血液 提供特殊生长因子、观察溶血 （6）无机盐类
常用元素：P、S、K、Na、Mg、Ca、Fe等 微量元素：Co、Zn、Mn、Cu、Mu等
5.安全采集
二、标本的处理 1.及时送检 2.运送与保存 1）根据待检菌特点对标本进行冷藏、保 温或保持厌氧状态
脑脊液、血液、厌氧菌保存不能冷藏
2）注意安全防护
第二节 细菌形态学检查
显微镜种类
1.普通光学显微镜（light microscope） 光源：可见光 2. 暗视野显微镜（ darkfield microscope ） 暗背景，菌体发光
用于检查不染色的活细菌和螺旋体的形态及运 动观察
3. 相差显微镜
检查不染色活细菌的形态及某些内部结构
4. 荧光显微镜 光源：100W~200W的高压汞灯 5. 电子显微镜 光源：电子流
透射电镜：观察细菌内部超微结构 扫描电镜：对细菌表面结构及附件观察
一、 不染色标本的检查
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常用方法
（二）培养基的种类
1.按培养基的物理性状 （1）液体培养基：增菌
不含琼脂 琼脂：1.5%~2.0%
（2）固体培养基：纯化，增菌
（3） 半固体培养基：动力检测，保种
琼脂：0.3%~0.5%
液体培养基
固体斜面培养基
半固体培养基
2. 按营养成分和用途分类
（1）基础培养基：只有基本营养成分
（2）营养培养基：加有血液 、血清等
（7）鸡蛋与动物血清
用于某些特殊培养基
（8）生长因子
维生素、氨基酸、嘌呤、嘧啶等
2.凝固物质 即赋形剂
（1）琼脂 （2）明胶 动物胶原组织熬制而成
3. 抑制剂和指示剂
（1）抑制剂：胆盐、煌绿、染料、抗生素等 选择培养基：加入一定种类的抑制剂，以抑 制杂菌生长或减少生长，有利于检出菌生长 的培养基。 （2）指示剂： 酚红、中性红、中国蓝等 鉴别培养基：加入特定底物和指示剂
（四）培养基的制备
1. 常用各种器具灭菌前的准备 （1）培养皿：用纸包裹 （2）试管：加塞后用纸包好 （3）吸管和毛细管 （4）三角烧瓶
2. 培养基制备的一般程序
（1）调配
根据培养基组成，准确称取各组分，先加需要蒸 馏水的一部分，再加培养基干粉，最后补足水量。
（2）溶化 液体培养基不需加热 （3）调整pH值 一般7.4~7.6 （4）过滤澄清
液体培养基： 滤纸 固体培养基： 纱布
（5）分装 分装量不超过容器的2/3
平板：灭菌后冷却至50 ℃~ 60℃时倾倒 90mm 25~30ml（4mm）：药敏用 90mm 13~15ml(3mm)：培养用 琼脂斜面：分装量为试管的1/5，灭菌后趁热制 成斜面， 斜面长度2/3 高层、半固体、液体：分装量为试管长度 1/4~2/3
压滴法 悬滴法 毛吸管法 用于检查厌氧菌动力
用途 动力试验——检查细菌有无动力 制动试验——初步鉴定细菌
三、 染色标本的检查
（一）常用染料
色基：决定染料的颜色 助色基：决定染料的酸碱性
1. 碱性染料
电离后色基带正电荷 细菌染色常用，如美蓝、结晶紫、碱性复红等
2. 酸性染料
用于细胞浆染色，如伊红、酸性复红、刚果红
细胞壁染色、荚膜染色、芽胞染色、 鞭毛染色、 异染颗粒染色
5.负染法 背景着色
肺炎链球菌荚膜染色
墨汁负染法
芽胞染色
第三节 细菌分离培养和鉴定
一、培养基的种类和选择 培养基（culture medium）：由人工方法 配制而成的，专供微生物生长繁殖使用的 混合营养物制品。
（一）培养基的组成成分
操作技术：涂片和脱色 染色液： 细菌：18~24h培养物为好
（4）意义:
鉴别细菌 选择药物 与致病性有关
2. 抗酸染色法
细菌着色后不被盐酸酒精脱色的染色方法 染料：石炭酸复红、盐酸酒精、美蓝 方法 初染：5%石炭酸复红加热染色5min 脱色：3%盐酸酒精 复染：吕氏美蓝
3.荧光染色 金胺O法 4.特殊染色法
（3）鉴别培养基：含有特定底物和指示剂
（4）选择培养基：含有抑制剂
（5）特殊培养基：厌氧、细菌L型
（三）培养基的选择
1.血平板 最常用 2.巧克力血平板 奈瑟菌属、流感嗜血杆菌 3.肠道选择培养基 分离肠道细菌
常用中国蓝、EMB、MAC、SS
4.碱性琼脂或TCBS 分离霍乱弧菌 5.血液增菌培养基 血液、骨髓增菌用 6.营养肉汤 增菌用
3. 复合染料（中性染料）
碱性染料与酸性染料的复合物，如瑞氏染料、 姬姆萨染料等
4. 单纯染料
如苏丹染料，溶于脂肪溶剂，不溶于水，化 学亲和力低
（二）常用的细菌染色法
单染色法
只用一种染料，如吕氏美蓝
复染色法
用两种或两种以上不同颜色的染料
细菌染色的一般程序
1. 涂片 2. 干燥：自然干燥为好 3. 固定 4. 初染 5. 媒染 媒染剂 6. 脱色 脱色剂 7. 复染
临床标本常规选择培养基
1.除粪便标本外常规选择血平板 2.粪便标本选择肠道选择培养基
3.有正常菌群存在的部位除血平板外，另外再选择 1~2种相应的选择培养基
4.骨髓、血液需增菌 5.怀疑奈瑟菌属、嗜血杆菌属感染选择巧克力色血 平板（骨髓、血液、脑脊液）
6.除粪便血液外需涂片提示，特殊培养需临床提示