分光光度计

电磁辐射的波长
电磁波波长的范围
Region
Wavelength (nm)
Far ultraviolet
10-200
Near ultraviolet 200-380
Visible
380-780
Near infrared
780-3000
Middle infrared 3000-30,000
吸收峰的命名
曲线上“A”处称最大吸收峰，它所对应的波长称最 大吸收波长，以λmax表示。
曲线上“B”处有一谷，称最小吸收，它所对应的波 长，所对应的波长，称最小吸收波长，以λmin 表 示。
曲线上在最大吸收峰旁边有一小峰“C”，称肩峰。 在吸收曲线的波长最短的一端，曲线上“D”处，吸
收相当强，但不成峰形，此处称为末端吸收。
λmax是化合物中电子能级跃迁时吸收的特 征波长，不同物质有不同的最大吸收峰，所 以它对鉴定化合物极为重要。吸收光谱中， λmax、λmin、肩峰以及整个吸收光谱的 形状决定于物质的性质，其特征随物质的结 构而异，所以是物质定性的依据。
测定某物质的紫外吸收光谱的曲线，可与已 知标准的紫外光谱图相对照，对照时须注意 测定的条件，如溶剂、浓度等。
分光光度计
一、基本原理
利用紫外光、可见光、红外光和激光等测定物质的 吸收光谱，利用此吸收光谱对物质进行定性定量分 析和物质结构分析的方法，称为分光光度法或分光 光度技术，使用的仪器称为分光光度计。
分光光度计灵敏度高，测定速度快，应用范围广， 其中的紫外/可见分光光度技术更是生物化学研究 工作中必不可少的基本手段之一。因此我们重点讨 论紫外/可见分光光度法的基本原理、仪器构造及 其在生化领域中的应用等。
n→π*
C＝O
紫外吸收波长范围 100～150 nm ＜200 nm 200～300 nm ～300 nm
Examples of transitions and resulting λmax
π→π*跃迁：此类跃迁所需能量较小， 吸收波长在紫外区的200～300 nm， 不饱和烃、共轭烯烃及芳香烃均可发
Far infrared
3×104-3×105
Microwave
3×105-1×109
Relationship between light absorption and color
电子跃迁类型与紫外吸收波长(nm)关系
电子跃迁类型 例子
σ→σ*
C－H
π→π*(非共轭) C＝O
π→π*(共轭) ＝C－C＝
A——吸光度，又称光密度“O.D”。 T——透光度， T＝I / I。， I。——为照射到吸收
池上的光强，I——为透过吸收池的光强。 ε——摩尔吸光系数（L·mol-1·cm-1）。 b——样品光程（cm），通常使用1.0cm 的吸收池，
b=1cm。 C——样品浓度（mol/L）。
吸光度A与物质的吸光系数“ε”和物质的浓度“C”成正比。
生这类跃迁，氨基酸、蛋白质与核酸 均含有大量共轭双键，因而200～ 300 nm的紫外吸收测定，在生化实 验技术中有极广泛的用途。
Commonly used solvents and their 'cut-off' wavelengths
Solvent 溶剂
Cut-off (nm)
Iso-octane 辛烷
增色效应（hyperchromic effect）
核酸变性或降解，使得DNA或RNA溶液对 紫外光的吸收明显增加，即 ε值（吸光系数 或称消光系数）显著升高，此现象称为增色 效应。此效应是由于碱基之间电子相互作用 的改变所致，通常在260nm处测量。
减色效应（hypochromic effect）
检测计算溶液的摩尔浓度
例如：尿嘧啶核苷酸溶液用1cm石英吸收池 测定 260nm处的吸光度为0.650，用同一 吸收池测定纯溶剂的吸光度为0.070，计算 尿嘧啶溶液的摩尔浓度，已知其摩尔吸光系 数 = 8.2×103 M-1cm-1（M＝mol / L)。
紫外光谱中常用的术语
发色团、助色团、增色效应和减色效应。 发色团：凡是与饱和碳氢化合物连接能引起n→π*、
π→π*、 n→σ* 等电子跃迁的基团称为发色团。 例如：C＝C、C＝O等。 助色团：助色团是一些具有非共价键的基团（如 OH、NH2、SH等）。这些基团在波长＞200 nm处没有吸收，当它与发色团相连接时，使发色 团的吸收带向长波移动，称为红移（或浅色效应）， 红移的同时吸收带的强度增加。若助色团与发色团 相连接，产生 n→π* 跃迁，使吸收波长向短波 移动，称为兰移（或深色效应）。
在一定的条件下，变性的核酸又可以复性， 此时ε值又明显减少，回复到原来的核酸分 子ε值较低的水平，即此时DNA或RNA溶 液的紫外光吸收显著降低，此现象称为减色 效应，此效应也是由于碱基之间电子相互作 用的变化所引起的，通常在260nm条件下 测量。
光吸收定律
朗伯——比尔（Lambert－beer）光吸收定律： A＝-lgT＝εb c
202
Ethyl alcohol 乙醇
205
Cyclohexane 环己烷
200
Acetone 丙酮
325
Tetrachloroethylene 四氯乙烯
290
Benzene 苯
280
Carbon tetrachloride 四氯化碳
265
Chloroform 氯仿
245
Ethyl ether 乙醚
Leabharlann Baidu
由于化合物紫外吸收峰较少，而且峰形都很宽，不 象红外光谱有许多指纹峰，所以在用紫外吸收光谱 进行化合物定性鉴定时，应注意：化合物相同，其 紫外光谱应完全相同；但是紫外光谱相同不一定化 合物就相同，可能仅是存在某些相同的发色团或基 团，因此在鉴定时应与红外光谱相结合。
由于电子跃迁的同时也引起分子的转动和振动光谱， 要把电子跃迁和分子振动、转动的跃迁完全分开是 不可能的，因此我们常见的紫外吸收光谱是由一个 或几个宽的吸收谱带所组成。
220
Isopropyl alcohol 异丙醇
210
Methyl alcohol 甲醇
210
不同溶剂对酚紫外检测的影响
若逐渐改变照射某物质的入射光的波长，并 测定物质对各种波长光的吸收程度（吸光度 “A”或光密度“O.D”）或透射程度（透光 度“T”），以波长λ作横坐标，“A”或“T” 为纵座标，画出连续的“A~λ”或“T~λ” 曲线，即为该物质的吸收光谱曲线。