正常人尿蛋白质组学研究

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尿液蛋白图谱上蛋白重复性好、表达清晰、界限较明显 的蛋白斑点，送中国科学院生物物理研究所基质辅助 激光解吸电离飞行时间质谱（ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ）进行肽指 纹图谱鉴定。 １．２．６蛋白质序列数据库检索将质谱结果放人互 联网上用ＭＡＳＣＯＴ软件在相关数据库进行肽指纹图谱 检索分析，网址为：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍａｔｒｉｘｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏｗ．／，其 参数设定如下：Ｄａｔａｂａｓｅ：ＭＳＤＢ；Ｅｎｚｙｍｅ：ｔｒｙｐｓｉｎ；Ｐｅｐｔｉｄｅ
２．２质谱分析从左到右ｐＨ值为３—１０，从上到下 分子量递减。选取图中表达点分子量约１８—９４ ｋＤ， ｐＨ值在３一１０范围内重复性好、染色清晰、界限明显 的３０个蛋白位点进行质谱分析，位点位置见图２。
圈ｌ正常人尿蛋白电泳图谱
圈２正常人尿蛋白龟泳 图谱取点后
２．３正常３０个尿液蛋白匹配结果将每个切取蛋白 点做质谱，质谱结果进行生物信息学分析，每个点取最 高分值对应的蛋白质作为匹配结果，共有２８个点获得 有效匹配，其中编号１８与２０的两个点未得到有效匹 配。见表１。
２４
ＩＧＨＶ４—３１抗ＲｈＤ单克隆Ｔ１２５ １重链前体
５２ ３２９．３
２５
肌动蛋白Ａ２（主动脉平滑肌）４１ ９８１．８
２６
血清转铁蛋白
７６ ９９９．６
２７
ｅＤＮＡ ＦＵ５０８３０，高度类似血清白蛋白
５９ ５３５．１
２８
ＳＥＲＰＩＮＡＩ ＰＲ０２２７５
１３ ０８８．９
２９
载脂蛋白＾一Ｉ
３０ ７５８．９
·
１材料与方法
１．１材料 １．１．１标本来源 收集我院２００９年３月体检中心４ 例正常人的清洁中段尿，男女各２例，平均年龄为３５．５ 岁，均为体检健康的志愿者。 １．１．２ 实验试剂 二硫苏糖醇（ＤＴＴ）、碘乙酰胺 （ＩＸａ）和考马斯亮蓝购自于美国Ｓｉｇｍａ公司；固相ＰＨ 梯度干胶条（ＩＰＧ，Ｓｔｒｉｐ３—１０，１７ ｃｍ）、两性电解质 （Ｐｈａｒｍａｌｙｔｅ，ＰＨ３—１０）、覆盖液、低分子量标准蛋白 质、尿素、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸、ＳＤＳ、Ｔｒｉｓ —ＨＣＬ和ＣＨＡＰＳ购自于美国ＢＩＯ—ＢＡＤ公司；其余试 剂均为国产分析纯。
日立７０８０２ＩＳＥ生化分析仪购自日本；ＰＲＯＴＥＡＮ ＩＥＦ Ｃｅｌｌ等电聚焦仪购自于ＢＩＯＲＡＤ公司；ＰＲＯＴＥＡＮ Ⅱ】【ｉ ２一Ｄ Ｃｅｌｌ垂直电泳槽，ＧＳ一８００ Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ｄｅｎｓｉ．
·国家高技术研究发展计划（编号：２００６ＡＡ０２０９），北京市优秀人 才培养Ｄ类专项基金资助项目（编号：２００４／Ｄ０３０３１５４）
１２ ：旦璺垒兰堂２１：！：壹鏖耋型查塑皂垩自
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８．６４ ５．２３ ６．８１ ６．８８ ８．９３ ５．５６
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抗ＲｈＤ单克隆Ｔ１２５＿ｒ重链前体 肌动蛋白Ａ２ 血清转铁蛋白 未命名蛋白产物 ＰＲ０２２７５
载脂蛋白Ａ—Ｉ
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３讨论 自从提出“尿蛋白组学”（ｕｒｉｎａｒｙ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ）概念
以来，利用蛋白质组学技术对尿液蛋白质进行高通量、 系统性地分析和鉴定得到快速发展，并用于解释生理
万方数据
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广东医学２０１０年２月第３１卷第３期
ＧｕａｎｇｄｏｎｇＭｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｆｅｂ．２０１０，Ｖ０１．３１，Ｎｏ．３
学代谢、毒理及许多疾病的进程，尤其泌尿系统疾病中 蛋白质的改变可直接经尿道分泌到尿液中，因此研究 尿液中蛋白质改变可以帮助理解疾病发病机制、寻找 早期诊断的生物学标记。尽管尿液的成分非常复杂， 但由于尿液易获取无创伤，国内外学者目前热衷于对 生理和疾病状态下的尿液进行蛋白质组学分析，获得 了正常尿液标准蛋白图谱¨以１、并研究疾病状态下尿 蛋白的变化ｐ。１。
带信息的最有效方法，为建立适合常规检验人群尿样
处理的尿液蛋白质双向电泳图谱，选择重复性好、独立
百度文库
清晰的蛋白质位点进行质谱鉴定，多点全方位同时分
析正常尿蛋白基本组成，为疾病的比较做正常参照体
系，我们挑选了一定蛋白含量、一定清晰度、适合目前
检验方法最小检测限之上的３０个点进行分析，为分析
泌尿系统疾病的尿液差异性改变提供对比资料。
甲状腺紊结合蛋白 甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶２亚型
１５ ８７７ ２０ ６１５．９
载脂蛋白Ａｌ 尚有争议的不具白蛋白特征的假定白蛋白 白蛋白２３ ｋＤａ片段 血清转铁蛋白
３０ ７５８ ７１ ６５７ ２２ ８４４ ７６ ９９９
间一ａ一胰蛋白酶抑制剂重链１－１４（ＩＴＩＨ４）
１０３ ８１６．２
２２
问一ａ一胰蛋白酶抑制剂重链１－１４亚型２
【关键词】 双向凝胶电泳；尿液；蛋白质组；肽指纹图谱
尿液是血液经肾小球滤过、肾小管和集合管重吸 收、排泄及分泌产生的终末代谢产物，其组成、数量与 性状的变化携带有泌尿系统疾病发生、发展及预后的 各种信息，也可反映机体整体代谢状态，与血清等其他 体液样本相比，其获取无创、收集便利，并且蛋白组成 相对简单、易于分析。蛋白质组学则是诠释蛋白所携
△通信作者ｏ Ｅ—ｍａｉｌ：ｍｚｈａａ９６２＠ｙａｈｏｏ．ｃ响．ｃｎ
ｔｏｍｅｔｅｒ凝胶成像系统获取图像，用ＰＤＱｕｅｓｔ２Ｄ分析软 件对图像进行凝胶图像分析。 １．２ 方法
１．２．１样品处理 收集晨起清洁中段尿１００ ｍＬ，２ ｈ 内４℃ｌ ５００ ｒ／ｒｅ．ｉｎ离心１５ ｍｉｎ，收集上清液，弃去细胞 碎片和核，上清液在血细胞计数板观察无细胞或颗粒， 取上清液与一２０℃预冷纯丙酮１：１混匀，４℃静置 １５ ｍｉｎ，１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心５ ｍｉｎ，弃上清，将沉淀溶于 样品裂解液（９ ｍｏｌ／Ｌ Ｕｒｅａ、４％ＣＨＡＰＳ、６５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＤＴｒ、０．５％两性电解质）中，超声ｌＯ Ｈｚ、１０ ｓ冷却５０ ８ 重复６次，４℃１２ ０００ ｒ／ｍｉｎ离心１０ ｍｉｎ，取上清，过除 盐柱除盐，蛋白质千粉溶于裂解液中，日立７０８０一ＩＳＥ 生化分析仪检测总蛋白浓度。分装，一８０℃冻存备用。 １．２．２ 双向凝胶电泳 （１）固相等电聚焦：参照ＢＩＯ —ＲＡＤ公司操作指南进行，电泳上样总体积约４５０ ｔｒＬ （约ｌ ５００ ＩＬｇ总蛋白），一向条件为：５０ Ｖ低压水化 １６ ｈ，然后进行等电聚焦，总电压时间为６０ ０００ Ｖｉａ。 （２）平衡：等电聚焦后，迅速取出ＩＰＧ胶条分别于第一 步和第二步平衡液中振摇１５ ｍｉｎ，用滤纸条吸取多余 的平衡液。（３）ＳＤＳ—ＰＡＧＥ垂直电泳：将平衡后的 ＩＰＧ胶条移至１２％的凝胶上端，起始电压为１００ Ｖ，待 样品进入ＳＤＳ胶浓缩成一条线，０．５ ｈ后加大电压到 ２００ Ｖ。直至溴酚蓝到达凝胶底边处停止电泳。 １．２．３考马斯亮蓝染色凝胶固定液（４０％乙醇，１０％ 乙酸）固定３０ ｍｉｎ后，双蒸水冲洗５ ｍｉｎ ３次，考马斯亮 蓝Ｇ２５０染液（０．１２％考马斯亮蓝Ｇ２５０，１０％硫酸铵， １０％磷酸，２０％甲醇）染色过夜，脱色液（４０％甲醇，１０％ 乙酸，双蒸水至１００％）进行褪色直至背景清晰。 １．２．４ 图像分析利用ＧＳ一８００ Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ｄｅｎｓｉｔｏｍ－
本实验中我们对正常人尿液中的蛋白质进行分 离、提纯，通过双向凝胶电泳技术获得重复性好的正常 尿蛋白电泳图谱，利用肽指纹图谱对染色明显且独立 的３０个蛋白斑点进行鉴定，并对结果进行数据库检 索，每个点取最高分值对应的蛋白质作为匹配结果，共 有２８个点获得有效匹配。对其进一步进行生物信息 学分析，获取的蛋白质包括：各种血清白蛋白（ＡＭＢＰ 蛋白；白蛋白２３ ｋＤａ片段；血清白蛋白亚型１；白蛋白； 假定白蛋白；未命名白蛋白）；免疫分子以及补体系统 （ＩＧＫＣ蛋白；人补体片段４ｂ）；各种载脂与转运蛋白 （甲状腺素结合蛋白；载脂蛋白ＡＩ；血清转铁蛋白）；肽 酶ｓｌ家族（甘露聚糖结合凝集素丝氨酸蛋白酶２亚 型）；细胞结构蛋白（肌动蛋白Ａ２）；蛋白酶抑制因子 （ＳＥＲＰＩＮＡｌ ＰＲ０２２７５；ＩＴＩＨ４）；两种未知蛋白（ｅＤＮＡ ＦＵ５１４４５，ｅＤＮＡ ＦＬＪ５０８３０，均为高度类似ＡＭＢＰ蛋白） 等。与ＴＨＯＮＧＢ００ＮＫＥＲＤ等¨１分离鉴定出的４７种蛋 白中包括膜蛋白、转运蛋白、受体、黏附分子、信号转导 蛋白、酶及细胞骨架蛋白等基本相符。进一步分析各 蛋白的功能，例如：ＡＭＢＰ蛋白前体是存在于血清中的 一种复合糖蛋白，降解为两种不同功能的蛋白质包括 仅１微球蛋白和ｂｉｋｕｎｉｎ。ｏｔｌ微球蛋白属于载脂转运蛋 白超家族成员，在炎症过程中起调节作用。Ｂｉｋｕｎｉｎ是 一种尿胰蛋白酶抑制剂，是Ｋｕｎｉｔｚ—ｔｙｐｅ蛋白酶抑制 因子超家族的一员，在许多病理生理过程中起着重要 作用。ＩＴＩＨ４属于ＩＴＩＨ家族，由１个轻链和５个同源 重链组成，通过与透明质烷共价作用使细胞外基质处 于稳态，ＨＡＭＭ等ｐ ｏ研究表明ＩＴＩＨ家族基因在乳腺 癌、结肠癌以及肺癌中明显下调，推测可能为抑癌基因 家族，其中ＩＴＩＨ４基冈在结肠癌、胃癌、肺癌、肾癌以及 前列腺癌等实体肿瘤中下调明显等。通过我们所获得 的正常尿液标准蛋白图谱为参考，寻找不同疾病尿蛋
２３俺Ｊ－ａ－胰蛋白酶抑制剂重链小必
ｌＯｌ １４５·９ ·∞拍－
等电点
６．Ｏｌ
ＮＣＢＩ蛋白数据库 未命名蛋白产物
５．９５ ５．９３
ＡＭＢＰ蛋白；ｂｉｋｕｎｉｎ —
６．６ ５．９２
免疫球蛋白ｋ恒定区 血清白蛋白；前体
５．９２ ５．７７
血清白蛋白；前体 白蛋白
６．８８ ５．９２ ６．８９ ６．８８
未命名蛋白产物 血清白蛋白；前体 人补体片段４ｂ 未命名蛋白产物
２２ ８４４ ３２ ０９７ ６９ ３２１．５ ６９ ３２１．５
白蛋白４５ １３０．４
ｅＤＮＡ ＦＬｌ５０８３０，ＡＭＢＰ高度相似蛋白
５９ ５３５．Ｉ
血清白蛋白亚型１
６９ ３２１．５
人补体片段４ｂ
１９２ ６２７．５
ｅＤＮＡ ＦＬＪ５０８３０，高度类似白蛋白 自蛋白２３ ｋＤａ片段
５９ ５３５．１ ２２ ８４４
ｅｔｅｒ凝胶成像系统获取图像，ＰＤＱｕｅｓｔ２Ｄ分析软件对图 像进行背景消减、斑点检测、匹配以及斑点位置重复性 的系统分析，寻找其固定表达蛋白。 １．２．５ ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ—ＭＳ肽指纹分析筛选出正常
万方数据
广东医学２０１０年２月第３ｌ卷第３期
Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｆｅｂ．２０１０，Ｖ０１．３１，Ｎｏ．３
本实验室在蛋白质组学方面有着独特优势，靳胜 等№１利用２Ｄ—ＰＡＧＥ结合ＭＡＬＤＩ—ＴＯＦ技术研究分 析膀胱癌组织与正常组织之间的固定差异表达蛋白 质，赵旭宏等一。对前列腺增生的尿液蛋白质学进行了 研究，建立了成熟而稳定的技术平台，在此平台的基础 上本实验选择了正常人的尿液为研究对象，初步建立 正常人尿蛋白图谱，多点全方位同时分析正常尿蛋白 基本组成，为疾病的比较做正常参照体系，利于与不同 疾病状态下的尿蛋白图谱进行鉴定、分析。
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广东医学２０１０年２月第３ｌ卷第３期
Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ Ｆｅｂ．２０１０，Ｖ０１．３１．Ｎｏ．３
正常人尿蛋白质组学研究
雷婷，赵旭宏，张曼△ 北京世纪坛医院、北京大学第九临床医学院、首都医科大学肿瘤学系、临床检验中心（北京１０００３８）
【摘要ｌ 目的初步建立正常人尿液蛋白质双向电泳图谱，分析正常尿蛋白基本组成，为疾病下尿液蛋白差 异研究作参考。方法用丙酮沉淀法对４例正常人尿液中蛋白质进行浓缩，用固相ｐＨ梯度双向凝胶电泳技术分 离蛋白样品。凝胶考马斯亮蓝染色，ＧＳ一８００ Ｃａｌｉｂｒａｔｅｄ Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ凝胶成像系统获取图像，ＰＤＱｕｅｓｔ２Ｄ分析软件 对图像进行背景消减、斑点检测、匹配、斑点位置重复性的系统分析，寻找表达蛋白。应用基质辅助激光解析电离 飞行时间质谱（ＭＡＵＤＩ—ＴＯＦ）得到相应的肽指纹图谱，搜索相关数据库对蛋白质点进行鉴定。结果对染色明 显且独立的３０个蛋白斑点进行鉴定，并对结果进行数据库检索，共有２８个点获得有效匹配，包括各种血清白蛋 白、免疫分子以及补体分子、载脂与转运蛋白、肤酶Ｓｌ家族、细胞结构蛋白、蛋白酶抑制因子等，鉴定出的蛋白质 大部分ＰＩ在４—７之间。结论应用蛋白质组学方法分析正常人尿液蛋白质组成成分可行，初步建立了正常人尿 液２８个蛋白质图谱，为分析疾病状态下尿液蛋白质成分的改变提供了基础资料。
５．９３ ５．５２
一 甲状腺素结合蛋白
５．６１ ５．５６
甘露聚糖结合凝集索丝氨酸蛋白酶２ 载脂蛋白Ａｌ
６．３３
一
５．９３
一
６．８１
血清转铁蛋白；转铁蛋白；Ｂ—ｌ铁结合球蛋白
６．４３ ６·２ｌ
ｔｔＭｔｔ黼１２０ 间一ｎ一胰蛋白酶抑制剂重链１１４蛋白
问一ａ一胰蛋白酶抑制剂重链Ｈ４；血浆激肽释
¨－芝二：瓣≯笔嚣：㈨黼解
裹１正常３０个尿液蛋白匹配结果
编号
Ｏｌ ０２ ０３ ０４ ０５
嘶 ０７ ０８ ∞ ｌＯ
１１ １２ １３ １４ １５ １６ １７ １９ ２ｌ
搜索匹配结果 ｅＤＮＡ ＦＬＪ５１４４５，ＡＭＢＰ高度相似蛋白 ＡＭＢＰ蛋白（人口ｌ微球蛋白／ｂｉｋｕｎｉｎ前体）
分子鼍 ２９ ７５９．４ ３８ ９７４
白蛋白２３ ｋＤａ片段 ＩＧＫＣ蛋白（免疫球蛋白Ｋ恒定区） 血清白蛋白噩型ｌ 血清白蛋白亚型ｌ
ｎｉｌｕｓ ａｃｃｕｒａｃｙ：２００．００ ｐｐｍ；Ｍａｘｉｍｕｍ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｍｉｓｓｅｄ ｃｌｅａｖａｇｅ：ｌ；Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ：ｆＬＸｅｄ ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ（Ｃ） ｖａｒｉａｂ：Ａｃｅｔｙｌ（Ｎ—ｔｅｒｍ）ｏ
２结果
２．１ 双向凝胶电泳采用固相化ｐＨ梯度等电聚焦为 第一向和ＳＤＳ均一胶（Ｔ＝１２％）的垂直电泳为第二 向，按照上述各实验步骤，提取正常人尿蛋白，尿蛋白 用１７ ｃｍ，ｐＨ ３一１０的ＩＰＧ胶条进行二维电泳，获得了 清晰度高、重复性良好的考染双向凝胶电泳图。正常 人的尿蛋白电泳图谱见图１。