水稻转基因步骤
水稻转基因组织培养步骤
水稻转基因组织培养步骤农杆菌介导的转化一．试剂1 6-BA (6-BenzylaminoPurine) Sigma Cat No. B-58982 KT (Kinetin) Sigma Cat No. K-07533 NAA (Napthalene acetic acid) Sigma Cat N-06404 IAA (Indole-3-acetic acid) Sigma Cat No. I-51485 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) Sigma Cat No. D-84076 Kanamycin USB Cat No. 179247 CH (Casein Enzymatic Hydrolysate) Sigma Cat No. C-72908 Hn (hygromycin B) GiBco BRL Cat No. 10687-0109 Cn (Carbenicillin) 国产分装10 Nicotinic acid Sigma Cat No. N-076511 Pyridoxine HCl Sigma Cat No. P-866612 Thiamine HCl Sigma Cat No. T-390213 Inositol Sigma Cat No. I-301114 Phytagel Sigma Cat No. P-816915 Dimethyl Sulfoxide-DMSO Sigma Cat No. D-587916 X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside) Sigma Cat No. B-378317 AS (Acetosringone) Aldrich chem., CO 01531 EG二．溶液1.MS maxNH4NO316.5gKNO319.0gKH2PO4 1.7gMgSO4?7H2O 3.7gCaCl2?2H2O 4.4g 或CaCl2 3.32g逐一溶解药品后，加dH2O定容到1000ml。
水稻转基因实验技术手册
水稻转基因实验技术手册遗传工程实验室Genetic Engineering Laboratory Discipline of Crop Genetics and BreedingFujian agricultural and Forestry University目录第一章DNA提取与纯化第二章引物设计与PCR第三章感受态细胞制备与转化（E. coli & 农杆菌）第四章电泳技术、琼脂糖凝胶DNA回收第五章质粒回收第六章RT-PCR第七章构建载体互补实验过量表达GFPGUSRNAi第八章水稻组织培养第九章原位杂交第十章石蜡切片技术第十一章扫描电子显微镜附录：第一章SDS-DNA微量提取法1、取新鲜叶片5cm 左右于1.5ml 离心管中，加入液氮研磨（电钻）。
2、加入700μl 预热至65℃的SDS 抽提液，迅速搅匀后置于65℃水浴30min 。
3、加入200μl 5M KAc ，颠倒混匀，-20℃冰浴30min 后，10,000rpm 离心5min ，将上清夜倒入另一新的1.5ml 离心管中。
注：若溶液中仍有植物组织，可进行二次离心。
4、加入等体积的异丙醇（700 μl ），-20℃冰浴30min ，11,000rpm 离心5min 。
5、弃上清，加入70%乙醇清洗液晾干。
6、将风干的DNA 溶于100 μl TE 溶液中，55℃水浴溶解1h ，再室温放置1d 。
实验准备：溶液配制：SDS-抽提液：1M Tris-HCl ：100ml 5M NaCl ：100ml 0.5M EDTA ：100ml 10% SDS ：125mlTE （pH8.0）：1M Tris-HCl （pH8.0）：5ml 0.5M EDTA （pH8.0）：1ml第二章 PCR定容至1000ml定容至500mlPrimeSTAR HS DNA Polymerase with GC Buffer & TaKaRa LA Taq with GC BufferPCR体系和程序第四章琼脂糖凝胶DNA回收*第一次使用前请先在15ml漂洗液WB中加入60ml无水乙醇1、在长波紫外下，用干净刀片将所需回收的DNA条带切下，尽力切除不含DNA的凝胶，得到凝胶体积越小越好。
水稻转化方法
水稻转化方法1．愈伤组织的诱导选取成熟良好、饱满、无霉变的籼稻种子，用糙米机或人工方法去掉种子的内外粰，保留胚的完整性。
先用75%酒精消毒1 min，再浸泡于40% NaClO+0.1% Tween 20 溶液，并置于100 rpm的摇床上消毒30 min。
在超净工作台上，消毒后的去粰种子用无菌水洗涤5次以上，洗净后转移至装有无菌吸水纸的培养皿中吸干水分，再将去粰种子接种于诱导培养基中。
培养条件为32℃，持续光照（100 mole m-2 s-1）。
30天后即可得到较好的愈伤组织用于转化。
2．农杆菌的准备农杆菌选用水稻转化中常用的菌株Ag10。
将含有目的基因的表达载体通过电激转化法转入农杆菌Ag10，选取阳性菌株，再将阳性菌株划线于含合适抗生素的YEB固体平板培养基中，于28 ℃暗培养3天。
3天后，用接种针挑取米粒大小的农杆菌震荡悬浮于装有100 mL AA 浸染培养基的150 mL灭菌三角瓶中，以此作为愈伤组织的农杆菌浸染液。
特别值得注意的是，农杆菌应充分分散，而且浓度不能太大（OD600=0.1），否则后续的脱菌效果不好。
3．愈伤组织和农杆菌的共培养挑取诱导30天并且生长良好的愈伤组织（长出的水稻芽与种子去掉）浸泡于装有100 mL 农杆菌浸染液的150 mL灭菌三角瓶中（在加入愈伤前，先加入150ml的AS,使AA液中AS的浓度为30mg/L），摇动5min。
同时，在共培养基平板上预先垫1张无菌滤纸，用1 mL 的AAM浸染培养基打湿，并除去气泡。
然后将浸染5 min后的愈伤组织用无菌滤纸吸干，置于垫了滤纸的共培养基上于25℃黑暗培养3天。
4．农杆菌的洗脱将共培养3天后的愈伤组织置于250 mL锥形瓶中，先用无菌水洗涤4-5次，直至洗液清澈透明为止。
加入过滤灭菌的400 mg/L羧苄青霉素溶液适量，于摇床上100 rpm 震荡洗涤25 min。
然后倒掉洗液，继续用羧苄青霉素溶液洗愈伤3-5次，再加入适量羧苄青霉素溶液，于摇床上100 rpm 震荡洗涤25 min，然后倒掉洗液，继续用羧苄青霉素溶液洗愈伤3-5次，最后用无菌滤纸将愈伤组织吸干。
转基因水稻Bt汕优63外源插入结构验证和定量检测方法建立
转基因水稻Bt汕优63外源插入结构验证和定量检测方法建立一、背景介绍Bt汕优63是一种经过基因工程技术改造的转基因水稻品种，通过引入Bt基因，使其具备抗虫特性，有效减少农药使用，保障粮食安全。
为确保Bt汕优63中外源基因插入结构的稳定性和表达量，本研究旨在建立一套针对其外源插入结构的验证和定量检测方法。
二、外源插入结构验证方法1. DNA提取从Bt汕优63植株中提取基因组DNA，作为后续实验的模板。
2. PCR扩增设计特异性引物，针对Bt基因及其侧翼序列进行PCR扩增。
通过琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，验证Bt基因是否成功插入水稻基因组。
3. 序列分析将PCR扩增产物进行测序，与预期序列进行比对，确认插入位点和序列的正确性。
三、定量检测方法建立1. 实时荧光定量PCR（qPCR）以Bt基因为目标，设计特异性引物和探针，建立qPCR检测体系。
通过标准曲线法对Bt基因在水稻基因组中的表达量进行定量分析。
2. qPCR实验步骤（1）制备cDNA：以提取的RNA为模板，反转录合成cDNA。
（2）配制qPCR反应体系：包括cDNA模板、引物、探针、dNTPs、Taq酶等。
（3）设置qPCR反应程序：包括预变性、变性、退火、延伸等步骤。
（4）数据分析：采用软件分析Ct值，根据标准曲线计算Bt基因的相对表达量。
四、方法优化与验证1. 优化实验条件：对qPCR反应体系中的引物浓度、探针浓度、退火温度等进行优化，确保检测体系的灵敏度和特异性。
2. 重复性实验：进行多次独立实验，验证检测方法的重复性。
3. 线性范围验证：通过制备不同浓度的标准品，构建标准曲线，验证检测方法的线性范围。
本研究成功建立了Bt汕优63外源插入结构的验证和定量检测方法，为后续转基因水稻的监管、研究和应用提供了有力的技术支持。
通过这些方法，可以确保Bt汕优63中外源基因的稳定性和表达量，为我国转基因作物的发展和安全提供保障。
六、实验操作注意事项1. DNA提取过程中的注意事项确保实验过程中使用的器械和容器无菌，避免DNA污染。
水稻转基因组织培养步骤
农杆菌介导的转化一．试剂1 6-BA (6-BenzylaminoPurine) Sigma Cat No. B-58982 KT (Kinetin) Sigma Cat No. K-07533 NAA (Napthalene acetic acid) Sigma Cat N-06404 IAA (Indole-3-acetic acid) Sigma Cat No. I-51485 2,4-D (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid) Sigma Cat No. D-84076 Kanamycin USB Cat No. 179247 CH (Casein Enzymatic Hydrolysate) Sigma Cat No. C-72908 Hn (hygromycin B) GiBco BRL Cat No. 10687-0109 Cn (Carbenicillin) 国产分装10 Nicotinic acid Sigma Cat No. N-076511 Pyridoxine HCl Sigma Cat No. P-866612 Thiamine HCl Sigma Cat No. T-390213 Inositol Sigma Cat No. I-301114 Phytagel Sigma Cat No. P-816915 Dimethyl Sulfoxide-DMSO Sigma Cat No. D-587916 X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside) Sigma Cat No. B-378317 AS (Acetosringone) Aldrich chem., CO 01531 EG二．溶液1.MS maxNH4NO316.5gKNO319.0gKH2PO4 1.7gMgSO4∙7H2O 3.7gCaCl2∙2H2O 4.4g 或CaCl2 3.32g逐一溶解药品后，加dH2O定容到1000ml。
水稻转基因策略-第三版
水稻转化体系的构建（第三版，2015年3年10日）N6D 诱导愈伤，前培养2N6-AS 共培养N6DS 筛选MS-NK 再分化MS-HF 生根AB 农杆菌生长MSL 侵染N6D 1LChu N6 Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）3.99gMyo-inositol 0.1gProline 2.878gCasamino acid 0.3gSucrose 30g2.4-D 2mg/LGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min2N6-AS 1LChu N6 Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）3.99gMyo-inositol 0.1gCasamino acid 0.3gSucrose 30gGlucose 10g2.4-D 2mg/LGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min 冷却至50℃加1ml AS（200mg/L）不要吹的太干，该培养基要湿度高一些较好。
N6DS 1LChu N6Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）3.99gMyo-inositol 0.1gProline 2.878gCasamino acid 0.3gSucrose 30g2.4-D 2mg/LGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min 冷却至50℃加1ml cef(100mg/ml) 1ml hyg(50mg/ml)MS-NK 1LMS Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）4.43g （包含0.1g Myo-inositol ）Casamino acid 2gSucrose 30gSorbitol 30gNAA 0.02mg/LKinetin 2mg/LGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min 冷却至50℃加1ml cef(100mg/ml) 1ml hyg(50mg/ml)MS-HF 1LMS Basal Medium w/ Vitamins（PhytoTechnology Laboratories）4.43g （包含0.1g Myo-inositol ）Sucrose 30gGellan gum(Gelrite) 3g/L(分装)PH5.8120℃15min 冷却至50℃AB 200mlGlucose 1gAgrose 3gAB Buffer(20倍) 10mlAB Salt (20倍) 10mlddH2O 180ml120℃15min 冷却至50℃加相应的抗生素。
水稻转基因方法及培养基配放个
根癌农杆菌介导的转化方法将水稻成熟种子去壳。
仔细剔除有霉菌点籽粒，取饱满清亮籽粒先用７０％乙醇浸泡（表面消毒）1min ，再用含2%活性氯含量的NaClO溶液（加1-3滴Tween20）浸泡30min以上（最长可至1小时左右），并不断摇动，然后用无菌水冲洗4-5次；将灭菌后的成熟种子置于无菌滤纸上吸干多余水分，直接接种于N2D6培养基上，于24-26ｏC暗培养7-10 天，诱导出初生愈伤组织；将上述从成熟胚诱导的初生愈伤组织直接用于与农杆菌的共培养转化；农杆菌的准备是在含有50mg/mL km的LB 平板上划线，培养含有重组质粒的农杆菌，28ｏC培养36h。
挑取活化的单个农杆菌菌落，在28ｏC于3mL 含km 的LB培养基中振荡培养过夜，第2天按1.5/50（V/V）接种量在AB液体培养基中培养，培养程度以稍早于生长对数期为宜（OD600约为0.6-0.8 ）。
离心回收新鲜培养的农杆菌，并重悬于约1/2-1/3体积的AAM（含100-400mol·L-1乙酰丁香酮）液体培养基中，至OD600约为0.8-1.0左右为宜；将愈伤组织切下，立即投入含农杆菌的AAM重悬液中，浸泡15-20分钟，并不断摇动。
将感染后的愈伤组织置于无菌滤纸上吸干多余的菌液，转入共培养基N6D2C上培养3天（26ｏC，暗培养）。
转入筛选培养基N6D2S1上与24-26ｏC 暗培养条件下筛选2周。
新鲜长出的抗性愈伤组织或不褐化的愈伤组织转入筛选培养基N6D2S2上，继续筛选培养2次，每次2周。
将抗性愈伤组织转入MSPR培养基上进行预分化处理14天，其中先在暗条件下培养7天，然后转入光条件下培养7天；经预分化处理的愈伤组织转入MSR培养基分化再生，在光下培养；再生的小苗在1/2MS0培养基上生根壮苗。
农杆菌介导转化水稻所用培养基-1-1 626蔗糖，2mg·L-1 2,4-D, 2.5g·L-1Phytagel( sigma) ,pH5.8N6D2S1N6D2，25mg·L-1潮霉素B（Roche），500mg·L-1头孢霉素（cefotaxime）N6D2S2N6D2，50mg·L-1潮霉素B，300mg/mL头孢霉素2424442 150mg·L-1KCl, 10mg·L-1CaCl2, 2.5mg·L-1FeSO4·7H2O, 5g·L-1葡萄糖，pH7.0AAM AA（Toriyama和Hinata，1985）盐分和氨基酸，MS（Murashige和Skoog 1962）维生素，0.5g·L-1酪蛋白水解物，36g·L-1葡萄糖，68.5g·L-1蔗糖，100-400µmol·L-1乙酰丁香酮，pH5.2N6D2C N6D2, 10g·L-1葡萄糖，100-400µmol·L-1乙酰丁香酮（用时现加），pH5.2预分化与分化再生MSPR MS（Murashige和Shog，1962）盐分和维生素，0.5g·L-1酪蛋白水解物，50g·L-1蔗糖，2mg·L-16-BA，1mg·L-1NAA, 5mg·L-1ABA ，3.0g·L-1Phytagel, pH 5.8，50mg·L-1潮霉素B，200mg·L-1头孢霉素。
转基因水稻品种
转基因水稻品种一、转基因水稻的概念转基因水稻是指通过基因工程技术将外源基因导入水稻基因组中，从而使水稻获得新的性状或特性的水稻品种。
例如，可能导入抗虫基因使水稻能够抵抗特定害虫的侵害，或者导入抗除草剂基因方便田间杂草管理等。
1. 抗虫转基因水稻- Bt转基因水稻- 原理：将苏云金芽孢杆菌（Bt）中的杀虫蛋白基因导入水稻。
Bt蛋白能够特异性地毒杀鳞翅目害虫，如螟虫等。
当害虫取食转基因水稻后，Bt蛋白在害虫肠道内被激活，与肠道上皮细胞表面的特异性受体结合，造成肠道穿孔，最终导致害虫死亡。
- 优势：显著减少化学杀虫剂的使用量。
传统防治螟虫等害虫需要多次喷洒农药，这不仅成本高，而且农药残留会对环境和人类健康造成潜在威胁。
抗虫转基因水稻能在很大程度上解决这些问题，提高水稻产量的稳定性。
- CpTI转基因水稻- 原理：豇豆胰蛋白酶抑制剂（CpTI）基因被导入水稻。
CpTI能够抑制害虫体内的胰蛋白酶活性，从而影响害虫的消化过程，达到抗虫的目的。
- 优势：具有较广的抗虫谱，对多种害虫都有一定的抑制作用。
同时，由于其作用机制与Bt蛋白不同，两者结合使用可以延缓害虫对单一抗虫基因产生抗性。
2. 抗除草剂转基因水稻- 例如，导入抗草甘膦基因的水稻。
- 原理：草甘膦是一种广谱性的除草剂，它通过抑制植物体内的5 - 烯醇丙酮莽草酸 - 3 - 磷酸合成酶（EPSPS）的活性来杀死植物。
抗草甘膦转基因水稻中导入了经过修饰的EPSPS基因，这种基因编码的酶对草甘膦不敏感，从而使水稻在使用草甘膦除草剂时能够正常生长，而杂草被有效清除。
- 优势：方便田间杂草管理。
在传统水稻种植中，人工除草劳动强度大，化学除草容易对水稻产生药害。
抗除草剂转基因水稻可以在水稻生长期间精准地使用草甘膦进行除草，提高田间管理效率，减少杂草与水稻争肥、争光等情况，有助于提高水稻产量。
三、转基因水稻的安全性争议1. 环境安全方面- 基因漂移问题- 争议点：转基因水稻中的外源基因可能通过花粉传播等方式漂移到野生稻或其他近缘植物中，从而可能改变野生植物的基因组成和生态特性。
转基因水稻的原理
转基因水稻的原理
转基因水稻的原理是通过将具有特定基因的外源DNA导入到水稻细胞中，并使其正常表达，在水稻中产生所需的特定性状。
转基因水稻的原理主要包括以下几个步骤：
1. 基因选择：选择具有所需特性的基因，这些基因可以来自同一物种或其他物种。
例如，选择具有抗虫性、抗草木得、耐盐碱等性状的基因。
2. 基因克隆：将选定的基因从其原始来源中克隆出来，通常使用PCR等分子生物学技术来扩增目标基因序列。
3. 插入载体：将目标基因插入携带基因转移所需的DNA片段的载体中。
常用的载体是冠状病毒、细菌或酵母等。
4. 基因转移：将插入载体的基因导入到水稻细胞中。
目前常用的方法有农杆菌介导转化和基因枪转化等。
转化过程中，目标基因被导入水稻细胞的染色体中。
5. 基因整合和表达：插入的基因在水稻细胞中整合到染色体上，并在细胞的遗传物质DNA中被正常复制和遗传。
转基因水稻的这些细胞和后代可以继续表达改良后的特性。
6. 选育和鉴定：基于获得的转基因水稻植株，进行纯系选育和鉴定，确保其稳
定性和所需特性的遗传传递。
通过这些步骤，转基因水稻可以获得具有所需特性的水稻品种，以提高水稻的抗病虫害、抗逆性、增加产量等特性，进而提高农作物的生产效益。
水稻遗传转化体系Protocol
水稻遗传转化体系ProtocolIntroduction1．水稻的遗传转化研究历史与现状20 世纪80年代末, 水稻的遗传转化首获成功。
1988 年, 3 个不同的研究小组以水稻原生质体为受体,采用“电击法”或“PEG 介导法”等方法将外源3]。
1991 年, 基因枪转化的方法在水稻中基因导入到水稻中并获得再生植株[1~获得成功[4],随后成为水稻遗传转化的常用方法之一。
1993 年，Chan 等人[5]首先采用农杆菌介导的方法获得了转基因水稻。
Hiei 等人[6]以水稻成熟种子诱导的愈伤为受体, 建立了农杆菌介导的粳稻高效转化体系, 使得农杆菌介导法逐渐成为了水稻转化最常用的方法。
此后, 粳稻的转化方法被进一步优化, 使粳稻的遗传转化周期大幅缩短[7]。
虽然Hiei等[6]建立的农杆菌介导的转化体系使得粳稻的转化不再困难, 但是许多籼稻的转化依然存在障碍, 主要是转化效率低下。
因此, 一些研究者对籼稻的转化体系进行了一些优化, 使得籼稻的转化效率得到了一定的提高[8,9]。
最近, Hiei 和Komari[10]发表了一个粳稻和籼稻均适用的农杆菌高效转化的方法.根据他们的结果, 采用幼胚作为外植体, 籼13 个稻的转化可以在两个半月内完成，且转化效率非常高(一个幼胚可以得到5~独立的转化植株)。
2. 转基因技术在水稻上的研究与应用[11]a. 转基因抗虫水稻对于水稻最主要的害虫——螟虫(二化螟、三化螟、稻纵卷叶螟等)在水稻中尚未发现有效的抗性种质资源. 目前,最有希望和前途的方法就是利用转基因技术把外源抗虫基因引入水稻中创造出新的抗虫品种。
虽然水稻中已经发现和鉴定了19 个抗褐飞虱的基因[12], 但是由于褐飞虱有多个生物型且易产生变异, 抗性品种往往推广数年后就会失去抗性。
b. 转基因抗病水稻见抗水稻病毒研究c. 转基因抗旱水稻d. 转基因营养高效利用水稻e. 转基因优质水稻f. 转基因高产水稻g. 转基因抗除草剂水稻3.转基因技术在水稻抗病毒基因工程上的应用随着RNA干扰技术（包括siRNA和miRNA介导的RNA干扰）在抗病毒18 ]，结合RNA干扰技术和水稻遗传转化技术基因工程上的广泛研究和应用[13~来研究水稻，获得对水稻病毒高抗的品系越来越受研究人员的重视，成为国内外水稻病毒研究的热点。
试述植物转基因育种的主要步骤
试述植物转基因育种的主要步骤植物转基因育种，听起来是不是有点像科幻小说里才会出现的东西？这完全是科学家的智慧结晶，背后隐藏着无数的探索和努力。
我们生活中的很多常见蔬菜、水果，甚至粮食，都可能受益于转基因技术，变得更耐病、更抗虫、甚至更好吃。
植物转基因育种到底是怎么一步步实现的呢？今天咱们就来聊聊这其中的“秘密”。
一、找对象：选择合适的植物咱们得有一个“目标”才行。
就像人们谈恋爱，要找合适的人一样，植物转基因育种也得选对植物。
通常，这一步的选择是根据农民和市场的需求来决定的。
你想要改良的作物，得是那些最能解决当下农业问题的，比如抗虫、抗病、耐旱之类的。
这就好比，选择一个性格适合的对象，才能“培养”出更好的一种“植物性格”。
所以，科学家们会根据研究，挑选出那些在种植中比较有潜力的植物。
比如，现在咱们常吃的转基因玉米，它就是通过这种方式选定了目标：既要提高产量，又要耐虫害。
二、基因“搬家”：获取外源基因确定好了目标之后，接下来就是要进行基因的“搬家”了。
哈哈，你可能觉得这听起来像是“黑科技”，其实这就是植物转基因的核心。
怎么搬呢？就是将其他物种的基因，拷贝到目标植物身上。
这些外源基因，可能是来自其他植物、细菌甚至动物。
举个例子，如果你想让某种植物能抵抗某种害虫，科学家就会从已经有这种抗性特征的植物或细菌中提取基因，然后把它转入目标植物体内。
这就像是，你把一个高手的秘诀偷偷学会，然后去教自己家的植物，结果它就变成了“超能力植物”。
这个过程可以通过几种方法实现，比如通过细菌感染、基因枪发射等“高科技手段”。
这些方式听起来是不是很神奇？但都是为了让植物得到你想要的能力。
三、培养新一代：筛选与验证一旦基因成功“搬家”到植物里，接下来的任务就是让它扎根发芽，看看新的植物能不能像你预期的那样表现。
这时候，科学家们就像是“养育”孩子一样，等待着基因突变后的小生命能长成大植物。
这个过程中，种出来的每一棵植物，都会进行仔细筛选，看看它们是否具备了你想要的特性，比如抗病、抗虫、产量高等。
水稻转基因方法 自己
转基因步骤：2-3月完成水稻幼胚愈伤组织的培养1.去壳成熟的水稻种子经70%乙醇消毒5min。
2.倒去乙醇，再用2.5%次氯酸钠（每50mL加一滴吐温20）消毒15min，无菌水洗5次，再用2.5%次氯酸钠消毒15min，再用无菌水浸泡30min。
3．倒去次氯酸钠，将种子倒到无菌滤纸上吸干，再将种子放在N6D （0.6% Gelrite）培养基上29.5度光照培养30-60天（白天12h29.5度，晚上12h29.5度）。
注;培养基每2周换一次。
农杆菌的准备1．选择有活力的愈伤组织（相对干的、淡黄色的。
如图1）转到新的N6D培养基上，29.5度光照培养3天。
注: 褐色的愈伤千万不能选，不然会影响转化效率。
2．挑取含有目的基因的农杆菌单菌落或吸取所保存的农杆菌液100ul 于5ML YEP培养液中（50mg/l Kan+， 50mg/l（利福平） Str+），28度、250rp振荡培养12-36h至OD600饱和。
3.从上述菌液中吸取500ul于50mlYEP培养液中（50mg/l Kan+，50mg/l（利福平） Str+）. 28度、250rp振荡培养12-36h至OD600=0.6-0.8。
注;农杆菌培养时要避光。
因为农杆菌对光敏感。
农杆菌本身对利福平有抗性，质粒对Kan+ 有抗性，所以能在YEP培养基中（50mg/l Kan+， 50mg/l（利福平） Str+）生长的菌斑基本上转进去质粒了，只需做下菌落PCR验证下。
农杆菌的侵染1．取15ml培养好的菌液，4度，4000rpm离心10min，去上清。
2. 挑取农杆菌放入30ml AAM感菌液中（10-20mg/l AS），轻轻混匀使OD600=0.05-0.1。
3．将愈伤放入无菌50ml离心管中。
（在准备一个滤膜）4．将步骤2中农杆菌液倒入步骤3中，侵染90s，其中不停要摇晃。
5．弃菌液，将愈伤组织取出置于无菌滤纸上沥干30-45min。
水稻转基因步骤
水稻转基因步骤在植物转基因过程中，为了有效地识别和筛选转化子，常将目的基因和标记基因构建在同一表达载体中。
这种载体结构导致转基因植物中目的基因和标记基因始终共存，而标记基因（尤其是抗生素抗性基因）的存在可能给转基因植物的生物安全带来隐患。
目前已研发了多种方法剔除转基因植物中的标记基因，其中最常见的是共转化法(Komari 1996，McCormac 等2001)。
共转化系统是采用2个质粒或1个含有两套T—DNA表达盒的表达载体共同转化植物，其中一套表达盒含有抗性选择标记基因，另一套表达盒含有目的基因，它们转化植物时可能整合到植物基因组的不同位置。
转基因植株在减数分裂过程中，标记基因和目的基因发生分离，从而可在转基因后代中筛选到只含目的基因而不含选择标记基因的个体。
共转化从根本上排除了转基因植物中的选择标记，是保证人畜和环境安全的重要措施，因此受到了广泛的重视。
Zhou 等（2003）认为，用分别含一个T-DNA区的两个载体共转化的效率低于双T-DNA区表达载体的共转化效率。
目前关于利用双T-DNA区表达载体，获得无选择标记转基因阳性株系的研究已有不少报道（唐俐等2006，张秀春等2006，于恒秀等2005）。
花药培养与遗传转化技术相结合，可以快速获得纯合转基因植株（斯华敏等，1999，付亚萍等，2001），但是应用花药培养快速获得只含目的基因而无选择标记的转基因研究尚未见报告。
水稻是最主要的粮食作物，转基因水稻的安全显得尤为重要。
本实验室通过农杆菌介导的水稻转化体系，将包含人乳铁蛋白(hLF)、高赖氨酸(SB401)、高甲硫氨酸(RZ10)基因的表达载体p13HSR成功转化脆茎稻，由于该表达载体采用双T-DNA结构，将检测出含选择标记潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）和目的基因的转基因阳性T0植株按单株直接进行花药培养。
在189株二倍体花培植株中检出23株有目的基因没有选择标记hpt的转基因纯合植株，得率为9.87％。
水稻转基因实验方法与步骤
水稻转基因实验操作方法步骤一、水稻愈伤组织的诱导（一）以水稻幼胚为试材诱导愈伤组织1．消毒：取水稻未成熟种子（灌浆期），按以下步骤消毒：1）用自来水冲洗种子，去掉浮起的瘪谷；2）将种子放入250ml无菌烧杯中（种子数量约占1/3体积），用200ml70%酒精消毒2分钟；（在操净工作台上进行无菌操作）3）加入250ml25%次氯酸钠（NaClO）溶液，同时加数滴吐温-20，浸泡90分钟；4）倒去NaClO溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）用镊子夹住种子，在无菌滤纸上用钢钩挤出幼胚，置入诱导培养基中；2）操作完毕后封好培养皿（一般保鲜膜），在暗处适温下（25-28℃）培养5天；3）继代培养。
用镊子剥下胚性愈伤组织（去掉芽及膜状物），置入继代培养基中（凸起面向上），暗处适温下（25-28℃）培养3天。
（二）以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织1．消毒：取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将适量种子放入10ml离心管中（100颗左右），倒入75%酒精消毒2分钟；2）倒去酒精，加入一定量的0.1%升汞溶液，浸泡10分钟；3）倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子5-6遍，最后一遍浸泡30分钟。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）种子放在无菌滤纸上吸干，置入成就胚诱导培养基中，每皿12－14颗；2）操作完毕用封口膜（MicroporeTMSurgicalTape）封好培养皿，在28℃光照培养箱，暗培养培养3周；3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然分裂的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状，去除种子和芽），置入继代培养基中，在28℃光照培养箱，继代培养1周（2周愈伤组织更为松散）。
（如不马上用，需转移至暗处，于22℃继续培养1周）二、农杆菌培养挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌菌液100国于4mlYEP（含50mg/lKan和50mg/lStr）培养液中，28℃,250rpm振荡培养20-36h至菌液OD600为0.8-1.0（颜色接近橙黄色）。
中国转基因作物流程
中国转基因作物流程
1.基础研究：通过分子生物学、遗传学等技术手段，对目标基因进行研究和筛选，确定需要引入的外源基因。
2. 基因克隆：将目标基因从供体中克隆出来，并构建适当的载体，使其能够被植物细胞识别和表达。
3. 转化：将构建好的载体导入植物细胞中，使其能够被植物细胞表达，并与植物本身的基因组进行整合。
转化方法包括农杆菌介导转化和基因枪法。
4. 选择：通过筛选和鉴定，挑选出表达目标基因的转化植株，并进行后续培育。
5. 试验验证：对选出的转化植株进行试验验证，包括基因型鉴定、表型鉴定、生态安全评估等。
6. 田间试验：将试验验证通过的转化植株进行田间试验，评估其生长发育、产量和品质等性状。
7. 安全评估：在田间试验的基础上，对转基因作物进行生态安全评估，包括对环境和人体的风险评估。
8. 商业化应用：通过科技成果转化机制，将安全性评估通过的转基因作物推向市场，实现商业化应用。
- 1 -。
水稻育种方法及选育过程
水稻育种方法及选育过程水稻是我国主要的粮食作物之一，其育种方法及选育过程对于提高水稻产量和品质具有重要意义。
本文将介绍水稻育种方法及选育过程的相关内容。
一、传统育种方法传统育种方法是指利用自然交配、有性繁殖和选择的方式进行育种。
其主要包括以下几个步骤：1. 亲本选择：选择优良的亲本进行杂交，以获取优质基因。
2. 人工授粉：为了避免杂交，需要进行人工授粉，将雄花的花粉传到雌花的柱头上。
3. 选择杂交种：通过对杂交种进行田间试验和实验室鉴定，筛选出具有良好产量和品质的种子。
4. 多代选择：将杂交种培育为自交系，并进行多代选择，以提高水稻的适应性和稳定性。
二、分子育种方法随着生物技术的发展，分子育种方法也逐渐应用于水稻育种。
其主要包括以下几个步骤：1. 基因定位：利用分子标记技术，将目标基因定位到水稻染色体上的特定位置。
2. 基因克隆：通过克隆和表达目标基因，研究其功能和作用机制。
3. 基因转化：将目标基因转移到水稻中，以改良其性状。
4. 分子标记辅助选择：利用分子标记与目标性状的关联，快速选择出具有优良性状的水稻品种。
三、选育过程水稻的选育过程通常经历以下几个阶段：1. 目标确定：根据市场需求和种植区域的特点，确定选育的目标性状，如产量、抗病性等。
2. 亲本选择：根据目标性状和亲本的遗传背景，选择合适的亲本进行杂交。
3. 杂交组合：将优良亲本进行人工授粉，获得杂交种子。
4. 田间试验：将杂交种在田间进行试验，评估其产量和抗病性等性状。
5. 筛选和选择：根据试验结果，筛选出表现优异的杂交种，作为后续育种的亲本。
6. 连续选择：将表现优异的杂交种进行连续选择，逐步提高其产量和品质。
7. 纯系选育：通过自交和选择，将杂交种培育为纯系，以确保其遗传的稳定性。
8. 区域试验：在不同的种植区域进行试验，评估其适应性和稳定性。
9. 品种推广：将优良的水稻品种推广到种植区域，提高水稻的产量和品质。
总结起来，水稻育种方法及选育过程主要包括传统育种方法和分子育种方法。
水稻转基因实验操作[2]
![水稻转基因实验操作[2]](https://img.taocdn.com/s3/m/ee8ee83143323968011c927c.png)
水稻转基因实验操作（谢越、赵建宁、艾鹏慧、孙淑斌整理）（2006.7）一、水稻（日本晴）愈伤组织的诱导（以水稻成熟胚为试材诱导愈伤组织）1．消毒：取水稻成熟种子，人工或者机械脱壳，挑选饱满光洁无菌斑的种子，按以下步骤消毒：1）将种子放入100ml无菌烧杯中，倒入70%酒精消毒1分钟；2）倒去酒精，加入100ml 30%次氯酸钠（NaClO）溶液（5.2%次氯酸钠），浸泡30分钟；3) 倒去次氯酸钠溶液，用无菌蒸馏水清洗种子4-5遍，最后一遍浸泡30分钟。
2．诱导与继代培养：（以下步骤需无菌操作）1）种子放在无菌滤纸上吸干，置成熟胚于诱导培养基中，每皿12－14颗；2）操作完毕用封口膜（Micropore TM Surgical Tape）封好培养皿，在30℃光照培养箱，培养4周；3）在超净工作台上打开培养皿，用镊子挑取自然散落的胚性愈伤组织（淡黄色，致密呈球状），在30℃光照培养箱，继代培养1-2周。
(没有脱落的可在原培养基上继续培养7天，次数多了效果会减弱)二、农杆菌（工程菌）培养挑取农杆菌单克隆或吸取所保藏的农杆菌（EHA105）菌液100µl于4ml YEP（含50mg/LSpec和50mg/L Str）培养液中，28℃，250rpm振荡培养20-36h至菌液OD600为0.8-1.0。
三、感菌与共培养1）取培养好的工程菌液1ml于1.5ml离心管中，4℃，5000rmp，离心1min，去上清。
用含200µmol/LAs的30ml AAM感菌液制成悬浮液。
2）将长到一定大小的水稻愈伤组织挑出，放入农杆菌悬浮液侵染5分钟（愈伤量没过50ml离心管锥形部位即可）。
3）将愈伤组织取出，置于无菌的滤纸上沥干30-40分钟；4）将愈伤组织置于共培养基上(共培养基上面垫上一层9cm无菌滤纸)。
28℃（组培室）暗培养2.5天。
四、愈伤组织的抗生素筛选将愈伤组织取出，用无菌水清洗6次，其间需不停的振荡（组培室震荡机最大速率）。
转基因水稻讲义
前言：水稻是三大粮食作物之一，世界上近一半人口，都以水稻为主食，它是人类营养和能量摄入最重要的谷物，提供全世界五分之一以上热量消耗。
概况：早在上世纪八十年代早期国际水稻生物技术的研发就在洛克斐勒基金的资助下开展。
至今在水稻生物技术方面的专利超过三百项，涉及四百多个组织和机构。
从1993年起，在美洲、欧洲、亚洲和澳洲的许多国家陆续开始了转基因水稻的田间试验。
目前，已有6个转基因水稻品种获得了不同的批准认可，涉及种植、食用、饲用、进口和加工等方面。
全球已培育出近50个转基因抗虫水稻品系，大部分均已进入田间试验阶段，鉴于其环境安全性及食品安全性，还未进行商业化种植，除了2004年伊朗批准抗虫转基因水稻的商业化种植。
国内转基因水稻主要是华中农业大学张启发院士课题组在研究，其研发的抗虫转基因水稻“华恢1号”和“Bt汕优63”于2009年8月获得农业部转基因生物安全证书，但是目前并没有获批进行商业化种植。
除抗虫水稻外，一些药用或耐除草剂水稻陆续被批准进口或商业化应用。
1998年起，美国批准Ventra Bioscience公司研发的转溶菌酶，乳铁蛋白、人血清白蛋白基因的3个药用转基因水稻的商业化种植。
美国批准安万特公司的转bar基因耐除草剂水稻及先正达公司的黄金大米等。
我们组通过上网查找资料、借阅图书馆书籍以及询问老师的方式对转基因水稻有了进一步的了解，现在和大家一起来揭开转基因水稻的神秘面纱。
首先要介绍的是目前人类对转基因水稻研发所能达到的技术水平。
技术比较成熟的有以下四种水稻：1、抗虫转基因水稻2、抗除草剂转基因水稻3、抗花粉过敏转基因水稻4、金稻技术还在研发中的水稻主要有抗逆性转基因水稻、高产和优质性状转基因水稻这两种。
表格接下来介绍转基因水稻的工艺流程。
我们知道，基因工程包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术主要是对外源基因的重组设计，分为以下几步：1、切（获取目的基因）2、接（构建基因表达载体）3、转（将目的基因导入受体细胞）4、增（扩增DNA重组分子）5、检（目的基因的检测与表达产物的测定）每一步具体的操作方法会根据供体、受体细胞的不同而改变，越具体到可以直接指导我们的实际操作的资料信息就越高精尖，目前我们的能力无法理清这些，所以只总结了一般可以选择的几种方法。
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在植物转基因过程中，为了有效地识别和筛选转化子，常将目的基因和标记基因构建在同一表达载体中。
这种载体结构导致转基因植物中目的基因和标记基因始终共存，而标记基因（尤其是抗生素抗性基因）的存在可能给转基因植物的生物安全带来隐患。
目前已研发了多种方法剔除转基因植物中的标记基因，其中最常见的是共转化法(Komari 1996，McCormac 等2001)。
共转化系统是采用2个质粒或1个含有两套T—DNA表达盒的表达载体共同转化植物，其中一套表达盒含有抗性选择标记基因，另一套表达盒含有目的基因，它们转化植物时可能整合到植物基因组的不同位置。
转基因植株在减数分裂过程中，标记基因和目的基因发生分离，从而可在转基因后代中筛选到只含目的基因而不含选择标记基因的个体。
共转化从根本上排除了转基因植物中的选择标记，是保证人畜和环境安全的重要措施，因此受到了广泛的重视。
Zhou 等（2003）认为，用分别含一个T-DNA区的两个载体共转化的效率低于双T-DNA区表达载体的共转化效率。
目前关于利用双T-DNA区表达载体，获得无选择标记转基因阳性株系的研究已有不少报道（唐俐等2006，张秀春等2006，于恒秀等2005）。
花药培养与遗传转化技术相结合，可以快速获得纯合转基因植株（斯华敏等，1999，付亚萍等，2001），但是应用花药培养快速获得只含目的基因而无选择标记的转基因研究尚未见报告。
水稻是最主要的粮食作物，转基因水稻的安全显得尤为重要。
本实验室通过农杆菌介导的水稻转化体系，将包含人乳铁蛋白(hLF)、高赖氨酸(SB401)、高甲硫氨酸(RZ10)基因的表达载体p13HSR成功转化脆茎稻，由于该表达载体采用双T-DNA结构，将检测出含选择标记潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）和目的基因的转基因阳性T0植株按单株直接进行花药培养。
在189株二倍体花培植株中检出23株有目的基因没有选择标记hpt的转基因纯合植株，得率为9.87％。
RT-PCR检测结果显示外源基因已整合到转基因水稻基因组中并转录。
本文首次发现插入的外源基因间存在交换事件，从而改变了花培群体中无选择标记而目的基因阳性的转基因纯系的获得率。
同时还对农杆菌介导的同一载体上多个基因转化水稻后，会出现个别基因丢失的情况进行了讨论。
基因转化方法参照Hiei等(1994)的方法并加以修改。
取开花后12-15 d左右的稻穗脱粒，表面灭菌后接种在NB培养基上，26℃暗培养诱导愈伤组织。
约5-7d后取愈伤组织在相同条件下继代培养，用于共培养。
农杆菌于含50mg/L卡那霉素(Kam)的YM平板上划线,28℃黑暗培养3d，用金属匙收集农杆菌菌体,将其悬浮于共培养CM液体培养基中,调整菌体浓度至OD600为0.3-0.5，加入AS（终浓度为100mΜ）,即为共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。
将继代培养4d后的愈伤组织浸于此菌液中，20min后取出并用无菌滤纸吸去多余菌液，随即转入铺有无菌滤纸的固体培养基上，于26℃下暗培养2~3d。
共培养后的愈伤组织在含有50mg/l潮霉素的筛选培养基上，26℃暗培养14d，再转到新鲜配制的筛选培养基上继续筛选14d。
然后选择生长旺盛的抗性愈伤组织转移到含有50mg/l潮霉素的分化培养基上，暗培养3天后转至15h/d 光照条件下培养,再生的小苗在1/2MS上生根壮苗两周左右。
选择高约10cm、根系发达的小苗，按编号移栽入土。
将双T载体p13HSR转化脆茎稻，共获得96株转基因苗（T0代）。
PCR检测表明其中41株既含潮霉素抗性基因又含目的基因，42株只有潮霉素抗性基因没有目的基因，4株有目的基因没有潮霉素抗性基因，9株目的基因和潮霉素抗性基因都没有。
双T-DNA区表达载体p13HSR在水稻中的共转化频率为42.7％。
没有选择标记的13株（13.5％）T0代转基因苗，是逃过抗生素的抑制幸存下来的，从技术上和理论上都无法控制其出现频率，即使含有目的基因也没有实际操作价值。
所以我们在实验中挑选了目的基因和选择标记都有的T0代植株进行后续的花培纯合实验。
从先期获得的6株T0植株中，检测出5株同时含选择标记基因和目的基因。
将这些植株按单株进行花药培养，共获得花培苗233株，其中189株二倍体，7株四倍体，37株单倍体。
二倍体植株的PCR检测结果表明，有68株既含潮霉素又含目的基因，24株只有潮霉素没有目的基因，74株目的基因和潮霉素都没有，23株有目的基因没有潮霉素。
无选择标记而目的基因阳性的转基因纯合植株的总得率为9.87％，这些植株生长正常，株高、分蘖、穗长、单穗粒数等参数和对照相仿（资料未显示）。
RT-PCR检测结果显示外源基因已整合到转基因水稻基因组中并转录（图2，3）。
以上结果表明，将遗传转化技术与花药培养相结合，快速获得了纯合的，同时含人乳铁蛋白(hLF)、高赖氨酸(SB401)、高甲硫氨酸(RZ10)基因但不含潮霉素抗性基因的二倍体转基因水稻（图4）。
2.3 DHT0代群体中选择标记基因和目的基因的分离5株T0转基因株分别进行花药培养，获得5个DHT0代群体。
对群体中的二倍体植株进行了目的基因（为方便计，记作G)与选择标记基因（S）的PCR检测。
结果表明5个株系中都有S+G+，S+G-，S-G+和S-G-四种类型的植株。
假定在农杆菌转化过程中，2个T-DNA分别独立插入到水稻基因组的不同源的染色体上，则其花培群体的分离比应为1：1：1：1。
卡平方测定结果（表2）表明，1、3、5号群体的分离比符合预期假设，但2、4号群体的分离比与预期结果不符，而且S+G+和S-G的比例明显高于S+G-和S-G+，提示双T结构可能插入到同源染色体的同一染色单体上，并在减数分裂期间发生了遗传交换。
由于花药培养获得的DH群体直接反映了交换事件，因此2、4号群体的交换频率分别为18.0％和28.6％。
2.4 双T-DNA区三价表达载体在转化过程中部分目的基因的丢失在对T0代和DHT0代进行选择标基因及目的基因检测的过程中，发现处于同一T-DNA区不同启动子启动的三个目的基因，在转基因植株中的出现频率也不是完全一致的。
T0代的45株目的基因阳性株系PCR检测结果表明有1株包含hLF无SB401和RZ10，1株无hLF有SB401和RZ10。
RT-PCR结果显示：DHT0代的91株中有6株有hLF无SB401和RZ10，3株无hLF有SB401和RZ10（图5）。
植物转基因对改良植物品质、增加抗性、提高产量等方面，都具有明显作用。
尽管WHO（1991）和FDA（1994）已经声明，食物中的标记基因本身并无安全性问题，但是从转基因作物的食用和环境安全性考虑，人们对抗性基因是否有向其他生物转移的可能性仍有诸多疑虑(Widmer等1996，1997；Kohli等1999)。
此外，就育种方法而言，转基因品种中标记基因的存在，对它再次进行转基因聚合育种也带来一定困难（Yoder and Goldsbrough 1994）。
因此，转基因植物标记基因的剔除，是转基因育种的一个重要内容。
本研究表明利用双T载体转化水稻，再通过花药培养技术即可快速获得有目的基因却不含选择标记的转基因株系，有效消除选择标记基因的安全隐患，大大加快了研究成果的应用速度。
在本研究中，无选择标记而目的基因阳性的转基因纯合植株的得率为9.87％。
于恒秀等（2005）用双T-DNA双元载体转化水稻，T0代共转化阳性的转基因植株自交后得到T1代植株中无选择标记基因而有目的基因AP1的比例介于25%-33%之间。
张秀春等（2006）利用双T载体获得的无选择标记的转基因大豆，T1代无选择标记基因而有目的基因的比例为18.75%，用同样的方法，Zhou等（2003）报告T1代的无选择标记基因而有目的基因的比例为19.5%。
由于这些T1代的目的基因存在纯合与杂合两种情况（比例约为1：2），因此虽然纯合基因型的比例与本实验基本一致，但还需要继续加代和检测才能获得纯合的植株。
而将双T载体转化与花药培养相结合的方法，仅一代就可获得纯合目的植株，大大加快了研究进度。
双T载体转化水稻在T0代有五种插入可能：1.选择标记区（简称S区）和目的基因区（简称G区）仍然相连，或者虽不相连，但插入在同一染色体的同一染色单体上；2. S区和G区分离，分别插在同一染色体的两个姐妹染色单体上；3.S区和G区分离，并分别插在不同的染色体上；4.S区发生T-DNA插入事件，G区被丢掉；5. G区发生T-DNA插入事件，S区被丢掉。
选取S+G+的T0代进行花药培养，淘汰了后两种情况，前三种类型在花培的DHT0代植株中又会出现新的分离情况（如表3）。
在已有的报道中，选择标记基因与目的基因的分离比数据所体现的均为表3中各种类型综合后的结果，无法明确双T载体的插入方式。
而本实验中我们选取了选择标记和目的基因双阳性的T0代植株并按株系进行花药培养，虽然进行花药培养的单株不多，也检出了3个T-DNA结构插入不同染色体（1，3，和5号群体）和同一染色单体（2和4号群体）两种类型，表明通过对DHT0群体的检测，有可能分析双T-DNA结构在转基因中的行为，为转化后载体插入方式的理论研究奠定了基础。
当然，个别DHT0群体的二倍体植株较少，可能影响生物统计的结论，因此今后开展同类研究需要保证一定的群体规模。
转化一、两个外源基因，往往不能满足育种上对多项农艺性状的要求，而多次转化又面临时间长，选择标记缺乏等难题，所以研究人员把多个外源基因一次性转入受体材料。
Cao 等（2005）将多元载体pYP1203E转化水稻，该载体在同一T-DNA区包含选择标记基因（hpt），报告基因（GUS）以及另外的三个各自独立使用启动子，终止子的外源基因（VHb，tzs和EPSPS），在113株T0代转基因单株中发现有8株发生了一个或两个外源基因丢失的情况。
本研究45株目的基因阳性的T0代株系中也有2株出现了部分目的基因丢失，所以我们推测大片段的T-DNA区在转化过程中会发生不完整插入的现象。
DHT0代91株中有9株目的基因片段不完整，说明较长的插入片段在后代遗传过程中有丢失其中一个表达盒的可能，由于基因转录必须具有完整的表达盒，所以RT-PCR结果显示的是hLF的缺失或是SB401和RZ10的缺失。
载体p13HSR中，共用启动子的SB401和RZ10表达盒是否会出现丢失其中一个基因，另外一个正常表达的情况，我们的实验结果不能体现，这是因为，RZ10是一个水稻内源的高甲硫氨酸含量的基因，为了便于检测，我们用SB401的序列设计了RZ10的5’端引物，用RZ10的序列设计了3’端引物，所以SB401和RZ10在我们的检测结果中始终是连锁的。
对这种可能性的研究需要构建其他特异的表达载体，转化受体材料后，进行分析。