分子生物学技术之DNA重组技术
分子生物学名词解释
分子生物学：从广义来讲，分子生物学是从分子水平阐明生命现象和生物学规律的一门新兴的边缘学科。
它主要对蛋白质及核酸等生物大分子结构和功能以及遗传信息的传递过程进行研究。
DNA重组技术:DNA重组技术（又称基因工程）是将DNA片段或基因在体外经人工剪接后，按照人们的设计与克隆用载体定向连接起来，转入特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状。
信号转导:是指外部信号通过细胞膜上的受体蛋白传到细胞内部，并激发诸如离子通透性、细胞形状或其它细胞功能方面的应答过程。
转录因子:是指一群能与基因5′端上游特定序列专一结合，从而保证目的基因以特定强度在特定时间和空间表达的蛋白质分子。
功能基因组：又称后基因组，是在基因组计划的基础上建立起来的，它主要研究基因及其所编码蛋白质的结构和功能，指导人们充分准确地利用这些基因的产物。
结构分子生物学:就是研究生物大分子特定空间结构及结构的运动变化与其生物学功能关系的科学。
生物信息学：是生物科学和信息科学重大交叉的前沿学科，它依靠计算机对所获得数据进行快速高效计算、统计分类以及生物大分子结构功能的预测。
染色体：是指存在于细胞核中的棒状可染色结构，由染色质构成。
染色质是由DNA、RNA和蛋白质形成的复合体。
染色体是一种动态结构，在细胞周期的不同阶段明显不同。
C-值（C-value）:一种生物单位体基因组DNA的总量。
C-值矛盾（C-value paradox）：基因组大小与机体的遗传复杂性缺乏相关性。
核心DNA（core DNA）：结合在核心颗粒而不被降解的DNA。
连接DNA（linker DNA）：重复单位中除核心DNA以外的其它DNA。
DNA多态性：指DNA序列中发生变异而导致的个体间核苷酸序列的差异，主要包括单核苷酸多态性和串联重复序列多态性两类。
DNA的一级结构：是指4种核苷酸的排列顺序，表示了该DNA分子的化学组成。
又由于4种核苷酸的差异仅仅是碱基的不同，因此又是指碱基的排列顺序。
DNA重组技术的基本工具
DNA重组技术的基本工具DNA重组技术是一种重要的分子生物学技术，用于改变基因组中的DNA序列，使之具有特定的功能。
这项技术的应用范围广泛，可以在基础研究、医学诊断、药物开发等领域发挥重要作用。
DNA重组技术的基本工具包括DNA片段的制备、限制性内切酶、DNA连接酶、质粒和载体等。
首先，DNA片段的制备是DNA重组技术的第一步。
通过PCR（聚合酶链反应）或限制性内切酶切割，可以从某个DNA源中获取特定的DNA片段。
PCR是一种体外扩增技术，可以将特定的DNA序列进行快速放大。
限制性内切酶是一类特殊的酶，可以识别特定的DNA序列并在该序列上切割DNA链。
通过PCR和限制性内切酶的组合应用，可以制备出需要的DNA片段。
其次，限制性内切酶是DNA重组技术中的重要工具之一。
限制性内切酶可以特异性地切割DNA链，并产生一定的粘性或平滑的DNA末端。
这些末端的特性决定了DNA片段连接的方式。
常用的限制性内切酶有EcoRI、BamHI、HindIII等。
当两个DNA片段具有相同的限制性内切酶切割位点时，它们可以通过限制性内切酶的连接来形成一个新的DNA分子。
接下来，DNA连接酶也是DNA重组技术中必不可少的工具之一。
DNA连接酶能够将两个DNA片段在适当的条件下连接在一起。
常用的DNA连接酶有T4 DNA连接酶和DNA聚合酶。
通过合适的实验条件和适当的连接酶，可以使两个DNA片段有效地连接成为一个整体。
此外，质粒和载体也是DNA重组技术中的重要工具。
质粒是一种小环状DNA分子，在细菌细胞中存在，并能自我复制。
载体则是质粒或其他DNA分子，用于携带所需的DNA片段。
通过将需要插入的DNA片段连接到载体上的限制性内切酶切割位点上，并将该载体转化至宿主细胞中，就可以实现外源DNA的导入。
在实际应用中，DNA重组技术的基本工具往往是共同配合使用的。
通过PCR或限制性内切酶的组合，可以制备出所需的DNA片段；通过限制性内切酶的连接和DNA连接酶的应用，可以将不同的DNA片段连接起来形成一个新的DNA分子；通过质粒和载体的应用，可以将需要插入的DNA片段导入到宿主细胞中实现转化。
DNA重组技术
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② 工具酶
DNA重组技术中对DNA的“精雕细刻”主要用酶作 为工具。分子生物学研究过程中发现的酶，许多 都用作工具，所以称在核酸及有关研究中像基本 工具一样不可缺少的酶类为工具酶。这类酶包括 限制性核酸内切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶、末 端修饰酶、RNA聚合酶、逆转录酶等。
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限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）
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PCR 的特点及应用： PCR操作简便、省时、灵敏度高、对原始材料的质和 量要求低。因此，广泛应用于许多领域。 1. 基因克隆及定量、扩增特异性片段用于探针、体外 获得突变体、提供大量DNA用于测序等； 2. 遗传病的产前诊断； 3. 致病病原体的检测； 4. 癌基因的检测和诊断； 5. DNA指纹、个体识别、亲子关系鉴别及法医物证； 6. 动、植物检疫； 7. 在转基因动植物中检查植入基因的存在。
限制性核酸内切酶是从细菌中分离提纯的核酸内切酶， 可以识别并切开核酸序列特定位点——分子手术刀； 是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。 是体外剪切基因片段的重要工具，所以常常与核酸聚 合酶、连接酶以及末端修饰酶等一起称为工具酶； 限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具，而且 与电泳技术相结合还可以用于基因组酶切图谱的鉴定 以及法医鉴定等。 Arber、Smith和Nathans因为在发现限制性内切酶方面开 创性工作而共同获得了1978年的诺贝尔奖。 13
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6 重组体的转化及鉴定
转化 转化过程是指将DNA重组体或质粒转到适宜的宿主细 胞中。通过这个过程，使目的基因片段得到大量扩 增、或产生需要的基因表达产物、或使宿主生物具 备所需的性状，同时目的基因还能在宿主细胞中稳 定遗传。 若需要让克隆的基因表达和产生大量编码蛋白，可对 转化的大肠杆菌进行扩大培养使目的基因大量表达 和积累。通过对表达产物分离纯化便可获得想要的 产品。
重组dna技术的基本过程
重组dna技术的基本过程
DNA重组技术是一种精密的科学技术，用于研究和设计生物体的基因，是分
子生物学研究的重要工具之一。
其基本过程包括把待改造基因从某族群中分离出来，结合另外一种特定的基因与之混合，使受体细胞能够接受和表达这些掺入的基因，最后进行检测验证，为改良后的生物体的表达提供了可靠的参照。
DNA重组技术的第一步就是选择和收集需要重组的基因。
一般选择一种有特
殊生物效用或表现的有用基因，另一种则是带有某种受体细胞表达机制的靶基因。
其中，靶基因负责携带和传输信息，而受体细胞负责把信息传递给其他细胞，激活基因表达。
然后，可以尝试使用不同的方法来将靶基因与有用基因进行混合，比如用酶联反应来重组基因，或者利用噬菌体法来进行DNA的交叉归并，经过这一步骤，不同的基因就可以完成混合合成组合。
最后，需要将重组的DNA带入到受体细胞中，这里需要使用到受精或体外转
化技术。
通常，科学家会将该细胞暴露于含有药物的生化培养基中，使其具有可接受外源DNA的能力，并继续将待重组的DNA和受体细胞混合，其中受体细胞只
接受含有重组激活基因的DNA，这样就可以把DNA重组合成植物或动物细胞。
最后，需要对新生成的重组体进行评价检测，以验证其中一些特殊性质，这也是DNA重组技术成功的根基。
总而言之，由于DNA重组技术的优势，如创造新的基因表达机理，修改基因
的功能，以及使用较少的原材料来实现重组，已经受到了广泛的应用，特别是在生物质料和医药研究领域。
而在生物制造和药物发现领域，它也是一个重要工具，可以解决很多实际问题。
DNA重组的主要步骤
DNA重组的主要步骤
DNA重组是指通过分离、移植和修饰DNA序列来改变基因组的过程。
主要步骤如下:
1.DNA分离: 通过酶切、洗脱或电泳等方法将所需
的DNA片段从基因组中分离出来。
2.DNA连接: 使用酶如连接酶或DNA连接酶将所
需的DNA片段连接在一起。
3.DNA克隆: 将连接好的DNA片段插入到载体中，
如质粒或菌系，进行DNA克隆。
4.DNA纯化: 从质粒或菌系中纯化出重组DNA。
5.DNA检测: 通过测序、质粒分析或其他方法检测
重组DNA的纯度和完整性。
6.DNA应用: 将重组DNA应用于基因疗法、基因
工程、药物研发等领域。
重组技术是基因工程的基础，广泛应用于生物医药、农业等领域。
在这个过程中，需要使用高纯度DNA质粒和严格的操作条件来保证重组DNA的质量。
7.DNA转化：将重组DNA转化为目标细胞，使之
能够生长和繁殖。
8.筛选：筛选出含有目标基因的细胞。
9.验证：使用多种方法（如Southern南方杂交、PCR
聚合酶链反应等）来验证重组DNA的纯度和完整性。
10.应用：将重组DNA应用于基因疗法、基因工程、
药物研发等领域。
DNA重组技术是一种高精度的分子生物学技术，可以通过改变基因组结构来改变生物体的性状。
这项技术在基因疗法、基因工程、药物研发、农业等领域都有着重要应用。
在进行DNA重组时，需要严格遵循实验流程和操作规范，避免误操作。
生物学中的DNA重组技术
生物学中的DNA重组技术DNA重组技术是生物学领域中一个极为重要的技术，它可以帮助研究人员实现DNA序列的改变和修正，让我们更好地理解基因组的构成和功能。
在这篇文章中，我们将会探讨DNA重组技术在生物学中的重要性以及它的应用。
DNA的重组技术指的是一系列的实验室操作，它涉及到分离和重新组合DNA碎片的过程。
这项技术使得研究人员可以将一个或多个DNA片段插入在其他DNA序列中，并生成新的DNA序列。
DNA重组技术已经被广泛应用在医学、农业、环境保护等众多领域中。
在医学方面，DNA重组技术已经被用于生产医用类蛋白。
这些蛋白质作为药物可以被用来治疗癌症、糖尿病、器官移植等疾病。
DNA重组技术也被应用于制造基因工程疫苗，如人乙肝疫苗和人乳头瘤疫苗等。
在农业领域中，DNA重组技术可以用来改良农作物。
这项技术可以从不同的植物、动物或细菌中提取基因，将其插入到植物的基因组中，以加强作物的防病能力、提高产量和提高品质。
目前，许多作物，如玉米、大豆和棉花，都已经获得了基因改造的好处。
在环境保护方面，DNA重组技术可以用来检测污染物。
这项技术利用细菌或其它微生物来检测特定的物质，这些细菌或微生物的DNA已经被程序化地改变，使之对特定的物质产生响应。
通过测量这种响应，我们可以检测出环境中特定污染物的存在。
DNA重组技术对人类社会的发展产生了深远的影响。
然而，它也面临着许多伦理和道德问题。
基因改造是否会对生态平衡和人类健康产生负面影响，这些都是我们需要仔细考虑的问题。
DNA重组技术的核心是分子生物学。
分子生物学研究生物分子结构、性质和功能，是许多生物学领域中一个核心概念。
DNA分子是生命的重要组成部分，研究DNA以及DNA如何被操纵和改变，是分子生物学的一个重要研究领域。
DNA重组技术还有一些其他的应用，如DNA测序，这是识别DNA序列的一个过程，可以帮助生物学家更好地了解基因组构成和基因序列；还有基因修复或基因敲除，这是逆转基因突变或消除不良基因的一种技术。
dna重组技术名词解释
DNA重组技术名词解释
DNA重组技术是一种利用分子生物学技术对DNA分子进行人工改造的方法。
下面是一些常见的相关术语解释：
•重组DNA（rDNA）：是通过将不同源的DNA分子在体外进行重新组合而获得的DNA分子。
重组DNA技术是DNA重组的基础，用于插入外源基因到目标生物体中。
•限制性内切酶（restriction enzyme）：是一类酶，能够识别DNA序列并在特定的位点上切割DNA链。
限制性内切酶在DNA重组中起到关键作用，用于切割DNA和插入外源DNA。
•载体（vector）：是DNA分子，在重组DNA技术中被用来携带外源基因并将其导入到目标生物体中。
常见的载体包括质粒、噬菌体等。
•基因克隆（gene cloning）：是利用重组DNA技术将目标基因复制多份，使得其在目标生物体中得以表达和传递。
基因克隆有助于研究基因功能、获得目标基因的大量表达产物等。
分子生物学中的DNA重组技术与应用
分子生物学中的DNA重组技术与应用DNA重组技术是分子生物学的一项重要技术手段，它通过对DNA分子的剪裁、重组、克隆等操作，实现了DNA分子的人工改造和设计。
随着分子生物学的发展，DNA重组技术越来越成熟，逐渐应用于生物工程、基因治疗、疫苗研究等方面。
本文将从技术原理、应用领域和发展趋势等方面谈谈分子生物学中的DNA重组技术。
一、技术原理DNA重组技术基于DNA分子的特性，利用酶切、连接、克隆等手段实现DNA分子的改造和设计。
其中最核心的技术是酶切和连接技术。
酶切技术利用酶的特异性剪切作用，将DNA分子剪成特定的片段，从而实现对DNA分子的定向切割。
连接技术则利用连接酶的作用，将两个不同的DNA片段连接在一起，实现新的DNA分子的构建。
这些手段可以实现DNA分子的全长或部分重组，从而改变其基本的生物学性质。
二、应用领域DNA重组技术已经被广泛应用于研究和应用领域，其中应用研究领域包括基因克隆、基因表达、基因工程等方面。
生物医药领域应用DNA重组技术已成为常规的技术手段，应用于基因治疗、疫苗研究、抗体工程等方面。
1. 基因克隆基因克隆是DNA重组技术最早和最为广泛应用的领域之一。
通过DNA引物的设计和PCR扩增技术，可以从DNA库中克隆出感兴趣的DNA分子。
通过引入一系列的酶切、连接等操作，可以将目标DNA分子构建成所需的分子。
2. 抗体工程抗体工程是近年来DNA重组技术的新热点。
通过克隆、改造、表达不同来源的抗体基因，可以获得多种高效且特异性的嵌合抗体。
这些抗体可以被广泛应用于生物学研究、临床诊断和治疗等领域。
3. 基因治疗基因治疗是DNA重组技术的另一个热门应用领域。
通过引入具有特定生物学功能的DNA分子，可以治疗多种遗传性和获得性疾病。
目前已经有多种基因治疗药物获得了FDA的批准。
4. 疫苗研究疫苗研究是利用DNA重组技术来克隆、表达和改造多种病原体蛋白的新领域。
通过此类技术可以获得高效、稳定和可控性的病毒样颗粒，这些病毒样颗粒可以用作疫苗制剂的候选物。
分子生物学名词解释
分子生物学：研究核酸、蛋白质等所有生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学。
C值反常：也称c值谬误，指c值往往与种系进化复杂性不一致的现象，及基因组的大小与遗传复杂性之间没有必然的联系，某些较低等的生物c值却很大。
DNA重组技术：又称基因工程。
将不同的DNA片段按照预先的设计定向连接起来，在特定的受体细胞中与载体同时复制并得到表达，产生影响受体细胞的新的遗传性状的技术。
GU-AG法则：多数细胞核mRNA前体中内含子的5’边界序列为GU，3’边界为AG，因此，GU表示供体衔接点的5’端，AG表示接纳点的3’端序列，习惯上，把这种保守序列模式称为GU-AG法则。
RNA干涉：是利用双链小RNA高效，特异性降解细胞内同源MRNA，从而阻断体内靶基因的表达，使细胞内出现靶基因缺失表性的方法。
摆动假说：crick为解释反密码子中子某些稀有成分的配对（如I）以及许多氨基酸中有两个以上密码子而提出的假设。
编码链/有义链：在DNA双链中，与mRNA序列（除t/u替换外）和方向相同的那条DNA，又称有义链模板链：指双链DNA中能够作为模板通过碱基互补原则指导mRNA前体的合成的DNA链，又称反义链操纵子：原核生物中由一个或多个相关基因以及转录翻译调控原件组成的基因表达单元。
反式作用因子：能直接或间接识别或结合在各类顺式作用元件中核心序列上参与调控靶基因转录效率的pro。
基因定点突变：向靶DNA片段中引入所需的变化，包括碱基的添加，删除，或改变基因家族：在基因组进化中，一个基因通过基因重复发生了两个或更多的拷贝，这些基因即构成一个基因家族，是具有显著相似性的一组基因，编码相似的蛋白质产物基因敲除技术：针对一个序列已知打包功能未知的基因，从DNA水平上设计实验，彻底破坏该基因的功能或消除其表达机制，从而推测该基因的生物学功能基因组DNA文库：某一生物体全部或部分基因的集合，将某个生物的基因组DNA或cDNA片段与适当的载体体外重组后，转化宿主细胞，所谓的菌落或噬菌体的集合即为……基因治疗：是将具有治疗价值的基因即“治疗基因“装配于带有在人体细胞中表达所必备元件的载体中，导入人体细胞，通过靶基因的表达来治疗遗传疾病聚合酶链反应：指通过模拟体内DNA复制方式在体外选择性的将DNA 某个特定区域扩增出来的魔斑核苷酸：在应急反应过程中，由大量GTP合成的ppGpp和pppGpp，它们的主要作用可能是影响RNA聚合酶与启动子结合的专一性，诱发应急反应，帮助细菌度过难关弱化子：原核生物操纵子中能明显减弱甚至终止转录作用的一段核苷酸序列同工tRNA：几个代表AA，能够被一个特殊的氨酰—tRNA合成酶识别的Trna顺式作用元件：存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列，包括启动子，增强子等，本身不编码任何pro，仅提供一个作用位点，与反式作用因子相互作用参与基因表达调控原位杂交技术：用标记的核苷酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织，细胞及染色体水平上对核苷酸进行定位和相对定量研究的手段转座/移位：遗传信息从一个基因座转移至另一个基因座的现象，由可移问位因子介导的遗传物质的重排管家基因：维持细胞正常生长发育的必需基因，所以细胞中均需表达的一类基因转座子：是存在染色体上的可自主复制和移位的基本单位，参与转座子易位及DNA链整合的酶称为转座酶原癌基因：正常细胞中与病毒癌基因具有显著同源性的基因，本身没有致癌作用，但是经过致癌因子的催化下激活成为致癌基因，使正常细胞向恶性转化。
DNA重组技术概述
DNA重组技术概述DNA重组技术（DNA recombinant technology）是利用DNA序列的组合、修饰和重排等方法来获得特定目的的DNA分子的一种技术。
该技术被广泛应用于基因工程、生物医药、农业、食品工业等领域，并在科研、生产和临床医学中产生了重要的影响。
DNA重组技术的主要原理是通过DNA分子的切割、粘接、合成等操作，改变DNA序列的结构和组合关系。
这样一来，就可以将不同来源的DNA片段进行组合，重组为新的DNA分子，从而实现对DNA序列的改变和修饰。
DNA重组技术的核心技术包括PCR扩增、限制酶切割、DNA连接、酶体定向克隆、DNA测序等。
PCR扩增是一种常用的DNA重组技术，它可以在短时间内扩增出目标DNA片段。
PCR的原理是通过DNA聚合酶酶作用下的连续循环体系，将目标DNA片段从少量模板DNA中扩增出来。
这种方法简单、高效，广泛应用于分子生物学研究、基因克隆、医学诊断等领域。
限制酶切割是DNA重组技术中常用的一种手段。
限制酶能识别并切割DNA特定的序列，从而产生特定的DNA片段。
通过选择不同的限制酶，可以将DNA分子切割为具有不同片段和末端特性的DNA片段，从而实现希望的DNA重组效果。
限制酶的切割操作常用于基因克隆、DNA分析和重组等实验中。
DNA连接是DNA重组技术的另一个核心环节。
DNA连接是将两条DNA片段的末端通过DNA连接酶的作用连接在一起，形成一个新的DNA分子。
DNA连接的方法有多种，如末端连接、中间连接等。
不同的连接方式和连接酶的选择，可以实现不同的DNA重组目的。
通过DNA连接技术，可以将来自不同源的DNA片段进行连接，从而构建出具有特定功能的DNA分子。
酶体定向克隆是DNA重组技术中的一种重要方法。
它通过酶体（vector）的选择和DNA片段的连接来实现目标DNA片段的克隆和表达。
常用的酶体有质粒、噬菌体和人工染色体等。
酶体定向克隆技术常用于基因工程研究，用于将外源基因导入到宿主细胞中，并在宿主细胞中表达和复制。
重组dna技术的主要步骤
重组dna技术的主要步骤
重组DNA技术，顾名思义就是利用先进的分子生物学技术，通过可重组DNA来改变生命体的基因组成，从而达到一定的治疗或者研究目的。
具体来说，重组DNA技术主要包括以下几个步骤：
1. DNA片段的制备
首先，需要从不同来源中提取目标DNA，包括人、动物、植物、细菌等等。
一般来说，利用DNA电泳和酶切等技术可将DNA分离和切割成不同大小的片段。
2. DNA片段的连接
将不同来源的DNA片段进行互相连接，使新的DNA构建成为完整的基因，这个过程中需要用到DNA连接酶。
3.外源DNA的插入
在DNA连接完成后，需要将新的DNA插入到宿主细胞中，一般采用电转化或者病毒载体等方法。
这样，就可以让宿主细胞在分裂生长中
继承新的基因组成。
4.筛选和鉴定
完成DNA插入后，需要对宿主细胞进行筛选和鉴定，以确认是否达到预期，例如涉及到治疗目的的，需要保证插入的新基因没有负面的作
用和反应，同时还需要对新基因的表达和功能进行一定的检测和评估。
总之，重组DNA技术是目前分子生物学领域中的一项重要技术，在治疗癌症、传染病等方面有着广泛的应用前景。
虽然存在着一定的道德
和伦理问题，但只要合理使用和监管，相信它将会成为人类健康和生
命发展的重要基石。
DNA重组技术
DNA重组技术不同来源的DNA分子，通过磷酸二酯键连接而重新组合的过程，称为DNA重组（DNA recombination）。
重组DNA技术（recombinant DNA technology）作为分子生物学的一项重要技术得到了迅速的发展。
利用重组DNA技术对DNA分子进行剪切和重新连接，构成重组DNA分子，然后把它导入宿主细胞，进而扩增相关DNA片段，表达相关基因的产物，是进行基因功能研究的基本方法。
克隆（clone）是指由一个细胞经过无性繁殖以后形成的子代群体。
构建DNA重组体并导入宿主细胞建立无性繁殖体系，即DNA的分子克隆（molecular cloning）过程。
因此，重组DNA技术又称为分子克隆技术或基因工程技术，其具体过程大致为分、切、连、转、筛选。
即分离纯化目的质粒载体、用限制性内切酶酶切纯化的载体、酶切后的载体与靶基因片段的连接、构建质粒载体转染感受态菌、筛选阳性克隆。
载体选择载体（vector）是携带靶DNA（目的DNA）片段进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具。
常用的载体是通过改造天然的细菌质粒、噬菌体和病毒等构建而成。
目前已构建成的载体主要有质粒载体、噬菌体载体、病毒载体和人工染色体等多种类型，亦可根据其用途不同分为克隆载体和表达载体二类。
载体的构建和选择应考虑以下几个主要的条件：①在宿主细胞中具有自主复制能力或能整合到宿主染色体上与基因组一同复制的能力；②有合适的限制性酶切位点供外源DNA片段插入，多种酶单一位点使载体在使用上具有较大的灵活性；③分子量不宜过大，以便于容纳较大的外源DNA片段并获得较高的拷贝数，也有利于体外重组操作。
④具有合适的筛选标记，以便区分阳性重组体和阴性重组体，常用的筛选标记有抗药性、酶基因、营养缺陷型或形成噬菌斑的能力等。
⑤配备与宿主相适应的调控元件，如启动子、增强子和前导序列等。
本试验选择高拷贝型pGEM载体系列的pGEM-3Zf(+)为基础载体，它含有Lac Z基因编码区、SP6、T7RNA聚合酶启动子和其间的多克隆区域（见图），能在离体情况下合成ssDNA或RNA由于构建DNA或RNA探针的构建。
分子生物学技术之DNA重组技术( 35张)
AmpR
优点是具有较小的分子量，其长度为4 363bp。 不仅易于纯化，而且即使携带上一段6-8kb的外 源DNA片段，操作起来仍较为便利。
具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的选择 记号。有较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增， 每个细胞中可累积1000~3000个拷贝，为重组体 DNA的制备提供了极大的方便。
大肠杆菌质粒载体: 1、pSC101质粒载体
• 低拷贝数严紧型复制控制的大肠杆菌质粒载 体，平均每个寄主细胞仅有1~2个拷贝。
• 长9.09kb，带有四环素抗性基因（tetr）及 EcoRI 、 HindIII 、 BamHI 、 SalI 、 XhoI 、 PvuII以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的 单酶切位点，在HindIII、BamHI和SalI等3 个位点插入外源基因，会导致tetr失活。
4、pUC质粒载体（包括四个部分）：
(i)来自pBR322质粒的复制起点（ori）；
(ii)氨苄青霉素抗性基因（ampr）；
(iii)大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启动 子及其编码α-肽链的DNA序列，此结构特称 为lacZ’基因；
(iv)位于lacZ ’基因中的靠近5’-端的一段多克 隆位点（MCS）区段，外源基因插入后破坏 了lacZ ’基因的功能。
5.1 基因操作的基本工具 （一）限制性核酸内切酶
能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位 点切开DNA分子。
第 一 个 核 酸 内 切 酶 EcoRI 是 Boyer 实 验 室 在 1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序 列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生 具有粘性末端的小片段。
大肠杆菌 pSC101 质粒载体 示意图。
DNA重组技术在生物医学中的应用
DNA重组技术在生物医学中的应用DNA重组技术是现代分子生物学中一个非常重要的技术，它可以用于分析、操作、克隆和修饰DNA序列。
随着现代科技的不断发展，DNA重组技术也被应用于许多生物医学领域，如基因治疗、诊断、药物研发等等。
基因治疗是一个利用DNA重组技术来治疗一系列遗传疾病的新领域。
目前已经有一些遗传疾病可以通过基因治疗来治疗，例如严重联合免疫缺陷症（SCID）、家族性高胆固醇（FH）等等。
基本上，基因治疗的原理是将有效和健康的基因导入患者身体内，以替代或修复那些有缺陷的基因。
这可以通过多种方式实现，比如将有效基因直接注入患者体内、利用载体将有效基因送入患者细胞内或在患者体内激活一种“睡眠”的有效基因等等。
DNA重组技术也可以用于癌症的治疗，这是因为DNA重组技术可以帮助设计出更加适合治疗癌症的药物。
例如，科学家们可以利用DNA重组技术来创建更有效的药物，这些药物可以针对癌症细胞中存在的一些变化的基因来进行治疗。
这些治疗方法也被称为“靶向治疗”，因为它们专门攻击癌细胞而不会对健康细胞产生影响。
靶向治疗在肺癌、乳腺癌等一些癌症疾病的治疗中已经有了显著的成果。
DNA重组技术也可以被用于生物医学领域的诊断。
PCR（聚合酶链式反应）技术结合了DNA重组技术，可以在极短时间内扩增任何形式的DNA片段。
这种技术可以应用于许多实验室测试中，如检测病原体、检测物种DNA、检测个体特定基因等等。
此外，PCR技术可以结合DNA序列特异性结合的荧光探针来进行实时荧光定量PCR，使得医师可以快速地检测出某些疾病的存在。
DNA重组技术的应用还涉及到药物研发领域。
许多药物的研发过程需要精确对疾病的基因组进行分析和研究。
通过了解疾病基因组序列，科学家可以通过DNA重组技术创建具有针对性的药物，这可以帮助研发新的治疗方法和更有效的药物。
总之，DNA重组技术已成为现代医学领域中最具有前景的技术之一。
它可以帮助科学家们更深入地研究复杂的遗传问题，设计和改进用于治疗癌症、遗传疾病和其他疾病的治疗方法，加速药物研发过程，提高医学诊断水平等等。
《重组DNA技术》课件
合成生物学
通过合成DNA来构建新的生物 系统。
个性化医疗
根据个体基因信息制定个性化 治疗方案。
1 优势
能够精确操纵DNA序列，有很大的应用潜力。
2 挑战
涉及伦理和法律问题，需要审Fra bibliotek使用和监管。重组DNA技术的伦理和法律问题
1 隐私与安全
个人基因信息的保护和使 用。
2 知识产权
重组DNA技术的专利保护 和共享。
3 道德问题
生命伦理和人类基因改造 的道德考量。
重组DNA技术的未来发展趋势
基因组编辑
重组DNA技术的原理和步骤
1
1. DNA剪切
使用限制性内切酶切割DNA分子，产生特定的DNA片段。
2
2. DNA连接
将不同来源的DNA片段连接起来，形成重组DNA。
3
3. DNA修饰
可以进行DNA序列的修饰，例如插入或删除特定DNA序列。
常见的重组DNA技术方法
PC R
聚合酶链反应，用于扩增 DNA序列。
《重组DNA技术》PPT课 件
DNA重组技术是通过将不同来源的DNA分子进行切割、连接和修饰的一项技 术。它在现代生物技术和分子生物学领域有着广泛的应用。
DNA重组技术的定义
1 基因重组
通过DNA重组技术，可以将不同的基因组合到一起，产生新的基因组。
2 DNA重组
DNA重组技术包括以特定方式剪切、连接和修饰DNA分子，以改变其序列和功能。
蛋白质表达系统
利用重组DNA技术制备大量 特定蛋白质。
基因编辑技术
例如CRISPR-Cas9，用于精 确编辑DNA序列。
重组DNA技术的应用领域
生物技术制药-DNA重组技术
分离病毒颗粒
培养转化细胞、收集菌体
病毒载体DNA分离与纯化
破碎细胞
质粒DNA分离与纯化
ＤＮＡ分子的体外连接 目标DNA片断插入载体
ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下， 由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片 段组邻的５’端磷酸与３’端羟基之间 形成磷酸酸脂键的生物化学过程， ＤＮ Ａ分子的连接是在酶切反应获得同种酶 互补序列基础上进行的。
植物细胞 动物细胞 微生物细胞：细菌和真菌
（1）将目的基因导入植物细胞 双子叶植物—农杆菌转化法
（1）将目的基因导入植物细胞 单子叶植物—基因枪法
（1）将目的基因导入植物细胞
转基因抗虫棉－花粉管通道法
（2）将目的基因导入动物细胞
显微注射法
（3）将目的基因导入大肠杆菌细胞
质粒转化法：
用CaCl2处理大肠杆菌细胞 感受态大肠杆菌细 胞 重组载体与之混合 重组载体感染感受态 细胞（目的基因进入大肠杆菌细胞）
ⅰ. 超速离心：利用两种DNA分子的大小和空间构型 ⅱ. 变性法：在变性条件下使染色体DNA变为单链，而质 粒DNA仍保持环状结构，当变性条件发生迅速变化时，前 者仍不能复性，而后者又可回复到天然构型。 变性条件可采用加热煮沸法或碱变性法
载体DNA分离的一般程序
载体DNA
感染或转染细胞（病毒型）
转化细菌细胞（质粒型）
分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一
起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定
的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形
成杂化双链(heteroduplex) 。
复性
RNA
DNA
（一）印迹技术 （二）探针技术
探针 (probe)
一小段用同位素、生物素或荧光染料标
生物化学课件 第二章 重组DNA技术
43
克隆载体(cloning vector) 为使插入的外源DNA序列被扩增而特意设 计的载体称为克隆载体。 表达载体(expression vector) 为使插入的外源DNA序列可转录翻译成多
特点 以mRNA作为模板,以dNTP为底物， RNA指导 的DNA聚合酶 (RDDP，RNA-dependent DNA polymerase ) 种类：禽成髓细胞瘤病毒（AMV） Moloney鼠白血病病毒（Mo-MLV) 用途： （1）逆转录合成cDNA （2）补平或标记5’粘端 （3）DNA测序 （4）制备探针
库建立时除去RNA链以便第二条链cDNA链的合成。
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（三）DNase I
1. 特点：
内切酶，作用于ds -DNA，但无核苷酸序列特 异型（随机切割），产生5’-磷酸脱氧寡核苷酸。
2. 用途：
1) 切口平移法，制备DNA探针 2) 制备RNA样品时除去DNA分子 3) 基因突变时产生切口
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重组DNA技术中常用的工具酶
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3、Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase )
特点：耐热的DNA聚合酶，最佳作用温度75-80C。 具有5’3’聚合酶和5’3’外切酶活性，缺 乏3’ 5’ 外切酶活性，因而无校正阅读功能。
用途：（1）PCR
（2）DNA序列测定
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4、逆转录酶(Reverse Transcriptase ,RTase)
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T4多核苷酸激酶 (T4 polynucleotide kinase)
催化将 ATP 的 γ- 磷酸转移到DNA链的 5’ -末端。 用途： （1）放射性标记DNA链的5’ -末端，用于DNA 测序或探针制备。 （2）将人工接头和其它没有 5’ -末端磷酸的
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•大肠杆 菌 pSC101 质粒载体 示意图。
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•是第一个真核基因克隆载体。缺点：它是一种 严紧型复制控制的低拷贝质粒，从带有该质粒 的寄主细胞中提取pSC101 DNA，产量很低。
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• 2、ColE1质粒载体
•第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在 1972年发现的，它能特异性识别GAATTC序 列，将双链DNA分子在这个位点切开并产生 具有粘性末端的小片段。
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•图5-1 几种主要DNA内切酶所识别的序列及
其酶切末端。
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• 松弛型复制控制的多拷贝质粒。
• 一般情况下，当培养基中氨基酸被耗尽，或 是在细胞培养物中加入氯霉素以抑制蛋白质 的合成，寄主染色体DNA的复制便被抑制， 细胞的生长也随之停止。
• 而松弛型质粒DNA却继续复制数小时，使每
个寄主细胞中ColE1质粒的拷贝数达到
1000~3000个，占细胞总DNA的50%左右。
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•AmpR
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•优点是具有较小的分子量，其长度为4 363bp。 不仅易于纯化，而且即使携带上一段6-8kb的外 源DNA片段，操作起来仍较为便利。
•具有两种抗生素抗性基因以用作转化子的选择 记号。有较高的拷贝数，若经过氯霉素扩增， 每个细胞中可累积1000~3000个拷贝，为重组体 DNA的制备提供了极大的方便。
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•基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或 其它载体分子，构成遗传物质的新组合，使之进入 原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的 繁殖和表达。
•基因工程技术是核酸操作技术的一部分，只不过它 强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的 繁衍与性状表达。
•事实上，这种跨越物种屏障、把来自其它生物的基 因置于新的寄主生物细胞之中的能力，是基因工程 技术区别于其它技术的根本特征。
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•4、pUC质粒载体（包括四个部分）：
•(i)来自pBR322质粒的复制起点（ori）；
•(ii)氨苄青霉素抗性基因（ampr）；
•(iii)大肠杆菌β-半乳糖酶基因（lacZ）的启 动子及其编码α-肽链的DNA序列，此结构特 称为lacZ’基因；
•(iv)位于lacZ ’基因中的靠近5’-端的一段多克 隆位点（MCS）区段，外源基因插入后破坏 了lacZ ’基因的功能。
• 低拷贝数严紧型复制控制的大肠杆菌质粒载 体，平均每个寄主细胞仅有1~2个拷贝。
• 长9.09kb，带有四环素抗性基因（tetr）及
EcoRI、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、
PvuII以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的
单酶切位点，在HindIII、BamHI和SalI等3
个位点插入外源基因，会导致tetr失活。
分子生物学技术之DNA 重组技术
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2020年4月10日星期五
•现代分子生物学的快速发展，得益于上个世 纪中叶以来研究方法、特别是基因操作和基 因工程技术的进步。
•基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、 杂交、电泳、细胞转化、核酸序列分析以及 基因人工合成、表达、定点突变和PCR扩增 等，是分子生物学研究的核心技术。
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•（二）基因克隆的载体
• 我们知道仅仅能在体外利用限制性核酸内 切酶和DNA连接酶进行DNA的切割和重组 ，还远远不能满足基因工程的要求，因为大 多数 DNA片段不具备自我复制的能力，只 有将他们连接到具备自主复制能力的DNA分 子上，才能在寄主细胞中进行繁殖。
•载体（vector)是指具备自主复制的DNA分子 ，象病毒、噬菌体和质粒等相对分子量较小的 复制子均可以作为基因导入的载体。
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•三、50年代末至60年代，相继提出了“中心法 则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码，阐 明了遗传信息的流动与表达机制。
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•5.1 基因操作的基本工具 •（一）限制性核酸内切酶
•能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位 点切开DNA分子。
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•3、pBR322质粒载体
•由三个不同来源的部分组成的：
•第一部分来源于pSF2124质粒易位子Tn3的氨 苄青霉素抗性基因（AmpR）；
•第二部分来源于pSC101质粒的四环素抗性基 因（tetr）；
•第三部分则来源于ColE1的派生质粒pMB1的 DNA复制起点（ori）。
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•优点：
• 更小的分子量和更高的拷贝数。在pBR322 基础上构建pUC质粒载体时，仅保留下其中的 氨苄青霉素抗性基因及复制起点，其分子小了 许多，pUC8为2750bp，pUC18为2686bp。由 于缺失rop基因，pUC质粒不经氯霉素扩增时
，平均每个细胞即可达500~700个拷贝。
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•重组DNA技术发展史上的重大事件 •三大成就： •一、在20世纪40年代确定了遗传信息的携 带者、即基因的分子载体是DNA而不是蛋白 质，解决了遗传的物质基础问题；
•二、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构
模型和半保留复制机制,解决了基因的自我
复制和世代交替问题；
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•可用组织化学方法检测重组体。pUC8质粒结 构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ‘基因， 所编码的α-肽链可参与α-互补作用。因此，可 用X-gal显色法实现对重组体转化子的鉴定。
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• 载体三要素：
• 自我复制能力；
• 携带外源基因片段大小（具有较小的分子 量和较高的拷贝数）；
• 插入位点多少（具有若干限制酶单一识别 位点）；
• 易于鉴定识别（具有抗菌素抗性基因）
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• 大肠杆菌质粒载体: • 1、pSC101质粒载体