单克隆抗体&疾病诊断
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
单克隆抗体
• 中文名称：
• 英文名称： • 定义1：
– 单克隆抗体 – monoclonal antibody;McAb;mAb – 高度均质性的特异性抗体，由一个识别单一抗原表位的B细胞克隆所分泌。 一般来自杂交瘤细胞。 – 免疫学（一级学科）；免疫系统（二级学科）；免疫分子（三级学科） – 只识别一种表位(抗原决定簇)的抗体，来自单个Ｂ淋巴细胞的克隆或一个 杂交瘤细胞的克隆。 – 生物化学与分子生物学（一级学科）；总论（二级学科） – 由单一杂交瘤细胞克隆分泌的只能识别一种表位（抗原决定簇）的高纯度 抗体。 – 细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科）
• 应用学科：
• 定义2：
• 应用学科：
• 定义3：
• 应用学科：
What单克隆抗体
• 动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，具有不 同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体 受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激 活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分 裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞， 大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分 布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专 一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经 分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞 将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆 抗体。
成就
• • 国外： 自1975年建立B淋巴细胞杂交瘤制备McAb成功以来，到现在的近30年间，又做了大 量的工作，并取得了明显的进展。美、英、日、法等国于1978年起先后建立了 McAb公司100多家，并于1979年将第一个杂交瘤产品供应市场，现已有几十种杂交 瘤细胞株和几百种McAb商品化，投入市场。现在全世界已有1 000多个实验室从事 这方面的研究工作，并形成一股McAb“生产热”，估计全世界研究建立的杂交瘤细 胞株数已达5万种以上。为交流总结McAb的研究工作经验，在法国Bussard教授的 倡议下，组成了“国际杂交瘤细胞专家委员会”，附属在国际免疫学会中；还建立 了一个“国际杂交瘤细胞及其产物McAb资料数据库”，专门搜集有关杂交瘤细胞的 信息，并回答各种咨询。 国内： 1. 至今，国内外报道的动物用单抗已达数百种，据不完全统计，其中针对畜禽病原 体的有163种，几乎包括了国内外严重流行的大多数传染病和寄生虫病。另有36种分 别针对14种动物(包括人)的免疫球蛋白单抗，另外57种分别是针对动物激素、独特 型和动物组织抗原等的单抗。这些单抗试剂主要用于下列几个方面：①用于生物医 学各学科的基础研究；②用于疾病的诊断、检疫及流行病学研究；③用于疾病预防 与治疗；④用于生物活性物质的提取；⑤用于妊娠诊断，性别鉴定和鉴别控制，促 进畜禽生长，提高家畜繁殖力等。 我国动物用单抗的研究发展亦很快，取得了多项研究成果，有的已在较大范围推广 应用，获得了显著的经济效益和社会效益，如马传染性贫血单抗诊断试剂盒和旋毛 虫单抗快速ELISA诊断试剂盒，另有10多种单抗试剂盒已完成或即将完成开发研究。
• Second.动物用McAb的应用领域要拓宽分析上述动物用单抗的类别， 不难看出动物用单抗研究存在很大的不平衡，有许多空白尚需填补， 如有一些主要传染病(包括人兽共患病)的病原体单抗还未研制；对于 寄生虫病病原单抗、真菌毒素单抗，以及水产业的动物病原体单抗和 生物毒素单抗、畜禽繁殖育种用单抗等国内外的研究仍处于起步阶段， 应予加强；对于畜牧兽医科学中其他学科亦应多加引入单抗技术的应 用研究，这样将更加广泛深入地促进相关学科的发展。另一方面，动 物用单抗的基础研究方面应有重点的解决一些关键问题。以动物传染 病为例，单抗与分子生物学的有机结合将越来越深入地揭示动物传染 病病原体的分子病理发生机制、抗原结构，以及特定的致病基因等。 而单抗在基因工程中的应用，加快了基因工程疫苗的研究进程。此外， 在动物传染病治疗性和预防性单抗研究仍有许多方面需要探索。 3. 研制新型抗体新型抗体是利用生物技术改建和生产的抗体，包括嵌合 抗体、重构抗体、单链抗体、单域抗体、抗独特型抗体及酶抗体等。 新型抗体的研究不仅具有重要的理论价值，而且在疾病的预防和诊疗 上的意义也日趋明显。新型抗体的研究与生产将克服常规单抗技术的 繁琐过程，不仅扩大了抗体的应用功能，而且为产业化生产带来了便 利。因此，应积极开展动物用新型抗体的研究。
单克隆抗体的提纯＆保存
• 一般常用金黄色葡萄球菌蛋白A－琼脂糖4B亲 和层析法。 • 单克隆抗体的保存 由腹水中获得的抗体,经离 心去除细胞成分，再经冷冻超速离心,取上清液加 0.1％NaN3，少量分装，冷冻于-70℃可保存几年。 但应避免反复冻融,否则抗体失活，特别是IgM抗 体。提纯的单克隆抗体,冷冻干燥保存于2～8℃， 取出时溶解后，保存于2～8℃，至少一个月内可 保持稳定。腹水抗体也可冷冻干燥低温(4℃)保存 两年，融化后放臵4℃下保存一个月。短期使用的 腹水抗体，4℃3～4 个月仍保持稳定, 培养上清加 0.1％NaN3，贮于-20℃，两年不失活性。
杂 交 瘤 技 术
单 克 隆 抗 体 的 制 备
Leabharlann Baidu
单克隆抗体的应用
• • • • • 检验医学诊断试剂 蛋白质的提纯 小分子抗体的应用 抗体融合蛋白的应用 双特异抗体的应用
检验医学诊断试剂
• • • • • 病原微生物抗原、抗体的检测 肿瘤抗原的检测 免疫细胞及其亚群的的检测 激素测定 细胞因子的测定
How制备单克隆抗体
1）免疫脾细胞的制备 2）骨髓瘤细胞的培养与筛选
3）细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。2融合试验最大的失败原因是 污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。
4）阳性克隆的筛选 应尽早进行。 5）克隆化 6）细胞的冻存与复苏 7）大规模单克隆抗体的制备 选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培 养时间延长，发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是 增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的 仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。最普遍采用的是小 鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射， 一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只 小鼠可收集5～10ml的腹水，有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可 达数毫克甚至数十毫克水平。此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。
•
动物用单克隆抗体的发展前景
• First.动物用McAb必须走向产业化今后动物用单抗的研究重点应放在 产业化上，将现有成果转化为生产力。目前，我国动物用单抗的成果 大多数还没有产业化，其实现产业化的进程总体上很缓慢。为此，要 加速这一进程，下列几点必须引起重视。要突破“单抗建株、鉴定” 的研究框架，从研究工作开始，就应着眼其应用价值，这一问题主管 部门和研究人员都要重视。在很多方面，单抗的应用要解决的技术问 题更多更复杂，其所需的人力、物力、财力的投入亦较大。要选准产 业化的目标，以点带面，上述数百种单抗其开发应用价值不尽一致， 作为动物用单抗开发的产品，应具备一定的条件，以针对畜禽疾病单 抗试剂为例，应包括单抗针对的疾病流行范围广、发病率高、经济意 义大，或有重要的公共卫生意义；单抗能解决常规诊断试剂无法解决 的问题，如在临床上区分强毒感染和疫苗毒感染所引起的免疫应答； 单抗的适用性要大等，目前，口蹄疫、猪瘟、新城疫、伪狂犬病、鸡 传染性法氏囊病、沙门氏菌病、布鲁氏菌病、钩端螺旋体病、弓形虫 病、大肠杆菌病、畜禽Ig单抗等诊断盒应在短期内完成产业化进程。 建立产品基地，区域试验基地，促进单抗试剂的产业化。理顺单抗试 剂与常规诊断试剂、核酸探针的关系。
四、抗体融合蛋白的应用
肿瘤的体内显像诊断 单链抗体排除速度快，穿透力强，在肿瘤 组织中的分布指数较完整抗体分子高 放射显像时，放射性核素排除较快，对身 体危害程度小，显像的本底较低 理想的显像定位诊断载体 病毒的诊断和抗病毒感染 血液性疾病的诊断 白血病的免疫诊断及分型
五、双特异抗体的应用
在体外免疫检测中的应用 自身红细胞凝集试验 快速检测HBV和HIV病原体等 避免化学交联减低两者的活性，从而提高酶免疫检测的敏感度 用双特异抗体作为二抗，检测限达1ng/ml 在体内肿瘤放射免疫显像诊断中的应用 方法： 双特异抗体的一只臂结合靶抗原，一只臂结合半抗原螯合 剂，后者可选择性地与放射性核素结合，利用二次导向系统 显示 特点： 更高的的灵敏度和清晰度 在体内免疫治疗中的应用 抗体分子可与放射性核素、细胞毒药物、毒素、等多种分子相 融合，这些分子在抗体结合靶分子后可提供重要辅助功能 双功能抗体可有效针对低水平的肿瘤相关抗原，并将细胞毒物 质输送到肿瘤细胞 抗体还可与携带药物的脂质体、各种PEG偶联，从而增强体内 运输和药代动力学
二 、 蛋 白 质 的 提 纯
三、小分子抗体的应用
定义： 分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段 优点： 分子量小,穿透性强,抗原性低 不含Fc段，不会与带有Fc段受体的细胞结合，不 良反应少 可在原核系统表达及易于基因工程操作 半衰期短，有利于及时中和及清除毒素 应用： 用于肿瘤的导向治疗 肿瘤的影像分布 基因治疗 细胞内抗体： 在细胞内表达 特异性识别某一基因产物 可干扰该基因产物的生物活性 研究基因结构与功能的关系
病原体测定： 肝炎病毒－HAV,HBV,HCV,HDV,HEV TORCH－弓形虫,风疹病毒,巨细胞病毒 ，单纯疱疹 病毒 细胞表面CD测定： CD4/CD8:Th/Tc 白血病的分型 激素的测定： 内分泌疾病的诊断 药物测定(TDM)： 抗排斥药物抗肿瘤药物地高辛
免疫沉淀
MACS
单克隆抗体是亲和层析中重要 的配体。将单克隆抗体吸附在 一个惰性的固相基质（如 Speharose 2B、4B、6B等） 上，并制备成层析柱。当样品 流经层析柱时，待分离的抗原 可与固相的单克隆抗体发生特 异性结合，其余成分不能与之 结合。将层析柱充分洗脱后， 改变洗脱液的离子强度或pH， 欲分离的抗原与抗体解离，收 集洗脱液便可得到欲纯化的抗 原。
• 中文名称：
• 英文名称： • 定义1：
– 单克隆抗体 – monoclonal antibody;McAb;mAb – 高度均质性的特异性抗体，由一个识别单一抗原表位的B细胞克隆所分泌。 一般来自杂交瘤细胞。 – 免疫学（一级学科）；免疫系统（二级学科）；免疫分子（三级学科） – 只识别一种表位(抗原决定簇)的抗体，来自单个Ｂ淋巴细胞的克隆或一个 杂交瘤细胞的克隆。 – 生物化学与分子生物学（一级学科）；总论（二级学科） – 由单一杂交瘤细胞克隆分泌的只能识别一种表位（抗原决定簇）的高纯度 抗体。 – 细胞生物学（一级学科）；细胞培养与细胞工程（二级学科）
• 应用学科：
• 定义2：
• 应用学科：
• 定义3：
• 应用学科：
What单克隆抗体
• 动物脾脏有上百万种不同的B淋巴细胞系，具有不 同基因不同的B淋巴细胞合成不同的抗体。当机体 受抗原刺激时，抗原分子上的许多决定簇分别激 活各个具有不同基因的B细胞。被激活的B细胞分 裂增殖形成效应B细胞（浆细胞）和记忆B细胞， 大量的浆细胞克隆合成和分泌大量的抗体分子分 布到血液、体液中。如果能选出一个制造一种专 一抗体的浆细胞进行培养，就可得到由单细胞经 分裂增殖而形成细胞群，即单克隆。单克隆细胞 将合成针对一种抗原决定簇的抗体，称为单克隆 抗体。
成就
• • 国外： 自1975年建立B淋巴细胞杂交瘤制备McAb成功以来，到现在的近30年间，又做了大 量的工作，并取得了明显的进展。美、英、日、法等国于1978年起先后建立了 McAb公司100多家，并于1979年将第一个杂交瘤产品供应市场，现已有几十种杂交 瘤细胞株和几百种McAb商品化，投入市场。现在全世界已有1 000多个实验室从事 这方面的研究工作，并形成一股McAb“生产热”，估计全世界研究建立的杂交瘤细 胞株数已达5万种以上。为交流总结McAb的研究工作经验，在法国Bussard教授的 倡议下，组成了“国际杂交瘤细胞专家委员会”，附属在国际免疫学会中；还建立 了一个“国际杂交瘤细胞及其产物McAb资料数据库”，专门搜集有关杂交瘤细胞的 信息，并回答各种咨询。 国内： 1. 至今，国内外报道的动物用单抗已达数百种，据不完全统计，其中针对畜禽病原 体的有163种，几乎包括了国内外严重流行的大多数传染病和寄生虫病。另有36种分 别针对14种动物(包括人)的免疫球蛋白单抗，另外57种分别是针对动物激素、独特 型和动物组织抗原等的单抗。这些单抗试剂主要用于下列几个方面：①用于生物医 学各学科的基础研究；②用于疾病的诊断、检疫及流行病学研究；③用于疾病预防 与治疗；④用于生物活性物质的提取；⑤用于妊娠诊断，性别鉴定和鉴别控制，促 进畜禽生长，提高家畜繁殖力等。 我国动物用单抗的研究发展亦很快，取得了多项研究成果，有的已在较大范围推广 应用，获得了显著的经济效益和社会效益，如马传染性贫血单抗诊断试剂盒和旋毛 虫单抗快速ELISA诊断试剂盒，另有10多种单抗试剂盒已完成或即将完成开发研究。
• Second.动物用McAb的应用领域要拓宽分析上述动物用单抗的类别， 不难看出动物用单抗研究存在很大的不平衡，有许多空白尚需填补， 如有一些主要传染病(包括人兽共患病)的病原体单抗还未研制；对于 寄生虫病病原单抗、真菌毒素单抗，以及水产业的动物病原体单抗和 生物毒素单抗、畜禽繁殖育种用单抗等国内外的研究仍处于起步阶段， 应予加强；对于畜牧兽医科学中其他学科亦应多加引入单抗技术的应 用研究，这样将更加广泛深入地促进相关学科的发展。另一方面，动 物用单抗的基础研究方面应有重点的解决一些关键问题。以动物传染 病为例，单抗与分子生物学的有机结合将越来越深入地揭示动物传染 病病原体的分子病理发生机制、抗原结构，以及特定的致病基因等。 而单抗在基因工程中的应用，加快了基因工程疫苗的研究进程。此外， 在动物传染病治疗性和预防性单抗研究仍有许多方面需要探索。 3. 研制新型抗体新型抗体是利用生物技术改建和生产的抗体，包括嵌合 抗体、重构抗体、单链抗体、单域抗体、抗独特型抗体及酶抗体等。 新型抗体的研究不仅具有重要的理论价值，而且在疾病的预防和诊疗 上的意义也日趋明显。新型抗体的研究与生产将克服常规单抗技术的 繁琐过程，不仅扩大了抗体的应用功能，而且为产业化生产带来了便 利。因此，应积极开展动物用新型抗体的研究。
单克隆抗体的提纯＆保存
• 一般常用金黄色葡萄球菌蛋白A－琼脂糖4B亲 和层析法。 • 单克隆抗体的保存 由腹水中获得的抗体,经离 心去除细胞成分，再经冷冻超速离心,取上清液加 0.1％NaN3，少量分装，冷冻于-70℃可保存几年。 但应避免反复冻融,否则抗体失活，特别是IgM抗 体。提纯的单克隆抗体,冷冻干燥保存于2～8℃， 取出时溶解后，保存于2～8℃，至少一个月内可 保持稳定。腹水抗体也可冷冻干燥低温(4℃)保存 两年，融化后放臵4℃下保存一个月。短期使用的 腹水抗体，4℃3～4 个月仍保持稳定, 培养上清加 0.1％NaN3，贮于-20℃，两年不失活性。
杂 交 瘤 技 术
单 克 隆 抗 体 的 制 备
Leabharlann Baidu
单克隆抗体的应用
• • • • • 检验医学诊断试剂 蛋白质的提纯 小分子抗体的应用 抗体融合蛋白的应用 双特异抗体的应用
检验医学诊断试剂
• • • • • 病原微生物抗原、抗体的检测 肿瘤抗原的检测 免疫细胞及其亚群的的检测 激素测定 细胞因子的测定
How制备单克隆抗体
1）免疫脾细胞的制备 2）骨髓瘤细胞的培养与筛选
3）细胞融合的关键: 1技术上的误差常常导致融合的失败。2融合试验最大的失败原因是 污染，融合成功的关键是提供一个干净的环境，以及适宜的无菌操作技术。
4）阳性克隆的筛选 应尽早进行。 5）克隆化 6）细胞的冻存与复苏 7）大规模单克隆抗体的制备 选出的阳性细胞株应及早进行抗体制备，因为融合细胞随培 养时间延长，发生污染、染包体丢失和细胞死亡的机率增加。抗体制备有两种方法。一是 增量培养法，即将杂交瘤细胞在体外培养，在培养液中分离单克隆抗体。该法需用特殊的 仪器设备，一般应用无血清培养基，以利于单克隆抗体的浓缩和纯化。最普遍采用的是小 鼠腹腔接种法。选用BALB/c小鼠或其亲代小鼠，先用降植烷或液体石蜡行小鼠腹腔注射， 一周后将杂交瘤细胞接种到小鼠腹腔中去。通常在接种一周后即有明显的腹水产生，每只 小鼠可收集5～10ml的腹水，有时甚至超过40ml。该法制备的腹水抗体含量高，每毫升可 达数毫克甚至数十毫克水平。此外，腹水中的杂蛋白也较少，便于抗体的纯化。
•
动物用单克隆抗体的发展前景
• First.动物用McAb必须走向产业化今后动物用单抗的研究重点应放在 产业化上，将现有成果转化为生产力。目前，我国动物用单抗的成果 大多数还没有产业化，其实现产业化的进程总体上很缓慢。为此，要 加速这一进程，下列几点必须引起重视。要突破“单抗建株、鉴定” 的研究框架，从研究工作开始，就应着眼其应用价值，这一问题主管 部门和研究人员都要重视。在很多方面，单抗的应用要解决的技术问 题更多更复杂，其所需的人力、物力、财力的投入亦较大。要选准产 业化的目标，以点带面，上述数百种单抗其开发应用价值不尽一致， 作为动物用单抗开发的产品，应具备一定的条件，以针对畜禽疾病单 抗试剂为例，应包括单抗针对的疾病流行范围广、发病率高、经济意 义大，或有重要的公共卫生意义；单抗能解决常规诊断试剂无法解决 的问题，如在临床上区分强毒感染和疫苗毒感染所引起的免疫应答； 单抗的适用性要大等，目前，口蹄疫、猪瘟、新城疫、伪狂犬病、鸡 传染性法氏囊病、沙门氏菌病、布鲁氏菌病、钩端螺旋体病、弓形虫 病、大肠杆菌病、畜禽Ig单抗等诊断盒应在短期内完成产业化进程。 建立产品基地，区域试验基地，促进单抗试剂的产业化。理顺单抗试 剂与常规诊断试剂、核酸探针的关系。
四、抗体融合蛋白的应用
肿瘤的体内显像诊断 单链抗体排除速度快，穿透力强，在肿瘤 组织中的分布指数较完整抗体分子高 放射显像时，放射性核素排除较快，对身 体危害程度小，显像的本底较低 理想的显像定位诊断载体 病毒的诊断和抗病毒感染 血液性疾病的诊断 白血病的免疫诊断及分型
五、双特异抗体的应用
在体外免疫检测中的应用 自身红细胞凝集试验 快速检测HBV和HIV病原体等 避免化学交联减低两者的活性，从而提高酶免疫检测的敏感度 用双特异抗体作为二抗，检测限达1ng/ml 在体内肿瘤放射免疫显像诊断中的应用 方法： 双特异抗体的一只臂结合靶抗原，一只臂结合半抗原螯合 剂，后者可选择性地与放射性核素结合，利用二次导向系统 显示 特点： 更高的的灵敏度和清晰度 在体内免疫治疗中的应用 抗体分子可与放射性核素、细胞毒药物、毒素、等多种分子相 融合，这些分子在抗体结合靶分子后可提供重要辅助功能 双功能抗体可有效针对低水平的肿瘤相关抗原，并将细胞毒物 质输送到肿瘤细胞 抗体还可与携带药物的脂质体、各种PEG偶联，从而增强体内 运输和药代动力学
二 、 蛋 白 质 的 提 纯
三、小分子抗体的应用
定义： 分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段 优点： 分子量小,穿透性强,抗原性低 不含Fc段，不会与带有Fc段受体的细胞结合，不 良反应少 可在原核系统表达及易于基因工程操作 半衰期短，有利于及时中和及清除毒素 应用： 用于肿瘤的导向治疗 肿瘤的影像分布 基因治疗 细胞内抗体： 在细胞内表达 特异性识别某一基因产物 可干扰该基因产物的生物活性 研究基因结构与功能的关系
病原体测定： 肝炎病毒－HAV,HBV,HCV,HDV,HEV TORCH－弓形虫,风疹病毒,巨细胞病毒 ，单纯疱疹 病毒 细胞表面CD测定： CD4/CD8:Th/Tc 白血病的分型 激素的测定： 内分泌疾病的诊断 药物测定(TDM)： 抗排斥药物抗肿瘤药物地高辛
免疫沉淀
MACS
单克隆抗体是亲和层析中重要 的配体。将单克隆抗体吸附在 一个惰性的固相基质（如 Speharose 2B、4B、6B等） 上，并制备成层析柱。当样品 流经层析柱时，待分离的抗原 可与固相的单克隆抗体发生特 异性结合，其余成分不能与之 结合。将层析柱充分洗脱后， 改变洗脱液的离子强度或pH， 欲分离的抗原与抗体解离，收 集洗脱液便可得到欲纯化的抗 原。