发酵——种子的扩大培养
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发酵工程第五章
培养基特点：有利于菌体的生长，所使用 的原料已经基本接近于发酵培养基
发酵工程
3.一级种子培养 培养基：水解糖2.5%，尿素0.5%，玉米 浆 2.5%，K2HPO4 0.1%, ph7.0
培养条件：在种子罐中培养, 32℃培养7-10个小时
培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基
发酵工程
最终发酵 培养基成分：水解糖2.5%；尿素0.5%，玉米
对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶 段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌 体。
如： 谷氨酸的种子培养。
发酵工程
b.对于产孢子的微生物 获得一定数量和质量的孢子 在固体培养基上产生大量孢子
获得一定数量和质量的菌丝体 在液体培养基中生产大量菌丝
发酵工程
2.2培养基选择的原则
培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对 孢子培养基应该是有利于孢子的生长。
发酵工程
根据文献记载，多数微生物，如病毒、 细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等 都能冻干保藏。许多菌种用此法可保 藏10年以上。
发酵工程
5. 液氮超低温保藏法
几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液 氮超低温保藏。只有少量对低温损伤敏感 的微生物例外。
发酵工程
液氮超低温保藏过程是将菌种悬浮液封存 于圆底安瓿管或塑料的液氮保藏管(材料应 能耐受较大温差骤然变化)内，放到-150～ -196℃的液氮罐或液氮冰箱内保藏。操作 过程中一大原则是“慢冻快融”。
发酵工程
为了减轻冷冻损伤程度，可采用保护剂。 如甘油和二甲亚砜。
发酵工程
注意：
液氮冷冻保藏管应严格密封。若有液氮渗 入管内，在从液氮容器中取出时，管中液 氮的体积将膨胀680倍，具很强的爆炸力， 必须特别小心。
发酵工程
3.一级种子培养 培养基：水解糖2.5%，尿素0.5%，玉米 浆 2.5%，K2HPO4 0.1%, ph7.0
培养条件：在种子罐中培养, 32℃培养7-10个小时
培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基
发酵工程
最终发酵 培养基成分：水解糖2.5%；尿素0.5%，玉米
对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶 段的种子扩培最终是获得一定数量和质量的菌 体。
如： 谷氨酸的种子培养。
发酵工程
b.对于产孢子的微生物 获得一定数量和质量的孢子 在固体培养基上产生大量孢子
获得一定数量和质量的菌丝体 在液体培养基中生产大量菌丝
发酵工程
2.2培养基选择的原则
培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对 孢子培养基应该是有利于孢子的生长。
发酵工程
根据文献记载，多数微生物，如病毒、 细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌等 都能冻干保藏。许多菌种用此法可保 藏10年以上。
发酵工程
5. 液氮超低温保藏法
几乎所有微生物及动物细胞等均可采用液 氮超低温保藏。只有少量对低温损伤敏感 的微生物例外。
发酵工程
液氮超低温保藏过程是将菌种悬浮液封存 于圆底安瓿管或塑料的液氮保藏管(材料应 能耐受较大温差骤然变化)内，放到-150～ -196℃的液氮罐或液氮冰箱内保藏。操作 过程中一大原则是“慢冻快融”。
发酵工程
为了减轻冷冻损伤程度，可采用保护剂。 如甘油和二甲亚砜。
发酵工程
注意：
液氮冷冻保藏管应严格密封。若有液氮渗 入管内，在从液氮容器中取出时，管中液 氮的体积将膨胀680倍，具很强的爆炸力， 必须特别小心。
简述种子扩大培养的一般步骤
简述种子扩大培养的一般步骤
种子扩大培养是一种常用的微生物培养方法，用于从初始培养物中扩大微生物数量，以便进行后续实验或工业应用。
一般而言，种子扩大培养的步骤包括以下几个方面：
1. 培养基准备，选择适当的培养基，根据目标微生物的需求添加合适的营养物质和pH调节剂。
培养基的配制需要严格按照配方和操作规程进行，以确保培养基的质量和一致性。
2. 种子接种，从初始培养物中选择合适的菌株或菌落，通过无菌技术将种子接种到含有适当培养基的培养容器中。
接种时需要注意保持无菌操作，避免外界的污染。
3. 培养条件调控，根据目标微生物的生长特性和要求，调节培养条件，包括温度、pH值、氧气供应和搅拌速度等。
这些条件的调节可以促进微生物的生长和代谢活性，从而实现种子的扩大。
4. 培养过程监测，在培养过程中，需要定期监测微生物的生长情况，可以通过测量生物量、菌落形态观察、代谢产物测定等方法进行。
监测结果可以帮助调整培养条件，以达到最佳的生长效果。
5. 收获和处理，当微生物达到预定的生长状态时，可以进行收获。
收获方法根据具体情况而定，可以选择简单的离心沉淀、滤液
或离子交换等方法。
收获后的种子可以进行后续的实验或工业应用。
6. 清洁和消毒，在种子扩大培养结束后，要进行培养容器和设
备的清洁和消毒工作，以防止微生物的交叉污染和感染。
总结起来，种子扩大培养的一般步骤包括培养基准备、种子接种、培养条件调控、培养过程监测、收获和处理，以及清洁和消毒。
这些步骤的严格执行可以确保种子扩大培养的成功，并提供足够的
微生物种子用于后续实验或工业应用。
6 种子的扩大培养【发酵工程】
不产孢子的镰刀赤霉菌，也可以用大米固体培养基置于 茄子瓶中培养菌丝体用作种子罐种子
C、产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种：
可以用摇瓶液体培养法，孢子接入液体培养基，振荡 培养，获得菌丝体，作为种子。
例如：灰色链霉菌、卡那链霉菌。
D、不产孢子的细菌： 生产上一般采用斜面营养细胞保藏法。 斜面菌种于32C，培养18—24小时，即可移入250 mL
6 种子扩大培养
种子扩大培养概念：
指将保存在砂土管、冷凉干燥管中处休眠状态的生 产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子 耀逐级扩大培养，获得一定数量和质量的纯种过程。
目前发酵灌容积已达几十或几百立方米。如按10 ％的种子计算，就要投入几或几十立方米的种子，要 从试管中的菌种逐级扩大为生产用种子，是一个由实 验室制备到车间生产的过程。其生产方法与条件随不 同的生产品种和菌种种类而异。
MYPG培养基：3克麦芽浸出物，3克酵母浸出物，5克 蛋白胨、10克葡萄糖和20克琼脂于l升水中。
二、生产车间种子制备
种子罐培养原则： 采用易被菌利用的成分，如葡萄糖、玉米桨、磷酸盐
等，同时还需供给足够的无菌空气并不断搅拌，使菌丝体 在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。
接种方法：
孢子悬浮液：一般采用微孔接种法。 摇瓶菌丝体种子：可在火焰保护下接入种子罐或采用压 差法接入。 种子罐之间或发酵罐间的移种：主要采用压差法，由种 子接种管道进行移种，移种过程中要防止接受罐表压降 至零，否则会引起染菌。
1、生长快的细菌，种子用量少，种子罐相应也少。
例如：谷氨酸生产中，茄子瓶种子接入种子罐子 32C培养7一10小时，即可按入发酵罐作为种子，这称为 一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。
2、生长较慢的菌种，种子用量大，种子罐相应也多。
C、产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种：
可以用摇瓶液体培养法，孢子接入液体培养基，振荡 培养，获得菌丝体，作为种子。
例如：灰色链霉菌、卡那链霉菌。
D、不产孢子的细菌： 生产上一般采用斜面营养细胞保藏法。 斜面菌种于32C，培养18—24小时，即可移入250 mL
6 种子扩大培养
种子扩大培养概念：
指将保存在砂土管、冷凉干燥管中处休眠状态的生 产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子 耀逐级扩大培养，获得一定数量和质量的纯种过程。
目前发酵灌容积已达几十或几百立方米。如按10 ％的种子计算，就要投入几或几十立方米的种子，要 从试管中的菌种逐级扩大为生产用种子，是一个由实 验室制备到车间生产的过程。其生产方法与条件随不 同的生产品种和菌种种类而异。
MYPG培养基：3克麦芽浸出物，3克酵母浸出物，5克 蛋白胨、10克葡萄糖和20克琼脂于l升水中。
二、生产车间种子制备
种子罐培养原则： 采用易被菌利用的成分，如葡萄糖、玉米桨、磷酸盐
等，同时还需供给足够的无菌空气并不断搅拌，使菌丝体 在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。
接种方法：
孢子悬浮液：一般采用微孔接种法。 摇瓶菌丝体种子：可在火焰保护下接入种子罐或采用压 差法接入。 种子罐之间或发酵罐间的移种：主要采用压差法，由种 子接种管道进行移种，移种过程中要防止接受罐表压降 至零，否则会引起染菌。
1、生长快的细菌，种子用量少，种子罐相应也少。
例如：谷氨酸生产中，茄子瓶种子接入种子罐子 32C培养7一10小时，即可按入发酵罐作为种子，这称为 一级种子罐扩大培养，也称二级发酵。
2、生长较慢的菌种，种子用量大，种子罐相应也多。
种子扩大培养 认识种子扩大培养
4 种子扩大培养
4.1 种子扩大培养的目的及要求
种子扩大培养的目的及要求
概述 种子扩大培养：又称种子制备工序，是指将保存在沙土管、冷冻干燥管
中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种 子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。 这些纯种培养物称为种子。
种子扩大培养的目的及要求
种子扩大培养的目的及要求
种子必须满足以下条件：
条件一
菌种细胞的生长活 力强，移种至发酵罐后能 迅速生长，缩短迟缓期
条件二
生理状态稳定，以便 获得稳定的菌体生长过程
五个
条件五
无杂菌污染，以保证 整个发酵过程正常进行 Nhomakorabea条件
稳定的生产能力
条件四
保持稳定的生产能力，使最终产
物的生物合成量持续稳定高产
条件三
菌体总量及浓度
种子扩大培养的意义 ① 为发酵生产提供充足的代谢旺盛、生命力强的种子 ② 有效地缩短发酵生产周期
种子扩大培养的目的及要求
目前工业规模的发酵罐容积已达到几十立方米或几百立方米。如按百分之十左 右的种子量计算，就要投入几立方米或几十立方米的种子。因此，种子扩大培 养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量足够的 种子。这种种子接入发酵罐后，将使发酵生产周期缩短，设备利用率提高。
适宜，可以保证在大发 酵罐中有适当的接种量
4.1 种子扩大培养的目的及要求
种子扩大培养的目的及要求
概述 种子扩大培养：又称种子制备工序，是指将保存在沙土管、冷冻干燥管
中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种 子罐逐级放大培养而获得一定数量和质量的纯种过程。 这些纯种培养物称为种子。
种子扩大培养的目的及要求
种子扩大培养的目的及要求
种子必须满足以下条件：
条件一
菌种细胞的生长活 力强，移种至发酵罐后能 迅速生长，缩短迟缓期
条件二
生理状态稳定，以便 获得稳定的菌体生长过程
五个
条件五
无杂菌污染，以保证 整个发酵过程正常进行 Nhomakorabea条件
稳定的生产能力
条件四
保持稳定的生产能力，使最终产
物的生物合成量持续稳定高产
条件三
菌体总量及浓度
种子扩大培养的意义 ① 为发酵生产提供充足的代谢旺盛、生命力强的种子 ② 有效地缩短发酵生产周期
种子扩大培养的目的及要求
目前工业规模的发酵罐容积已达到几十立方米或几百立方米。如按百分之十左 右的种子量计算，就要投入几立方米或几十立方米的种子。因此，种子扩大培 养应根据菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量足够的 种子。这种种子接入发酵罐后，将使发酵生产周期缩短，设备利用率提高。
适宜，可以保证在大发 酵罐中有适当的接种量
发酵工程种子的扩大培养
目的：使菌种的传代次数尽可能的少.
孢子培养
母瓶：活化、纯化,使保藏菌种生长,并去处变异株. 所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落.
子瓶: 大量繁殖,得到大量孢子. 接种：①从母斜面上点接种,选取生长好的单 菌落 ②接种时密一点,得到大量的孢子.
孢子培养时注意湿度,子斜面使用一般不超过1个月
三、生产车间阶段 1、培养物的选择原则 在生产车间阶段,最终一般都是获得一定数量的菌丝体. 菌丝体比孢子要有利： 缩短发酵时间 有利于获得好的发酵结果
原则：对数生长期末,细胞活力强,菌体浓度相对较大, 但是最终由实验结果定.
6、种子的质量要求：
量：要求达到一定的浓度
质: 形态 生长处于某个阶段、均匀等等 理化指标：C、N、P的含量,pH 酶活等
无污染
本章小节：
了解种子扩培的工艺过程及其中的基本概念 理解种子扩培的目的和要求 掌握控制种子质量的基本方法和手段
培养基的特点：长菌体,更接近于发酵培养基
种子的质量要求：
108-109个/ml 大小均匀,呈单个或八字排列 PH 7.0-7.2时结束,6.8→8→7.0-7.2 活力旺盛
二、青霉素生产的种子制备 制备过程
安培管 → 斜面孢子 → 大米孢子
→ 一级种子 → 二级种子
→ 发酵
一、斜面孢子 培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等 培养条件：25℃、7天, 注意湿度50%左右
目的：种子扩培到一定的量和质,根据菌种的特点最终的 培养物可分为两类：
对于不产孢子和芽胞的微生物 ——获得一定数量和质量的菌体
对于不产芽孢和孢子的微生物,实验室阶段的种子扩培 最终是获得一定数量和质量的菌体,如谷氨酸的种子培 养.
对于产孢子的微生物 ➢ 获得一定数量和质量的孢子
孢子培养
母瓶：活化、纯化,使保藏菌种生长,并去处变异株. 所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落.
子瓶: 大量繁殖,得到大量孢子. 接种：①从母斜面上点接种,选取生长好的单 菌落 ②接种时密一点,得到大量的孢子.
孢子培养时注意湿度,子斜面使用一般不超过1个月
三、生产车间阶段 1、培养物的选择原则 在生产车间阶段,最终一般都是获得一定数量的菌丝体. 菌丝体比孢子要有利： 缩短发酵时间 有利于获得好的发酵结果
原则：对数生长期末,细胞活力强,菌体浓度相对较大, 但是最终由实验结果定.
6、种子的质量要求：
量：要求达到一定的浓度
质: 形态 生长处于某个阶段、均匀等等 理化指标：C、N、P的含量,pH 酶活等
无污染
本章小节：
了解种子扩培的工艺过程及其中的基本概念 理解种子扩培的目的和要求 掌握控制种子质量的基本方法和手段
培养基的特点：长菌体,更接近于发酵培养基
种子的质量要求：
108-109个/ml 大小均匀,呈单个或八字排列 PH 7.0-7.2时结束,6.8→8→7.0-7.2 活力旺盛
二、青霉素生产的种子制备 制备过程
安培管 → 斜面孢子 → 大米孢子
→ 一级种子 → 二级种子
→ 发酵
一、斜面孢子 培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等 培养条件：25℃、7天, 注意湿度50%左右
目的：种子扩培到一定的量和质,根据菌种的特点最终的 培养物可分为两类：
对于不产孢子和芽胞的微生物 ——获得一定数量和质量的菌体
对于不产芽孢和孢子的微生物,实验室阶段的种子扩培 最终是获得一定数量和质量的菌体,如谷氨酸的种子培 养.
对于产孢子的微生物 ➢ 获得一定数量和质量的孢子
发酵工程 5 种子制备
种子扩大培养应根据菌种的生理特性，选
择合适的培养条件来获得代谢旺盛、数量足
够的种子。
优良的种子可以缩短生产周期、稳定产量、 提高发酵效率和设备利用率。
1、菌种的扩大培养的目的
接种量的需要；
菌种的驯化；
缩短发酵时间，提高发酵罐的利用率，以及减
少染菌。
2、作为种子必须具备的条件
1）生命力旺盛，移至发酵罐后能迅速生长，
峰的时间，但接种量过多往往使菌丝生长过快，
培养液粘度增加造成溶解氧供应不足而影响产物
的合成。
6、影响种子质量的因素
1）种子培养基原材料质量：不同产地、不同批 次的麸皮、大（小）米、琼脂等。 2）培养条件：温度、湿度、通气量、搅拌强度、
pH、泡沫等。
3）斜面冷藏时间：斜面冷藏对孢子质量的影响
与孢子成熟程度有关，冷藏时间对孢子的生产
生产过程中通常测定的参数有： 1）检测种子液的pH是否在种子的要求范围内；
2）检测种子液中的糖、氨基氮、磷酸盐的含量；
3）检查种子液中的菌丝形态、菌丝浓度和培养液外
观（色泽、气味、浑浊度、颗粒等）；
4）检查有无杂菌污染；
5）其他参数，如接种前某些酶的活力、种子罐的溶
氧和尾气（CO2、O2）等。
4、种子制备的流程
8、种子异常分析
1）菌种生长发育缓慢或过快
这与孢子质量及种子罐的培养条件有关，一般情
况下，通入种子罐的无菌空气温度低、培养基灭 菌质量差是种子生长、代谢缓慢的主要原因。 2）菌丝结团
菌丝在液体培养条件下成团或菌球。这会影响菌
丝的呼吸及对营养物质的吸收。这与通气搅拌相 关，加入某些表面活性剂如吐温80可促进菌丝 分散。
能力也有影响，通常冷藏时间越长，生产能力 下降越多。
发酵工程第一章 种子扩大培养
含量不同（微量元素Mg2+、Cu2+、Ba2+ 能刺激孢子的形成，磷含量太多或太少 也会影响孢子的质量）。
培养温度
❖ 温度过低，菌种生长发育缓慢 ❖ 温度过高会使菌丝过早自溶
在制备土霉素生产种子过程中，高于37℃培养时， 孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨
基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。
❖ 但考虑能否在一定时间内获得优质、足量的 种子以满足发酵的需求
一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时， 工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数
谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵
青霉素：三级发酵 一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵
发酵级数确定的依据
级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响
高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂 或菌丝快速生长。
种子培养基特点
❖ 有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需充足 氮源和生长因子，无机氮源比例大； ➢ 各种营养物质的浓度不必太高； ➢ 供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收利 用的碳源和氮源；
➢ 应考虑与发酵培养基的主要成分相近。
pH
❖ 选择最适种子培养pH的原则是获得 最大比生长速率和适当的菌量
❖ 丝状微生物不宜剧烈搅拌。
斜面冷藏时间
❖ 对孢子的生产能力有较大影响 ❖ 冷藏时间越长，生产能力下降越多
链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏两 个月后的发酵单位比冷藏一个月的降低18％， 比冷藏3个月的降低35％。
培养基
❖ 培养种子的目的：
➢ 扩大培养，增加细胞数量； ➢ 同时也必须培养出强壮、健康、活性
种子质量的判断方法
❖ 通常检测的培养液中参数 ➢ pH是否在种子要求的范围之内 ➢ 糖、氨基氮、磷酸盐的含量 ➢ 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 ➢ 有无杂菌污染
培养温度
❖ 温度过低，菌种生长发育缓慢 ❖ 温度过高会使菌丝过早自溶
在制备土霉素生产种子过程中，高于37℃培养时， 孢子接入发酵罐后表现出糖代谢变慢，氨
基氮回升提前，菌丝过早自溶，效价降低等现象。
❖ 但考虑能否在一定时间内获得优质、足量的 种子以满足发酵的需求
一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时， 工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数
谷氨酸：三级发酵 一级种子（摇瓶）→二级种子 （小罐）→发酵
青霉素：三级发酵 一级种子 （小罐）→二级种子（中罐）→发酵
发酵级数确定的依据
级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响
高的细胞。为了使细胞迅速进行分裂 或菌丝快速生长。
种子培养基特点
❖ 有较完全和丰富的营养物质，糖分少，需充足 氮源和生长因子，无机氮源比例大； ➢ 各种营养物质的浓度不必太高； ➢ 供孢子用的种子培养基，可添加易被吸收利 用的碳源和氮源；
➢ 应考虑与发酵培养基的主要成分相近。
pH
❖ 选择最适种子培养pH的原则是获得 最大比生长速率和适当的菌量
❖ 丝状微生物不宜剧烈搅拌。
斜面冷藏时间
❖ 对孢子的生产能力有较大影响 ❖ 冷藏时间越长，生产能力下降越多
链霉素生产中，斜面孢子在6℃冷藏两 个月后的发酵单位比冷藏一个月的降低18％， 比冷藏3个月的降低35％。
培养基
❖ 培养种子的目的：
➢ 扩大培养，增加细胞数量； ➢ 同时也必须培养出强壮、健康、活性
种子质量的判断方法
❖ 通常检测的培养液中参数 ➢ pH是否在种子要求的范围之内 ➢ 糖、氨基氮、磷酸盐的含量 ➢ 菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观 ➢ 有无杂菌污染
种子的扩大培养
种子异常分析
1、菌种生长速度过慢 2、菌丝结团 3、菌丝粘壁
第三节
种子制备过程的技术概要
种子制备的过程大致可分为：
实验室种子制备阶段
生产车间种子制备阶段
一、实验室种子的制备
实验室种子的制备一般采用两种方式
对于产孢子能力强的及孢子发芽、生长繁
殖快的菌种可以采用固体培养基培养孢子， 孢子可直接作为种子罐的种子，这样操作 简便，不易污染杂菌。 对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种， 可以用液体培养法。
搅拌转速340r／min； 250L种子罐1:0.3
搅拌转速300r／ min
500L种子罐1:0.25 搅拌转速230r／ min
(3)二级种子的质量要求 种龄 7~8h pH 7.2左右 OD值 净增0.5左右 无菌检查 (-) 噬菌体检查(-)
二、啤酒酵母的扩大培养
一般可采用三级扩大培养，扩大倍数：第1级 到第2级为8-10倍，第2级到第3级为4-6倍。 1，实验室扩大培养
(2) 培养条件 用1000mL三角瓶装入培养基 200mI，灭菌后置于冲程7．6cm、频率96次 ／min的往复式摇床上振荡培养12h，培养温 度33~34℃ (3) 一级种子质量要求 种龄：12h pH值：6.4± 0.1 光密度：净增OD值0.5以上 残糖：0.5％以下 无菌检查：(-) 噬菌体检查： (-) 镜检：菌体生长均匀、粗壮，排列整齐 革兰氏阳性反应。
水质的影响：地区不同、季节变化 和水源污染，均可造成水质波动， 影响种子质量。 菌种在固体培养基上可呈现多种不 同代谢类型的菌落，氮源品种越多， 出现的菌落类型也越多，不利于生 产的稳定。
措施
培养基所用原料要经过发酵试验合格才可
种子的扩大培养
☆（2）接种量的确定 ◆与该菌在发酵罐中生长繁殖的速度、种子质量和发酵条件 等有关。 a.接种量过多，菌丝生长过快、过稠，培养液粘度增加， 营养基质缺乏或溶解氧不足，影响产物的合成。 b.接种量过小，引起发酵前期菌体生长缓慢，使发酵周期 延长，菌丝量少，还可能产生菌丝团，导致发酵异常。
生产上多以大接种量和丰富培养基作为高产措施
（2）注射接种 用于种子罐接种，在罐顶接种管口压 盖一层橡胶膜，将注射器针嘴插入橡胶膜进行接种。
（3）摇瓶直接进罐法 适合种子罐接种，一般需三人 配合操作。
二、注意事项
（1）按照无菌操作
（2）消毒灭菌一定要彻底、干净
（3）在接种操作中，一定要严格按照无菌操作进行，规范生 产操作，严禁误操作带来的杂菌污染，经常提醒，建立严格 的无菌概念，避免出现二次污染。
如果将一级种子接入体积较大的种子罐内，经过培养形成更 多的菌丝——二级种子；将二级种子转入发酵罐内发酵，称为 三级发酵。
使用三级种子的发酵，称为四级发酵。
◆接种 将孢子或菌落，或试管、三角瓶或种子罐中 菌体接入培养容器的操作过程。
◆接种量 移种的种子液体积和培养液体积之比。
◆接种龄 种子罐中培养的菌体开始移种到下一级种 子罐或发酵罐的培养时间。
1．实验室种子制备 （1）斜面种子培养 活化菌种，同时也培养一定数量的斜面 种子。 （2）液体培养 包括液体试管和三角瓶摇床震荡或回旋式培 养。
①液体试管培养 无菌条件下，用接种针自斜面试管挑取 一环斜面种子菌体，接入装有液体培养液的试管，摇匀后，置 培养箱培养，待培养成熟后，再接入三角瓶培养。
②三角瓶液体培养（摇瓶种子）
（4）生产中使用的斜面菌种不宜多次移接，一般只移接三次 (三代)，以免由于菌种的自然变异引起菌种不纯。因此，要 经常进行菌种的分离纯化，不断提供新的斜面菌株供生产使 用。
实验室种子扩大培养一般流程
实验室种子扩大培养一般流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
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6.种子的扩大培养
生产车间种子制备阶段：
种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为发酵车间管理， 因此形象地称这些培养过程为生产车间种子制备阶段。
二、实验室阶段 1、培养物选择的原则 目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终 的培养物可分为两类： 对于不产孢子和芽胞的微生物 ——获得一定数量和室阶段的种子 扩大培养最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸 的种子培养。
生产过程中经常出现种子质量不稳定的现象，其主要原因是原材 料质量波动。 原材料质量的波动，起主要作用的是其中无机离子含量不同，如 微量元素Mg2+ 、Cu2+ 、Ba2+能刺激孢子的形成。磷含量太多或 太少也会影响孢子的质量。 以培养菌体为目的，种子罐与发酵罐培养基成分一致较好。 主要是碳源、氮源、无机盐、生长素和水等。 选用原则：组分简单，来源丰富，价格便宜，取材方便等。
不同接种量影响菌体的生长和发酵
发酵前期发酵液作为种子，发酵指数明显提高, 发酵后期菌体自溶明显，影响提炼收率.
20%种子罐＋10%发酵罐前期发酵液效果最好
本章小节：
了解种子扩培的工艺过程及其中的基本概念
理解种子扩培的目的和要求
掌握控制种子质量的基本方法和手段
在原料方面： 不如实验室阶段那么精细，而是基本接近于发 酵培养 基，这有两个方面的原因: 一是成本 二是驯化
例：柠檬酸发酵
以蔗糖为原料
成分 麦芽汁 蔗糖 NH4NO3 K2HPO4 MgSO4.H2O KCl 琼脂
斜面 麦汁
种子罐
发酵
2.5-5% 0.225% 0.03% 0.025%
20% 0.11% 0.025% 0.015%
8.生产发酵罐的无菌接种
生产规模发酵罐的接种，包括两个方面： –从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器中移种入一个种子罐. –从一个种子罐移入另一个生产发酵罐中。
第二章种子扩大培养ppt课件
2. 种子罐种子制备
可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。 孢子(或摇瓶菌丝)被接入到体积较小的种子罐中，经培养 后形成大量的菌丝，这样的种子称为一级种子；
把一级种子转入发酵罐内发酵，称为二级发酵。
如果将一级种子接入体积较大的种子罐内，经过培养形成更 多的菌丝，这样制备的种子称为二级种子；
将二级种子转入发酵罐内发酵，称为三级发酵。
（二）生产车间种子制备
实验室制备的孢子或液体种子移种至 种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因 不同菌种而异，但其原则为采用易被菌 利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐 等，如果是需氧菌，同时还需供给足够 的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝） 体在培养液中均匀分布，获得相同的培 养条件。
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
定义：菌种的扩大培养就是把保藏 的菌种，即砂土管、冷冻干燥管中 处于休眠状态的生产菌种接入试管 斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种 子罐，逐级扩大培养后达到一定的 数量和质量的纯种培养过程。这些 纯种的培养物称为种子。
种子罐培养 e.g. yeast： 原始菌种（出发菌种） 10ml 麦汁试管 250ml 三角瓶培养
（25 °C ~27°C ，3天） （25°C， 2天）
5~10 L卡氏罐 （15 °C ~20 °C ，3~5天）
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
同样道理，使用三级种子的发酵，称为四级发酵。
可分为一级种子、二级种子和三级种子的制备。 孢子(或摇瓶菌丝)被接入到体积较小的种子罐中，经培养 后形成大量的菌丝，这样的种子称为一级种子；
把一级种子转入发酵罐内发酵，称为二级发酵。
如果将一级种子接入体积较大的种子罐内，经过培养形成更 多的菌丝，这样制备的种子称为二级种子；
将二级种子转入发酵罐内发酵，称为三级发酵。
（二）生产车间种子制备
实验室制备的孢子或液体种子移种至 种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽因 不同菌种而异，但其原则为采用易被菌 利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸盐 等，如果是需氧菌，同时还需供给足够 的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝） 体在培养液中均匀分布，获得相同的培 养条件。
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
定义：菌种的扩大培养就是把保藏 的菌种，即砂土管、冷冻干燥管中 处于休眠状态的生产菌种接入试管 斜面活化，再经过扁瓶或药瓶和种 子罐，逐级扩大培养后达到一定的 数量和质量的纯种培养过程。这些 纯种的培养物称为种子。
种子罐培养 e.g. yeast： 原始菌种（出发菌种） 10ml 麦汁试管 250ml 三角瓶培养
（25 °C ~27°C ，3天） （25°C， 2天）
5~10 L卡氏罐 （15 °C ~20 °C ，3~5天）
在整堂课的教学中，刘教师总是让学 生带着 问题来 学习， 而问题 的设置 具有一 定的梯 度，由 浅入深 ，所提 出的问 题也很 明确
同样道理，使用三级种子的发酵，称为四级发酵。
发酵生产的过程及控制
死亡期
2、补料分批培养
在分批培养过程中补入新鲜的料液，以克服营养不足而导致 的发酵过早结束的缺点。 在此过程中只有料液的加入没有料液的取出，所以发酵结束 时发酵液体积比发酵开始时有所增加。在工厂的实际生产中 采用这种方法很多。
简单的过程，培养基中接入菌种以后，没有物料的加入和取出， 除了空气的通入和排气。整个过程中菌的浓度、营养成分的浓 度和产物浓度等参数都随时间变化。
优点： 操作简单，周期短，染菌机会少，生产过程和产品质量 容易掌握 缺点： 产率低，不适于测定动力学数据
分批培养中微生物的生长
迟滞期 对数生长期
稳 定期
发酵级数确定的依据
级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响。
级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一 般2-4级。
在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要 的一个方面。
3、接种量的确定
移入种子的体积 接种量＝ —————————
接种后培养液的体积
过大过小都不好，最终以实践定，如大多数抗生素为7-15%。 但是一般认为大一点好。
7 种子的质量标准
• 菌丝形态、菌体浓度和培养基外观（色素、颗粒等）； • pH； • 糖氮代谢速度； • 其它参数,如接种前的抗生素含量、某种酶活等。
8 影响种子质量的因素：
1）原材料的质量:
一般选择一些有利于孢子发芽和菌丝生长的培养基，在营养 上容易被菌体直接吸收利用，营养成分要适当地丰富和完全， 氮源和维生素含量较高，这样可以使菌丝粗壮，并且具有较 强的活力。
另一方面，种子培养基中的营养成分要尽可能和发酵培养基 接近以适合发酵的需要，这样的种子移入发酵罐后能比较容 易适应发酵罐的培养条件如微量元素Mg、Ca、Ba能刺激孢子 的生长。 2）、培养温度：过低？过高？
【精选】第五章种子扩大培养
二、生产车间种子制备
以实验室制备的孢子或摇瓶营养细胞做 种子，经种子罐扩大培养后，满足发酵罐对 种子的要求。
种子罐培养原则：
采用易被菌利用的成分，如葡萄糖、玉米桨、磷酸盐 等，同时还需供给足够的无菌空气并不断搅拌，使菌丝体 在培养液中均匀分布，获得相同的培养条件。
接种方法：
摇瓶菌丝体种子： 可在火焰保护下接入种子罐或 采用压差法接入。
一级种子接入发酵罐发酵称为二级发酵 二级种子接入发酵罐发酵称为三级发酵
。。。。。。。
依次类推 可知发酵的级数=种子级数+1
种子罐级数的意义：
种子罐级数越少，越有利于简化工艺和控制， 并可减少移种带来染菌机会。
但也必须考虑尽量延长发酵罐生产产物的时 间，缩短由于种子发芽、生长而占用的非生产时 间，以提高发酵罐的生产率。因此，种子罐级数 不宜过少。
C、产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种
可以用摇瓶液体培养法，孢子接入液体培养基，振荡 培养，获得菌丝体，作为种子。
例如：灰色链霉菌、卡那链霉菌。
D、不产孢子的细菌 生产上一般采用斜面营养细胞保藏法。 斜面菌种于32℃，培养18-24h，即可移入250mL摇瓶
液体培养基，32℃培养12h，即可作种子罐种子。 例如：谷氨酸棒状杆菌。
（3）将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中， 就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐的利用率， 并且也有利于减少染菌的机会。
（4）对于不同产品的发酵过程来说，必须根 据菌种生长繁殖速度快慢及生产的规模决定种子 扩大培养的级数。
种子液(几或几十立方米)
按10%接种量
发酵罐(几十或几百立方米)
由实验室制备到车间生产 的过程
种子制备的过程大致可分为：
实验室种子制备阶段 生产车间种子制备阶段
种子的扩大培养
3. 液体深层培养
液体深层种子罐从底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成 微小气泡以促进氧的溶解。该法容易按照生产菌种对于代谢 的营养要求一级不同生理时期的通气、搅拌、温度与培养基 中氢离子等条件，选择最佳培养条件。
四、种子质量的控制
（二）影响种子质量的因素及控制
培养基
（1）营养成•分种适龄合：种是子指培种养子的罐需中要培养的菌丝体开始移入
种子培养要求一定量的种子，在适宜的培养基中，控制一定的培养条 件和培养方法，从而保证种子正常生长。
工业微生物培养法分为静置培养和通气培养两大类型。
❖静置培养即将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行培养。 ❖通气培养法的生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必须供给 空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，又称好气培养法。
（1）放线菌孢子的制备
a) 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含 有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白 胨和一些无机盐等。
b) 碳源和氮源不要太丰富（碳源约为1％，氮源不超过0.5 ％），干燥和限制营养可直接或间接诱导孢子形成。
c) 放线菌斜面的培养温度大多数为28℃，少数为37℃，培 养时间为5～14天。
菌种细胞的生长活力强，转种至发酵罐后能迅速生 长，延滞期短。
菌种生理状态稳定，如菌丝形态、菌丝生长速率和 种子培养液的特性等符合要求。
菌体浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求。 无杂菌污染，保证纯种发酵。 菌种适应性强，能保持稳定的生产能力。
二、种子制备的过程
从工业发酵的角度来说，种子制备分成两个 阶段：
摇瓶培养基配方和培养条件与种子罐相似。
常采用母瓶、子瓶两级培养。种子培养基要求比 较丰富和完全，易被菌体分解利用，氮源丰富有 利于菌丝生长。原则上各种营养成分不宜过浓， 子瓶培养基浓度比母瓶略高，更接近于种子罐的 培养基配方。
液体深层种子罐从底部通气，送入的空气由搅拌桨叶分散成 微小气泡以促进氧的溶解。该法容易按照生产菌种对于代谢 的营养要求一级不同生理时期的通气、搅拌、温度与培养基 中氢离子等条件，选择最佳培养条件。
四、种子质量的控制
（二）影响种子质量的因素及控制
培养基
（1）营养成•分种适龄合：种是子指培种养子的罐需中要培养的菌丝体开始移入
种子培养要求一定量的种子，在适宜的培养基中，控制一定的培养条 件和培养方法，从而保证种子正常生长。
工业微生物培养法分为静置培养和通气培养两大类型。
❖静置培养即将培养基盛于发酵容器中，在接种后，不通空气进行培养。 ❖通气培养法的生产菌种以需氧菌和兼性需氧菌居多，它们生长的环境必须供给 空气，以维持一定的溶解氧水平，使菌体迅速生长和发酵，又称好气培养法。
（1）放线菌孢子的制备
a) 放线菌的孢子培养一般采用琼脂斜面培养基，培养基中含 有一些适合产孢子的营养成分，如麸皮、豌豆浸汁、蛋白 胨和一些无机盐等。
b) 碳源和氮源不要太丰富（碳源约为1％，氮源不超过0.5 ％），干燥和限制营养可直接或间接诱导孢子形成。
c) 放线菌斜面的培养温度大多数为28℃，少数为37℃，培 养时间为5～14天。
菌种细胞的生长活力强，转种至发酵罐后能迅速生 长，延滞期短。
菌种生理状态稳定，如菌丝形态、菌丝生长速率和 种子培养液的特性等符合要求。
菌体浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求。 无杂菌污染，保证纯种发酵。 菌种适应性强，能保持稳定的生产能力。
二、种子制备的过程
从工业发酵的角度来说，种子制备分成两个 阶段：
摇瓶培养基配方和培养条件与种子罐相似。
常采用母瓶、子瓶两级培养。种子培养基要求比 较丰富和完全，易被菌体分解利用，氮源丰富有 利于菌丝生长。原则上各种营养成分不宜过浓， 子瓶培养基浓度比母瓶略高，更接近于种子罐的 培养基配方。
第二章 种子扩大培养
好氧静置培养法。针对容器内培养基物形态又分为 液态表面培养和固体表面培养。相对于容器内培养基体 积而言，表面积越大，越易促进氧气由气液界面向培养 基内传递。 这种方法菌的生长速度与培养基的深度有关，单位 体积的表面积越大，生长速度越快。
2 固体培养（发酵）法(solid culturing)： 固体培养又分为浅盘(shallow pan)固体培养和深 层固体培养，统称曲法培养。它起源于我国酿造生产特 有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。
（二）生产车间种子制备
实验室制备的孢子或液体种子移种 至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽 因不同菌种而异，但其原则为采用易被 菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸 盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足 够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝） 体在培养液中均匀分布，获得相同的培 养条件。
1.摇瓶种子制备
一、种子扩大培养流程图
摇瓶液体培养
冷冻干燥孢子
茄子瓶斜面培养
斜面孢子 砂土孢子 固体培养基培养 一级种子罐 二级种子罐 发酵罐
实验室种子制备阶段 （一级种子培养）
生产车间种子制备阶段 （二级种子培养、 三级种子培养） 二级发酵 三级发酵
（一）实验室种子的制备
两种方式：在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备过程
用哪一代的斜面孢子接入液体培养，视菌种特性而定。 母斜面孢子接入液体培养基有利于防止菌种变异， 子斜面孢子接入液体培养基可节约菌种用量。 菌种进入种子罐有两种方法： 孢子进罐法，即将斜面孢子制成孢子悬浮液直接接入种子 罐．此方法可减少批与批之间的差异，具有操作方便、工 艺过程简单、便于控制孢子质量等优点，孢子进罐法已成 为发酵生产的一个方向。 摇瓶菌丝进罐法，适用于某些生长发育缓慢的放线菌，此 方法的优点是可以缩短种子在种子罐内的培养时间
2 固体培养（发酵）法(solid culturing)： 固体培养又分为浅盘(shallow pan)固体培养和深 层固体培养，统称曲法培养。它起源于我国酿造生产特 有的传统制曲技术。其最大特点是固体曲的酶活力高。
（二）生产车间种子制备
实验室制备的孢子或液体种子移种 至种子罐扩大培养，种子罐的培养基虽 因不同菌种而异，但其原则为采用易被 菌利用的成分如葡萄糖、玉米浆、磷酸 盐等，如果是需氧菌，同时还需供给足 够的无菌空气，并不断搅拌，使菌（丝） 体在培养液中均匀分布，获得相同的培 养条件。
1.摇瓶种子制备
一、种子扩大培养流程图
摇瓶液体培养
冷冻干燥孢子
茄子瓶斜面培养
斜面孢子 砂土孢子 固体培养基培养 一级种子罐 二级种子罐 发酵罐
实验室种子制备阶段 （一级种子培养）
生产车间种子制备阶段 （二级种子培养、 三级种子培养） 二级发酵 三级发酵
（一）实验室种子的制备
两种方式：在固体培养基上生产大量孢子的孢子制备过程
用哪一代的斜面孢子接入液体培养，视菌种特性而定。 母斜面孢子接入液体培养基有利于防止菌种变异， 子斜面孢子接入液体培养基可节约菌种用量。 菌种进入种子罐有两种方法： 孢子进罐法，即将斜面孢子制成孢子悬浮液直接接入种子 罐．此方法可减少批与批之间的差异，具有操作方便、工 艺过程简单、便于控制孢子质量等优点，孢子进罐法已成 为发酵生产的一个方向。 摇瓶菌丝进罐法，适用于某些生长发育缓慢的放线菌，此 方法的优点是可以缩短种子在种子罐内的培养时间
简述发酵种子扩大培养的工艺流程
简述发酵种子扩大培养的工艺流程The process of expanding the culture of fermentation seeds is a crucial step in the production of various fermented products. It involves the multiplication of starter cultures to a sufficient quantity for inoculation into the final fermentation batch. This step not only ensures the consistency of the fermentation process but also helps in maintaining the desired product quality.发酵种子扩大培养的工艺流程通常包括以下几个步骤。
首先是选择合适的培养基，这一步骤至关重要，因为培养基的成分将直接影响到细菌或酵母的生长和繁殖。
培养基通常包括碳源、氮源、矿物盐等成分，以满足微生物的生长需求。
After selecting the appropriate growth medium, the next step is to inoculate the fermentation seed culture into the medium. This is done to introduce the starter culture into a favorable environment for growth and proliferation. The inoculated medium is then placed in a controlled environment that provides suitable temperature, pH, and oxygen levels for optimal microbial growth.在接种发酵种子培养液后，需要进行发酵过程的监测和调控。
种子扩大培养 种子扩大培养的原则
4 种子扩大培养
4.3 种子扩大培养的原则
种子扩大培养的原则
1、种子罐级数的确定
种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数。
取决于：①菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度； ②所采用发酵罐的容积。
为简化工艺和控制，减少染菌机会，种子罐级数越 少越好。但种子级数太少，接种量小，发酵时间延长， 会降低发酵罐的生产效率。虽然种子罐级数随产物的 品种及生产规模而定，但也与所选用工艺条件有关。 如改变种子罐的培养条件，加速孢子发芽及菌体的繁 殖，也可相应地减少种子罐的级数。
种子扩大培养的原则
1、种子罐级数的确定
细菌的生长速度快，种子用量比较少，故种子罐相应也少，采用一级种 子罐扩大培养，也称二级发酵。
即：茄子瓶→种子罐→发酵罐
霉菌的生长较慢，如青霉菌，一般采用二级种子罐扩大培养，为三级发酵。 即：孢子悬浮液→一级种子罐( 27 ℃, 40h孢子发芽，产生菌丝)→二级种子罐
种子扩大培养的原则
2、接种龄
总结：
种龄短：菌体太少； 种龄长：易老化。
原则:
对数生长期末，细胞活力强，菌 体浓度相对较大，但是最终由实 验结果定。
种子扩大培养的原则
3、接种量
定义：
接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。
概述：
接种量的大小取决于生产菌种在发酵罐中的生长繁殖速度。 采用较大的接种量，可以缩短发酵罐中菌体繁殖到达高峰的时间，使产物的形 成提前到来。但是，如果接种量过多，往往使菌丝生长过快，培养液黏度增加，造 成溶解氧供应不足而影响产物合成。而接种量过少，除了延长发酵周期外，往往还 会引起其他不正常情况。 在丝状菌发酵生产中，最适接种量多为7～15%，而细菌发酵中接种量相对较小， 一般为1～2%。总之，对每一个生产菌种，要进行多次试验才能确定其最适接种量。
4.3 种子扩大培养的原则
种子扩大培养的原则
1、种子罐级数的确定
种子罐级数是指制备种子需逐级扩大培养的次数。
取决于：①菌种生长特性、孢子发芽及菌体繁殖速度； ②所采用发酵罐的容积。
为简化工艺和控制，减少染菌机会，种子罐级数越 少越好。但种子级数太少，接种量小，发酵时间延长， 会降低发酵罐的生产效率。虽然种子罐级数随产物的 品种及生产规模而定，但也与所选用工艺条件有关。 如改变种子罐的培养条件，加速孢子发芽及菌体的繁 殖，也可相应地减少种子罐的级数。
种子扩大培养的原则
1、种子罐级数的确定
细菌的生长速度快，种子用量比较少，故种子罐相应也少，采用一级种 子罐扩大培养，也称二级发酵。
即：茄子瓶→种子罐→发酵罐
霉菌的生长较慢，如青霉菌，一般采用二级种子罐扩大培养，为三级发酵。 即：孢子悬浮液→一级种子罐( 27 ℃, 40h孢子发芽，产生菌丝)→二级种子罐
种子扩大培养的原则
2、接种龄
总结：
种龄短：菌体太少； 种龄长：易老化。
原则:
对数生长期末，细胞活力强，菌 体浓度相对较大，但是最终由实 验结果定。
种子扩大培养的原则
3、接种量
定义：
接种量是指移入的种子液体积和接种后培养液体积的比例。
概述：
接种量的大小取决于生产菌种在发酵罐中的生长繁殖速度。 采用较大的接种量，可以缩短发酵罐中菌体繁殖到达高峰的时间，使产物的形 成提前到来。但是，如果接种量过多，往往使菌丝生长过快，培养液黏度增加，造 成溶解氧供应不足而影响产物合成。而接种量过少，除了延长发酵周期外，往往还 会引起其他不正常情况。 在丝状菌发酵生产中，最适接种量多为7～15%，而细菌发酵中接种量相对较小， 一般为1～2%。总之，对每一个生产菌种，要进行多次试验才能确定其最适接种量。
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发酵——种子的扩大培养
1、斜面 (AS1.299)
培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%， pH 7.0-7.2
培养条件：32℃，生长18-24小时
培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细
生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次
发酵——种子的扩大培养
2. 一级种子（摇瓶）
培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1%，硫酸镁0.04% pH7.0
培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32℃培 养12小时。
培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基
一级种子质量要求
种龄：12h pH值：6.4± 0.1 光密度：净增OD值0.5以上
残糖：0.5％以下 无菌检查：(-)
噬菌体检查： (-)
镜检：菌体生长均匀、粗发壮酵—，—排种子列的扩整大培齐养
革兰氏阳性反应
3. 二级种子(种子罐)
培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替， 浓度为2.5%
培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%）， 32℃培养7-10个小时
通风量: 50L种子罐1:0.5,搅拌转速340r／min；
室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因 此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。
生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为
发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。
发酵——种子的扩大培养
二、实验室阶段
1、培养物选择的原则
目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终 的培养物可分为两类：
试管→三角瓶→摇床→种子罐
2，厌氧培养：对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等） 试管→三角瓶→卡式罐→种子罐
发酵——种子的扩大培养
2、培养基选择的原则 培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基 应该是有利于孢子的生长。 在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小， 因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较 精细。
发酵——种子的扩大培养
例：放线菌孢子的制备 ✓ 采用琼脂斜面培养基，培养基含麸皮、豌豆浸汁、蛋
白胨和一些无机盐等。 ✓ 培养温度一般为28˚C。
✓ 培养时间为5~14天。
发酵——种子的扩大培养
对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产 链霉素的灰色链霉菌、产卡那霉素的卡那链霉菌 可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养 基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌 丝体，作为种子。
对于不产孢子和芽胞的微生物 ——获得一定数量和质量的菌体
对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培 最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培 养。
发酵——种子的扩大培养
对于产孢子的微生物 ➢ 获得一定数量和质量的孢子 菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种 子，但操作繁琐。 ➢ 获得一定数量和质量的菌丝体 便于操作，但需要更仔细的控制。
第四章 种子的扩大培养 种子扩大培养的目的与要求 种子制备实例 种子制备的技术概要
发酵——种子的扩大培养
第一节 种子扩大培养的目的与要求 种子扩大培养的概念:
种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处 休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或 摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯 种过程。这些纯种培养物称为种子。
250L种子罐1:0.3,搅拌转速300r／ min 500L种子罐1:0.25,搅拌转速230r／ min
培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基
发酵——种子的扩大培养
种子的质量要求：
108-109个/ml 大小均匀，呈单个或八字排列 PH 7.0-7.2时结束，6.8→8→7.0-7.2 活力旺盛 无菌检查
发酵——种子的扩大培养
二、青霉素生产的种子制备 制备过程
安培管 → 斜面孢子 → 大米孢子
→ 一级种子 → 二级种子
→ 发酵
发酵——种子的扩大培养
1、斜面孢子 培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等 培养条件：25℃、7天, 注意湿度50%左右
培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细
发酵——种子的扩大培养
4、二级种子 培养基：同上 培养条件：27℃、10-14小时 接种量：10%
发酵——种子的扩大培养
三、啤酒酵母的扩大培养
三级扩大培养 扩大倍数：第1级到第2级为8-10倍 第2级到第3级为4-6倍
1，实验室扩大培养
发酵——种子的扩大培养
2，车间扩大培养
发酵——种子的扩大培养
接种方式： 从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种
2、大米孢子 培养基：大米及氮源（玉米浆） 培养条件：25℃、7天，控制湿度
培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表 面积和氧的传质，营养适当（要求大米 的白点小）有利于孢子的生长。
大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子
发酵——种子的扩大培养
3、一级种子 培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆 培养条件：27℃，40小时 接种量：200亿孢子/吨 目的：长菌体
发酵——种子的保藏斜面 → 活化斜面 产孢子 保藏 → 母斜面 → 子斜面 目的：使菌种的传代次数尽可能的少。
发酵——种子的扩大培养
孢子培养
母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去处变异株。 所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。
发酵——种子的扩大培养
种子扩培的目的 接种量的需要 菌种的驯化 缩短发酵时间、保证生产水平
种子的要求： 总量及浓度能满足要求 生理状况稳定，个体与群体 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长 无杂菌污染
发酵——种子的扩大培养
第一节 种子制备过程举例 一、谷氨酸生产的种子制备
制备过程 斜面菌种 →一级种子培养 →二级种子培养 →发酵
从种子罐接种：
发酵——种子的扩大培养
种子的质量要求 菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于 Ⅲ—Ⅳ期 青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1-4为年青期， 4-6期合成青霉素的能力最强
发酵——种子的扩大培养
第二节 种子制备的技术概要 一、种子制备的过程
实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验
1、斜面 (AS1.299)
培养基：蛋白胨 1%，牛肉膏1%，氯化钠 0.5 琼脂 2%， pH 7.0-7.2
培养条件：32℃，生长18-24小时
培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细
生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过 3次
发酵——种子的扩大培养
2. 一级种子（摇瓶）
培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆 2.5%， K2HPO4 0.1%，硫酸镁0.04% pH7.0
培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32℃培 养12小时。
培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基 本接近于发酵培养基
一级种子质量要求
种龄：12h pH值：6.4± 0.1 光密度：净增OD值0.5以上
残糖：0.5％以下 无菌检查：(-)
噬菌体检查： (-)
镜检：菌体生长均匀、粗发壮酵—，—排种子列的扩整大培齐养
革兰氏阳性反应
3. 二级种子(种子罐)
培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替， 浓度为2.5%
培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%）， 32℃培养7-10个小时
通风量: 50L种子罐1:0.5,搅拌转速340r／min；
室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因 此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。
生产车间阶段：种子培养在种子罐里面进行，一般在工程归为
发酵车间管理，因此形象地称这些培养过程为生产车间阶段。
发酵——种子的扩大培养
二、实验室阶段
1、培养物选择的原则
目的：种子扩培到一定的量和质，根据菌种的特点最终 的培养物可分为两类：
试管→三角瓶→摇床→种子罐
2，厌氧培养：对于酵母菌（啤酒，葡萄酒，清酒等） 试管→三角瓶→卡式罐→种子罐
发酵——种子的扩大培养
2、培养基选择的原则 培养基的选择应该是有利于菌体的生长，对孢子培养基 应该是有利于孢子的生长。 在原料方面，实验室种子培养阶段，规模一般比较小， 因此为了保证培养基的质量，培养基的原料一般都比较 精细。
发酵——种子的扩大培养
例：放线菌孢子的制备 ✓ 采用琼脂斜面培养基，培养基含麸皮、豌豆浸汁、蛋
白胨和一些无机盐等。 ✓ 培养温度一般为28˚C。
✓ 培养时间为5~14天。
发酵——种子的扩大培养
对于产孢子能力不强或孢子发芽慢的菌种，如产 链霉素的灰色链霉菌、产卡那霉素的卡那链霉菌 可以用摇瓶液体培养法。将孢子接入含液体培养 基的摇瓶中，于摇瓶机上恒温振荡培养，获得菌 丝体，作为种子。
对于不产孢子和芽胞的微生物 ——获得一定数量和质量的菌体
对于不产芽孢和孢子的微生物，实验室阶段的种子扩培 最终是获得一定数量和质量的菌体，如谷氨酸的种子培 养。
发酵——种子的扩大培养
对于产孢子的微生物 ➢ 获得一定数量和质量的孢子 菌丝体培养步骤少，因而更容易获得量和质稳定的种 子，但操作繁琐。 ➢ 获得一定数量和质量的菌丝体 便于操作，但需要更仔细的控制。
第四章 种子的扩大培养 种子扩大培养的目的与要求 种子制备实例 种子制备的技术概要
发酵——种子的扩大培养
第一节 种子扩大培养的目的与要求 种子扩大培养的概念:
种子扩大培养是指将保存在砂土管、冷冻干燥管中处 休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或 摇瓶及种子罐逐级扩大培养,最终获得一定数量和质量的纯 种过程。这些纯种培养物称为种子。
250L种子罐1:0.3,搅拌转速300r／ min 500L种子罐1:0.25,搅拌转速230r／ min
培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基
发酵——种子的扩大培养
种子的质量要求：
108-109个/ml 大小均匀，呈单个或八字排列 PH 7.0-7.2时结束，6.8→8→7.0-7.2 活力旺盛 无菌检查
发酵——种子的扩大培养
二、青霉素生产的种子制备 制备过程
安培管 → 斜面孢子 → 大米孢子
→ 一级种子 → 二级种子
→ 发酵
发酵——种子的扩大培养
1、斜面孢子 培养基：甘油、 葡萄糖、 蛋白胨等 培养条件：25℃、7天, 注意湿度50%左右
培养基特点：有利于长孢子，用量少而精细
发酵——种子的扩大培养
4、二级种子 培养基：同上 培养条件：27℃、10-14小时 接种量：10%
发酵——种子的扩大培养
三、啤酒酵母的扩大培养
三级扩大培养 扩大倍数：第1级到第2级为8-10倍 第2级到第3级为4-6倍
1，实验室扩大培养
发酵——种子的扩大培养
2，车间扩大培养
发酵——种子的扩大培养
接种方式： 从实验室摇瓶或孢子悬浮液容器接种
2、大米孢子 培养基：大米及氮源（玉米浆） 培养条件：25℃、7天，控制湿度
培养基的特点：成本低、米粒之间结构疏松提高比表 面积和氧的传质，营养适当（要求大米 的白点小）有利于孢子的生长。
大米孢子的要求：1粒米含1.4*106个孢子
发酵——种子的扩大培养
3、一级种子 培养基：（葡萄糖、乳糖、蔗糖）、玉米浆 培养条件：27℃，40小时 接种量：200亿孢子/吨 目的：长菌体
发酵——种子的保藏斜面 → 活化斜面 产孢子 保藏 → 母斜面 → 子斜面 目的：使菌种的传代次数尽可能的少。
发酵——种子的扩大培养
孢子培养
母瓶：活化、纯化，使保藏菌种生长，并去处变异株。 所以接种时要稀一点、便于纯化生长到单菌落。
发酵——种子的扩大培养
种子扩培的目的 接种量的需要 菌种的驯化 缩短发酵时间、保证生产水平
种子的要求： 总量及浓度能满足要求 生理状况稳定，个体与群体 活力强，移种至发酵后，能够迅速生长 无杂菌污染
发酵——种子的扩大培养
第一节 种子制备过程举例 一、谷氨酸生产的种子制备
制备过程 斜面菌种 →一级种子培养 →二级种子培养 →发酵
从种子罐接种：
发酵——种子的扩大培养
种子的质量要求 菌丝长稠呈丝状、菌丝团很少，有中小空孢，处于 Ⅲ—Ⅳ期 青霉素发酵菌丝体的生长共分为6个期，1-4为年青期， 4-6期合成青霉素的能力最强
发酵——种子的扩大培养
第二节 种子制备的技术概要 一、种子制备的过程
实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验