鸡血细胞的体外融合

方法与步骤
PEG诱导细胞融合 诱导细胞融合 吸取0.5ml 37℃的50%PEG溶液，慢慢 吸取 ℃ 溶液， 溶液 沿着离心管壁逐滴加入，边加边轻摇离 沿着离心管壁逐滴加入， 心管， 与细胞混匀， 心管，使PEG与细胞混匀，然后在 ℃ 与细胞混匀 然后在37℃ 水浴中静置2min。 水浴中静置 。
方法与步骤
鸡血细胞悬液的制备 在离心后的鸡血细胞沉淀中加入10ml的 的 在离心后的鸡血细胞沉淀中加入 GKN溶液，将细胞悬浮。取0.5ml鸡血细 溶液， 溶液 将源自文库胞悬浮。 鸡血细 胞悬液， 溶液。 胞悬液，加3.5ml GKN溶液。镜检，在血 溶液 镜检， 细胞计数板上计数。稀释至1X107个/ml， 细胞计数板上计数。稀释至 个 ， 于37℃保温。 ℃保温。
作业
画出观察到的融合细胞，并计算融合率。 画出观察到的融合细胞，并计算融合率。
思考题
根据自己的实验结果， 根据自己的实验结果，分析在实验过程 中影响融合率的主要步骤。 中影响融合率的主要步骤。 Ca2+在实验中起什么作用 在实验中起什么作用?
细胞融合操作 离心洗涤： 离心洗涤： (1:4)鸡血悬液lml加0.85％生理盐水至５m1，混匀。 鸡血悬液lml 取(1:4)鸡血悬液lml加0.85％生理盐水至５m1，混匀。 1500rpm,5min， 1500rpm,5min，弃上清
方法与步骤
鸡血细胞的收集 吸取1ml鸡血细胞悬液放入离心管中，加 鸡血细胞悬液放入离心管中， 吸取 鸡血细胞悬液放入离心管中 液混匀， 离心5min。 入4mlHanks液混匀，1000rpm离心 液混匀 离心 。 弃去上清液，用手指轻弹离心管底部， 弃去上清液，用手指轻弹离心管底部，使 沉淀的血细胞团块松散。 沉淀的血细胞团块松散。
水浴2min
加入Hanks溶液至5m1，混匀。 加入Hanks溶液至5m1，混匀。 Hanks溶液至5m1
水浴5min
1000rpm，5min， 1000rpm，5min，弃上清 加入Hanks溶液至5m1，混匀，1000rpm，5min。 加入Hanks溶液至5m1，混匀，1000rpm，5min。 Hanks溶液至5m1
实验原理
实验仪器、 实验仪器、用具
注射器 滴管 烧杯 容量瓶 凹面载玻片 盖玻片 离心机 水浴锅 显微镜 细胞计数板 酒精灯 刻度离心管
试剂
Hanks原液（10×） 原液（ × 原液
NaCl2 Na2HPO4·12H2O KCl KH2PO4 MgSO4·7H2O 葡萄糖 CaCl2 80.0g 1.2g 4.0g 0.6g 2.0g 10.0g 1.4g
(重复1次) 重复1
GKN溶液 混匀,计数。 溶液, 加10ml GKN溶液,混匀,计数。 取1ml鸡血细胞悬液，用4m1 Hanks溶液 混匀，1000rpm,5min，弃上清。 1000rpm,5min， 1000rpm,5min
水浴 缓慢逐滴加0.5ml的50%PEG至悬液,边加边混匀。 缓慢逐滴加0.5ml的50%PEG至悬液,边加边混匀。 0.5ml 至悬液
实验原理
PEG是乙二醇的多聚化合物，可改变各 是乙二醇的多聚化合物， 是乙二醇的多聚化合物 类细胞的膜结构， 类细胞的膜结构，使两细胞接触点处脂 类分子发生疏散和重组， 类分子发生疏散和重组，诱导产生细胞 融合。 融合。 商品PEG存在一系列不同分子质量的多 商品 存在一系列不同分子质量的多 聚体，一般应用PEG4000~6000的溶液， 的溶液， 聚体，一般应用 能够产生高频率的细胞融合。 能够产生高频率的细胞融合。
融合率 = 视野内融合细胞的核数/视野内细胞的总核数× 视野内融合细胞的核数 视野内细胞的总核数×100％ 视野内细胞的总核数 ％
测定时要进行多个视野计数， 测定时要进行多个视野计数，并进行统计分 析。
注意事项
温度、融合时间、 温度、融合时间、PEG的浓度与作用时 的浓度与作用时 细胞密度、 间、细胞密度、机械力等因素均影响融 合率，实验操作时应予以注意， 合率，实验操作时应予以注意，并在需 要的时候及时镜检。 要的时候及时镜检。
试剂
Hanks原液（10×） 原液（ × 原液
称取1.4gCaCl2，溶于 溶于30~50ml蒸馏水中 称取 蒸馏水中 取1000mL的烧杯及容量瓶各 个，先放重 的烧杯及容量瓶各1个 的烧杯及容量瓶各 蒸水800mL于烧杯中，然后按上页表顺序 于烧杯中， 蒸水 于烧杯中 逐一溶解药品。直到葡萄糖完全溶解后， 逐一溶解药品。直到葡萄糖完全溶解后， 再将已溶解的CaCl2溶液加入，最后加水 溶液加入， 再将已溶解的 定容至1000mL 定容至
细胞工程实验课件
鸡血细胞的体外融合
动物细胞融合是细胞工程 技术的重要手段之一， 技术的重要手段之一，是研究 细胞遗传、基因定位、 细胞遗传、基因定位、细胞免 病毒和肿瘤的重要手段。 疫、病毒和肿瘤的重要手段。
实验目的
了解聚乙二醇（ 了解聚乙二醇（PEG）诱导体外细胞融 ） 合的基本原理。 合的基本原理。 通过PEG诱导鸡血细胞之间的融合实验， 诱导鸡血细胞之间的融合实验， 通过 诱导鸡血细胞之间的融合实验 初步掌握细胞融合的基本方法。 初步掌握细胞融合的基本方法。
方法与步骤
终止PEG作用 作用 终止
缓慢加入5mL Hanks缓冲液，轻轻吹打混 缓冲液， 缓慢加入 缓冲液 37℃水浴中静置5min。 匀，于37℃水浴中静置5min。
制备细胞悬液
用吸管轻轻吹打细胞团数次使细胞团分散， 用吸管轻轻吹打细胞团数次使细胞团分散， 1000rpm离心 离心5min，使细胞完全沉降。弃 离心 ，使细胞完全沉降。 去上清液， 去上清液，加Hanks液，再离心一次，弃 液 再离心一次， 多数上清，留少许溶液，混匀。 多数上清，留少许溶液，混匀。
詹纳斯绿染液
方法与步骤
鸡血细胞储备液的制备
取鸡血，加入肝素（ 全血） 取鸡血，加入肝素（100U/5mL全血）制 全血 成抗凝全血。再加入4倍体积 倍体积0.85 %NaCl 成抗凝全血。再加入 倍体积 溶液，制成红细胞储备液，保存于4℃ 溶液，制成红细胞储备液，保存于 ℃。
鸡血细胞的处理
取鸡血细胞储备液1mL，加入4mL 0.85 ，加入 取鸡血细胞储备液 %NaCl溶液，混匀后，1500rpm离心 溶液， 溶液 混匀后， 离心 5min，弃上清，用5mL 0.85 %NaCl溶液 ，弃上清， 溶液 重悬浮沉淀，重复离心操作1次 重悬浮沉淀，重复离心操作 次。
实验原理
细胞融合又称体细胞杂交， 细胞融合又称体细胞杂交，是指用人工 方法使两个或两个以上的体细胞融合成 异核体细胞，随后， 异核体细胞，随后，异核体同步进入有 丝分裂，核膜崩溃， 丝分裂，核膜崩溃，来自两个亲本细胞 的基因组合在一起形成只含有一个细胞 核的杂种细胞。 核的杂种细胞。
实验原理
实验原理
方法与步骤
染色和镜检
吸取细胞悬液，在凹面载玻片上滴一滴， 吸取细胞悬液，在凹面载玻片上滴一滴， 加入詹纳斯绿染液混匀，染色3min后盖上 加入詹纳斯绿染液混匀，染色3min后盖上 盖玻片，在显微镜下观察细胞融合情况。 盖玻片，在显微镜下观察细胞融合情况。
计算细胞融合率
细胞融合率是指在显微镜的视野内，已发生 细胞融合率是指在显微镜的视野内， 融合细胞的细胞核总数与该视野内所有细胞 的细胞核总总数之比，通常以百分数表示。 的细胞核总总数之比，通常以百分数表示。
依据融合过程采用的助融剂不同， 依据融合过程采用的助融剂不同，细胞 融合可分为： 融合可分为：
病毒诱导的细胞融合，如仙台病毒 病毒诱导的细胞融合， （HVJ）； ）； 化学因子诱导的细胞融合， 化学因子诱导的细胞融合，如聚乙二醇 （PEG）； ）； 电场诱导的细胞融合； 电场诱导的细胞融合； 激光诱导的细胞融合
放入100mL瓶中，高压灭 瓶中， 取50g PEG4000放入 瓶中 菌20min 冷却到50~60℃，勿让其凝固 让PEG冷却到 冷却到 ℃ 加入50mL预热至50 ℃的Hanks液 混匀， 50mL预热至 加入50mL预热至50 ℃的Hanks液，混匀， ℃保温备用 保温备用。 至37 ℃保温备用。
试剂
Hanks液 液
Hanks原液 原液 100mL 重蒸水 896mL 0.5%酚红 4mL 酚红 配好的Hanks液，分装包扎好贴上标签， 配好的 液 分装包扎好贴上标签， 经过灭菌后， ℃保存。 经过灭菌后，4℃保存。
试剂
0.85% NaCl溶液 溶液 GKN液 液 50%（m/V）PEG溶液 （ ） 溶液