DNA提取原理和方法 ppt课件
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A NaOAc solution with pH lower than 6.0 will cause the EDTA to precipitate;
Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT;
If there is no pellet, place samples in -80ºC for 10 min and spin at 13,000 rpm for 25 min at 4ºC;
Add 0.5 ml Chloroform and vortex at top speed for 5 min at RT; Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT; Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube, add 50 ml 3 M NaOAc (pH=6.0) and 0.5 ml 100% ethanol, invert several times;
物，从而达到分离目的。 7
DNA提取原理和方法
基因组DNA的提取
➢ 浓盐法：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
➢ 有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
➢ 密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物8
DNA提取原理和方法
基因组DNA－SDS法
after 24 hr;
Proteinase K :
作用：广谱蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很 高的活性，降解蛋白质，将DNA游离。
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DNA提取原理和方法
4. Add 0.5 ml Phenol/Chloroform and vortex at top speed for
1 保证核酸一级结构的完整性； 2 其他生物大分子的污染应降低到最低程度； 3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过
高浓度的金属离子； 4 其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。
4
DNA提取原理和方法
DNA提取的几种方法
基因组DNA的提取
断裂成为线状
非基因组DNA的提取 ➢ 质粒DNA的提取
2. Add 0.5 ml tail solution and 25 ml Proteinase K, mix well and incubate at 55ºC overnight or until tissue is dissolved;
Tail solution:
1.SDS ：十二烷基硫酸钠
共价闭合环状结构
5
DNA提取原理和方法
基因组DNA的提取
根据裂解方式的不同有：
Ⅰ机械法 Ⅱ物理法 Ⅲ化学法
细胞破碎方法
1匀浆法 2捣碎法 3研磨法 1超声法 2反复冻融法 3冷热交替法 4低渗裂解 1有机溶剂 2去垢剂 3酶解法
应用
机体软组织 动物韧性组织 细菌、酵母 细胞混悬液 培养细胞 细菌、病毒 红细胞 细菌、酵母
组织、6培养细胞
细DN菌A提、取酵原理母和方法
基因组DNA的提取
根据核酸分离纯化方式的不同有： ➢ 吸附材料结合法：
• 硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。
• 阴离子交换树脂 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用于纯度要求高的实验。
• 磁珠
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的
Wash pellet once with 70% ethanol, air dry; Resuspend DNA in ddH2O. Use ~100-200 ml ddH2O to get final concentration as 100ng/ml for PCR.
10
DNA提取原理和方法
2
DNA提取原理和方法
核酸的理化性质
• 极性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂， 钠盐比游离核酸易溶于水。
• 在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液 中较稳定。
• 天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于 细胞核中。
3
DNA提取原理和方法
提取DNA总的原则 :
作用：a. 溶解细胞膜、核膜上脂质成分 b.使蛋白质变性
2.Tris：缓冲液
作用：细胞裂解时PH值也能稳定
3.EDTA
作用：是二价金属螯合剂，抑制核酸酶；降低细胞膜的稳定性。
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DNA提取原理和方法
3. More Proteinase K may be added if digestion is not complete
DNA extraction
ZJL
12014.05.09
DNA提取原理和方法
DNA extraction
• 细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结 合成核蛋白。
• 真核生物的DNA又有染色体DNA与细胞器DNA之分。前 者为双链线性分子；后者为双链环状分子。
• 除此之外，在原核生物中还有双链环状的质粒DNA； 在非细胞型病毒颗粒内，DNA的存在形式多种多样。
SDS法流程图 （以动物组织为例）
动物组织
抽提
离心洗涤
组织匀浆 细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
酒精沉淀
9
DNA溶液
DNA提取原理和方法
Phenol-chloroform extraction of mouse tail DNA
Approximately ~1 cm of tail is cut and put into an microfuge tube; Add 0.5 ml tail solution and 25 ml Proteinase K, mix well and incubate at 55ºC
overnight or until tissue is dissolved;
More Proteinase K may be added if digestion is not complete after 24 hr;
Add 0.5 ml Phenol/Chloroform and vortex at top speed for 15 min at RT; Spin at 13,0Hale Waihona Puke Baidu0 rpm for 30 min at RT; Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube;
Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT;
If there is no pellet, place samples in -80ºC for 10 min and spin at 13,000 rpm for 25 min at 4ºC;
Add 0.5 ml Chloroform and vortex at top speed for 5 min at RT; Spin at 13,000 rpm for 5 min at RT; Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube, add 50 ml 3 M NaOAc (pH=6.0) and 0.5 ml 100% ethanol, invert several times;
物，从而达到分离目的。 7
DNA提取原理和方法
基因组DNA的提取
➢ 浓盐法：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
➢ 有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
➢ 密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物8
DNA提取原理和方法
基因组DNA－SDS法
after 24 hr;
Proteinase K :
作用：广谱蛋白酶，能在SDS和EDTA的存在下保持很 高的活性，降解蛋白质，将DNA游离。
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DNA提取原理和方法
4. Add 0.5 ml Phenol/Chloroform and vortex at top speed for
1 保证核酸一级结构的完整性； 2 其他生物大分子的污染应降低到最低程度； 3 核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过
高浓度的金属离子； 4 其他核酸分子，如RNA，也应尽量去除。
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DNA提取原理和方法
DNA提取的几种方法
基因组DNA的提取
断裂成为线状
非基因组DNA的提取 ➢ 质粒DNA的提取
2. Add 0.5 ml tail solution and 25 ml Proteinase K, mix well and incubate at 55ºC overnight or until tissue is dissolved;
Tail solution:
1.SDS ：十二烷基硫酸钠
共价闭合环状结构
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DNA提取原理和方法
基因组DNA的提取
根据裂解方式的不同有：
Ⅰ机械法 Ⅱ物理法 Ⅲ化学法
细胞破碎方法
1匀浆法 2捣碎法 3研磨法 1超声法 2反复冻融法 3冷热交替法 4低渗裂解 1有机溶剂 2去垢剂 3酶解法
应用
机体软组织 动物韧性组织 细菌、酵母 细胞混悬液 培养细胞 细菌、病毒 红细胞 细菌、酵母
组织、6培养细胞
细DN菌A提、取酵原理母和方法
基因组DNA的提取
根据核酸分离纯化方式的不同有： ➢ 吸附材料结合法：
• 硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。
• 阴离子交换树脂 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。 适用于纯度要求高的实验。
• 磁珠
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的
Wash pellet once with 70% ethanol, air dry; Resuspend DNA in ddH2O. Use ~100-200 ml ddH2O to get final concentration as 100ng/ml for PCR.
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DNA提取原理和方法
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DNA提取原理和方法
核酸的理化性质
• 极性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂， 钠盐比游离核酸易溶于水。
• 在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液 中较稳定。
• 天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于 细胞核中。
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DNA提取原理和方法
提取DNA总的原则 :
作用：a. 溶解细胞膜、核膜上脂质成分 b.使蛋白质变性
2.Tris：缓冲液
作用：细胞裂解时PH值也能稳定
3.EDTA
作用：是二价金属螯合剂，抑制核酸酶；降低细胞膜的稳定性。
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DNA提取原理和方法
3. More Proteinase K may be added if digestion is not complete
DNA extraction
ZJL
12014.05.09
DNA提取原理和方法
DNA extraction
• 细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结 合成核蛋白。
• 真核生物的DNA又有染色体DNA与细胞器DNA之分。前 者为双链线性分子；后者为双链环状分子。
• 除此之外，在原核生物中还有双链环状的质粒DNA； 在非细胞型病毒颗粒内，DNA的存在形式多种多样。
SDS法流程图 （以动物组织为例）
动物组织
抽提
离心洗涤
组织匀浆 细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
酒精沉淀
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DNA溶液
DNA提取原理和方法
Phenol-chloroform extraction of mouse tail DNA
Approximately ~1 cm of tail is cut and put into an microfuge tube; Add 0.5 ml tail solution and 25 ml Proteinase K, mix well and incubate at 55ºC
overnight or until tissue is dissolved;
More Proteinase K may be added if digestion is not complete after 24 hr;
Add 0.5 ml Phenol/Chloroform and vortex at top speed for 15 min at RT; Spin at 13,0Hale Waihona Puke Baidu0 rpm for 30 min at RT; Transfer the top aqueous phase to a fresh microfuge tube;