HPLC色谱柱使用维护与保养规程

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标准操作规程编号：STD-SOP－EM－033－00题目液相色谱柱使用维护与保养规程颁发部门分析测试中心

制定日期

审核日期

批准日期

分发分析测试中心研发部

目的：建立HPLC色谱柱使用、维护与保养规程

范围：HPLC色谱柱

职责：分析测试中心对本规程的实施负责

正文：

1.色谱柱的构造

色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。

2.液相色谱柱的使用：

色谱柱在使用前，最好进行柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行(出厂测试所使用的条件是最佳条件)，只有这样，测得的结果才有可比性。

2.1样品的前处理：

2.1.1最好使用流动相溶解样品。

2.1.2使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。

2.1.3使用0.45μm（或0.45μm以下）的过滤膜过滤除去微粒杂质。

2.2流动相的配制：

液相色谱是样品组分在柱填料与流动相之间质量交换而达到分离的目的，因此

要求流动相具备以下的特点：

2.2.1流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。

2.2.2流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。

2.2.3流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)。

2.2.4流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。

2.2.5流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。

2.2.6在流动相配制好后，一定要进行脱气。除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。

2.3流动相流速的选择：

因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。对内径为4.6mm的色谱柱，流速一般选择1ml／min，对于内径为4.0mm柱，流速0.8ml／min为佳。

当选用最佳流速时，分析时间可能延长。可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。

注意：

2.3.1由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系(必须使用乙腈的场合除外)。

2.3.2对于正相柱推荐使用沸程为30-60℃的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。用水最好使用超纯水(电阻率大于18兆欧)，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。

2.3.3含水流动相最好在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不

要过夜。最好加入叠氮化钠，防止细菌生长。

2.3.4流动相要求使用0.45 μm（或0.45μm以下）滤膜过滤，除去微粒杂质。

2.3.5使用HPLC级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。

2.4.色谱柱的使用

2.4.1一般反相柱使用方法：先以甲醇：水=10：90（V：V）冲洗柱子45分钟，再换上流动相平衡45分钟，根据基线情况进样（基线漂移不符合要求时应延长平衡时间），分析样品完毕，流动相继续20分钟（或20分钟以上），再换上甲醇：水=10：90（V：V）冲洗柱子45～60分钟，然后再用100％甲醇走40分钟，再放置保存。

2.4.2使用缓冲液（或含盐）作流动相，每天实验完成后，应用10倍柱体积的不含且可溶解缓冲盐的流动相（反相柱：如用10％甲醇（V：V））冲洗色谱柱，便色谱柱中的盐完全洗掉。应特别注意：不能用纯有机溶剂直接冲洗色谱柱，以防止盐析出，堵塞色谱柱或仪器管路，而使色谱柱报废。

2.4.3一般正相柱使用方法：最常使用的流动相是水和乙腈混合物。先以乙腈：水=85：15（V：V）冲洗柱子45分钟，再换上流动相平衡45分钟，根据基线情况进样（基线漂移严重应延长平衡时间），分析样品完毕，流动相继续20分钟（或20分钟以上），再换上乙腈：水=85：15（V：V）冲洗柱子45～60分钟，放置保存。

2.4.4葡聚糖凝胶柱使用。Sephadex G型葡聚糖凝胶只适合在水中使用。用于聚合物的分析检测：（流动相A一般为磷酸盐缓冲液；流动相B常为水）先以水冲洗柱子60分钟，根据基线情况，取对照溶液适量进样分析，分析完毕，再换上流动相A平衡，根据基线情况进样（基线漂移不符合要求时应延长平衡时间），分析样品完毕，流动相继续20分钟（或20分钟以上），再换水冲洗柱子60分钟，然后再用5％迭氮化钠走40分钟，再放置保存。

3.色谱柱的维护与使用

3.1对于反相柱, 长期保存保存色谱柱时应将柱内充满乙腈或甲醇（或70％甲

醇），柱接头要拧紧，防止溶剂挥发干燥。绝对禁止将缓冲溶液留在柱内静置过夜或更长时间。正相柱可以储存于严格脱水后的纯正乙烷中，离子交换柱可以储存于水（含防腐剂叠氮化钠或柳硫汞）中，并将购买新色谱柱时附送的堵头堵上。储存的温度最好是室温.

3.2柱子在装卸、更换时，动作要轻，接头拧紧要适度。必须防止较强的机械振动，以免柱床产生空隙。

3.3如果仪器用来做常规分析，样品种类有限，但分析次数多，则不妨为每一类常规分析配置一根专用柱，这样有助于延长柱子的寿命。

3.4免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能湖缓。

3.5应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱柱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。

3.6如使用柱温控制装置时，应注意在通入流动相后才能升温。

3.7一般说来色谱柱不能反冲，只有生产者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。否则反冲会迅速降低柱效。

3.8选择使用适宜的流动相，以避免固定相破坏。有时可以在进样器前面连接一个预柱。

3.9避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱住之间连接一个保护柱。保护柱一般是填有相似固定相的短柱。保护柱可以而且应该经常更换。

3.10经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。在进行清洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过度，每种流动相的体积应是柱体积的20倍左右，即常规分析需要50～75ml。

3.11色谱柱使用过程中，如果压力升高，一种可能是烧结滤片被堵塞，这时应