H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白在原核系统中的表达
H9N2亚型禽流感病毒NA基因的原核表达及其免疫反应性分析
摘 要 ： 用 Ｐ Ｒ方 法 扩 增 Ｈ９ ２亚 型 禽 流 感 病 毒 Ａ Ｃ ／ Ｓ ２ ９ 采 Ｃ Ｎ ／ ｋ Ｇ ／ ／ ９株 ＮＡ 基 因 （ ０ ｐ ， 隆 至 ｐ Ｔ ２ ａ １４ ０ｂ ） 克 Ｅ －８ （ 载 体 上 ， 建 重 组 原 核 表 达 载 体 ｐ Ｔ ＮＡ， 化 Ｅ ｏｉＬ １ＤＥ ） 受 态 细 胞 ， ＋） 构 Ｅ — 转 ｃｌ ２ （ ３感 Ｂ 以终 浓 度 ０ ８ｍｍｏ／ 的 Ｉ Ｔ ． ｌ Ｌ Ｐ Ｇ 诱 导表 达 ８ｈ 表 达 产 物 经 Ｓ ＳＰ Ｅ和 Ｗ ｅｔｒ－ｌｔ 析 表 明 ： 载体 能 高 效 表 达 ＮＡ 蛋 白 ， 对 分 子 质 量 约 ５ ． Ｄ － ＡＧ ｓｅｎｂｏ 分 该 相 ２
ｔ ｂ ａｎ ｔ ｅｒ ｃ ｍ ｂｎ ｎ ｌｓ ｉ ＥＴ— ｏ ｏ ｔ ｉ ｈ ｅ ｏ ｉ ａ ｔｐ ａ ｍ ｄｐ ＮＡ． ｅｔｒ ｅ ｅ ｅｗａ ｕ ｃ ｓ ｆ ｌｙｅ ｐ ｅ ｓ ｄｉ ｈ ｏ ｔｃ ｌ Ｅ Ｔｈ ａ ｇ ｔ ｎ ｓｓ ｃ ｅ ｓｕ ｌ ｘ ｒ ｓ ｅ ｔ ｅｈ ｓ ｅｌ ｇ ｎ
ｓｒ ｉｓｏ ｖａ ｎ ｌ ｅ ｚ ｉｕ ． ｅｃ ｒｅ ｔＮＡ ｅ ｅｗａ ｓ ｒｅ ｔ ｈ ｘ ｒ ｓ ｉｎ ｖ ｃｏ ＥＴ－ ８ （ ） ｔａｎ ｆａ ｉｎ ｉ ｆ ｎ ａ ｖｒ ｓ Ｔｈ ｏ ｒ ｃ ｕ ｇ ｎ ｓｉ ｅ ｔ ｄ ｉ ｏｔ ｅｅ ｐ ｅ ｓｏ ｅ ｔ ｒｐ ｎ ｎ ２ａ ＋
易 华 山 侯 顺 利 ｈ ， 军政 胡 永 浩。包 世 俊。 常 惠 芸 ３ ＇ 独 ， ， ，
（ ．中 国农 业 科 学 院 兰 州 兽 医研 究所 ， 畜 疫 病 病 原生 物 学 国 家 重 点 实 验 室 ， 业 部 畜 禽 病 毒 学 重 点 １ 家 农
禽流感病毒血凝素蛋白的结构、功能与表达
禽流感病毒血凝素蛋白的结构、功能与表达
汪天杰;李槿年;江定丰;余为一
【期刊名称】《现代生物医学进展》
【年(卷),期】2006(006)004
【摘要】血凝素蛋白(HA)既是一种重要吸附蛋白,介导禽流感病毒吸附和穿入宿主细胞而发挥致病作用,也是一种良好的保护性抗原, 对宿主抵抗禽流感起到了决定性保护作用.研究HA蛋白对揭示禽流感病毒的致病机理和免疫防治禽流感均具有重要意义.本文重点概述了HA蛋白的结构、功能和蛋白表达方面的研究进展,并对HA蛋白在禽流感疫苗中的应用进行了探讨.
【总页数】3页(P61-62,72)
【作者】汪天杰;李槿年;江定丰;余为一
【作者单位】安徽农业大学动物科技学院,安徽,合肥,230036;安徽农业大学动物科技学院,安徽,合肥,230036;安徽省兽医工作总站,安徽,合肥,230022;安徽农业大学动物科技学院,安徽,合肥,230036
【正文语种】中文
【中图分类】R5
【相关文献】
1.H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白在原核系统中的表达 [J], 石锐;包红梅;姜永萍;乔传玲;陈化兰;王秀荣;陈维多
2.禽流感病毒H5N1血凝素蛋白的重组牛痘病毒表达 [J], 谌资;郑煜煌;Yipu Lin
3.荧光蛋白标记表达H6亚型禽流感病毒血凝素基因 [J], 华文君;乔宪凤;刘西梅;郑新民;周荆荣
4.禽流感病毒血凝素糖蛋白(HA)的结构及其生物学功能 [J], 陈一兵;刘岳龙;霍金富
5.禽流感病毒血凝素与核蛋白在重组禽痘病毒中的共表达 [J], 乔传玲;张建林;贾永清;邓国华;姜永萍;王秀荣;孟庆文;于康震
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H9亚型禽流感病毒HA基因的真核表达及其功能的初步研究的开题报告
H9亚型禽流感病毒HA基因的真核表达及其功能的初步研
究的开题报告
1.研究背景
禽流感病毒是一种由禽类传播的高致病性病毒，能够引起禽流感病，并有可能对人类造成威胁。
其中H9亚型禽流感病毒是目前世界上广泛传播的一种亚型，已经引起了广泛的关注。
HA基因编码禽流感病毒表面的血凝素，是禽流感病毒的主要抗原，是禽流感病毒的研究热点之一。
2.研究目的
本次研究旨在探讨H9亚型禽流感病毒HA基因在真核细胞中的表达情况以及其功能的初步分析。
3.研究内容
（1）构建H9亚型禽流感病毒HA基因真核表达载体，并进行酵母菌双杂交实验，筛选HA基因可能的互作蛋白。
（2）将构建的HA基因真核表达载体转染至293T细胞中，利用Western blot检测HA 蛋白的表达量及其免疫原性。
（3）将HA基因真核表达系统转染至细胞中，利用定量PCR和荧光显微镜观察HA基因是否能够正确地表达、定位和结构成熟。
（4）利用免疫印迹和荧光显微镜等方法研究HA蛋白是否能够与细胞膜结合，并分析其在细胞生命周期中的分布和运动情况。
4.研究意义
本研究将为深入了解H9亚型禽流感病毒HA基因的功能以及其在病毒侵袭过程中的作用提供一定的参考。
同时，研究结果还将为开发新型的禽流感疫苗提供具体的理论基础和实验途径。
H9N2亚型禽流感病毒辽宁分离株HA1蛋白的原核表达
碱基 。根据 ｐ Ｇ Ｅ Ｘ 一 ６ ｐ 一 １的序 列 ， 在 质粒 多 克 隆 位 点 机 体产 生 中和 性 抗 体 ， 是 刺 激 机 体 产 生 保 护 性 免 疫 上 下游 设计 一对 可 以扩增 出 １ ８ ８ ｂ ｐ片段 的引 物 。上
游 引 物 ｐ ＧＥ Ｘ ５ ：５ 一 Ｇ ＧＧＣ ＴＧＧ Ｃ ＡＡＧＣ Ｃ ＡＣ Ｇ Ｔ — ＴＴ ＧＧＴ Ｇ一 ３ ， 下 游 引物 ｐ ＧＥ Ｘ ３ ： ５ ， ＿ Ｃ Ｃ ＧＧ ＧＡＧＣ Ｔ—
１ ． １ ． ２ 试剂 Ｔ ａ ｑ Ｄ ＮＡ 聚合 酶 、 ｄ ＮＴＰ ｓ 、 Ｍ— ＭＬ Ｖ 反转 录酶 、 Ｄ ＮＡ 琼脂 糖凝 胶 回收试 剂盒 、 ｐ ＭＤＴ 一 ２ ０ 一
Ｔ Ｖｅ ｃ ｔ ｏ ｒ 、 限制 性 内切 酶 Ｂａ ｍＨ Ｉ、 限制 性 内切 酶 Ｘｈ ｏ工、 Ｔ４ ＤＮＡ 连 接 酶 均 购 自宝 生 物 工 程 （ 大连） 有 限公 司 。表 达 载体 ｐ Ｇ Ｅ Ｘ 一 ６ ｐ － １ ， 宿 主 菌 大 肠 埃 希 菌 Ｂ Ｌ ２ １ （ Ｄ Ｅ ３ ） 购 自Ｐ ｈ ａ ｒ ｍａ ｃ ｉ ａ公 司 。
禽 流感 是 由 Ａ 型 流 感 病 毒 引 起 的一 种 禽 类 的
感染 或 疾病 综 合 征 。 自 １ ９ ６ ６年 Ｈｏ Ｍｅ ｅ从 患 温 和
２ ０ １ ０年分 离 自辽 宁某 鸡场 病鸡 。Ｈ９ Ｎ２亚 型 禽流感
阳性 血 清 由青 岛澳 兰百 特生 物工 程有 限公 司提供 。
ＨＡ１ 基 因片段 ， 将扩 增得 到 的 ＨＡ１ 基 因克 隆至原核 表 达载 体 ｐ Ｏ Ｅ Ｘ 一 ６ ｐ 一 １中， 转化 到 Ｂ Ｌ ２ １ （ Ｄ Ｅ ３ ） 中进行 表
达 。结果表 明 ， Ｉ Ｐ Ｔ Ｇ 诱 导融合 蛋 白表 达条 件确 定 最佳 诱 导 时 间为 ８ ｈ ，Ｉ Ｐ ＴＧ 最 佳 终 浓度 为 ０ ． ８ ｍｍｏ ｌ ／ Ｌ。
新型抗原亚群H9病毒的血凝素蛋白单克隆抗体的制备与鉴定
Chinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报收稿日期：2021-02-22基金项目：十三五重点研发计划（2018YFD0501506）；上海自然科学基金（18ZR1449000）作者简介：闫婉婉，女，硕士研究生，兽医专业通信作者：李泽君，E-mail：****************.cn；滕巧泱，E-mail：***************.cn 2023,31(4):158-163·研究论文·新型抗原亚群H9病毒的血凝素蛋白单克隆抗体的制备与鉴定摘 要：H9N2亚型禽流感病毒（AIV ）抗原变异迅速，相继于2009年及2013年分别出现新的抗原亚群病毒，对该病毒的防控带来了极大的挑战。
目前，关于H9N2禽流感病毒形成不同抗原亚群机制，尚不清楚。
流感病毒血凝素蛋白（HA ）的单克隆抗体是研究该机制的基础工具。
为此，本研究通过血凝抑制（HI ）实验筛选到1株新型的抗原亚群H9N2病毒H514。
通过杂交瘤细胞融合技术以及间接免疫荧光的方法，筛选到5株抗H514病毒HA 蛋白的单抗，均属于IgG 亚型。
Western blot 结果表明5株单克隆抗体中只有5E9作用的是线性表位，其余4株皆是针对构象表位。
进一步地研究发现，这5株单克隆抗体对H514株皆有HI 活性，最高达到28。
这些结果为H9N2亚型禽流感病毒的抗原性分子研究提供了重要材料。
关键词：H9N2亚型；禽流感病毒；抗原变异；单克隆抗体；血凝素中图分类号：S852.659.5文献标志码：A文章编号：1674-6422（2023）04-0158-06Preparation and Identifi cation of Monolonal Antibodies Againist HemagglutininProtein of Novel Antigen Subgroup of H9 Avian Infl uenza VirusYAN Wanwan, LI Xuesong, SU Xin, SHI Xiaona, CHEN Xinwu, WEI Penghua, LIU Qinfang, YANG Jianmei, YAN Dawei, ZHANG Zhifei, LI Zejun, TENG Qiaoyang(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)闫婉婉，李雪松，宿 鑫，石晓娜，陈新武，魏朋华，刘芹防，杨健美，闫大为，张志飞，李泽君，滕巧泱（中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）Abstract: The antigen of H9N2 subtype avian infl uenza virus (Avian infl uenza virus, AIV) has mutated rapidly, and different antigen subgroups appeared in 2009 and 2013, which brought great challenges to the prevention and control of this virus. What is the molecular basis of H9N2 AIV forming different antigen subgroups? Not clear so far. Monoclonal antibodies (MAbs) against Influenza virus hemagglutinin (HA) are the basic tools for studying the molecular mechanism. For this reason, we used the hemagglutination inhibition (HI) experiment and found a new antigenic subgroup of H9N2 virus H514 isolate. In this study, 5 MAbs against the HA protein of the H514 virus were selected from hybridomas as screened by indirect immunofluorescence. All of these 5 MAbs belonged to the IgG subtype. Western blot showed that MAb 5E9 acted on the linear epitope of the HA protein and other 4 MAbs were all directed to the conformational epitopes. Further research found that all 5 MAbs had HI activity against H514 virus with titer up to 28. These results provided important materials for studying molecular biology of H9N2 subtype AIV .Key words: H9N2 subtype; Avian influenza virus; antigen variation; monoclonal antibody; hemagglutinin· 159 ·闫婉婉等：新型抗原亚群H9病毒的血凝素蛋白单克隆抗体的制备与鉴定第31卷第4期自上世纪90年代初以来，H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus, AIV）一直在亚洲家禽中流行，虽然H9N2亚型禽流感病毒本身引起禽类的死亡率较低，但它常和其他病原混合感染禽类[1]，有研究证实H9N2禽流感病毒与传染性喉气管炎病毒或传染性支气管炎病毒共感染时，往往会导致高死亡率[2-3]。
不同来源 H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白生物学分析
不同来源 H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白生物学分析乔乔;谭福燕;熊红叶;余克花;刘金辉【期刊名称】《南昌大学学报（医学版）》【年(卷),期】2016(056)005【摘要】ABSTRACT:Objective To perform a comparative bioinformatics analysis of H9 hemagglutinin of different strains of H9N2 avian influenza virus,and to find out the important bioinformatics data. Methods The amino acid and nucleotide sequences of H9 hemagglutinin of different strains of H9N2 avian influenza virus were retrieved from GeneBank.Clustal X and Bioedit softwares were used to align different amino acid and nucleotide sequences and to calculate the homologues. AntheProt5.0 software was used to predict the secondary structures.Results The length of open reading frame of H9 hemagglutinin was 1683 bp,which encoded a peptide consisting of 560 amino acids.The nucleotide and amino acid identities of H9 hemagglutinin of different strains of H9N2 avian influenza virus ranged from 90.6% to 99.8% and from 93.0% to 99.4%,respectively. There were 84 mutation sites(15.03%)in the sequence.The cleavage sites resulting in production of A1 and A2 subunits were located at aa333-aa341region of PSRSSR↓ GLF.The A334T and R335G mutations occurred in two of the 18 H9 hemagglutinin proteins,respectively.H9 hemagglutinin was rich in α-helices(25%-27%),β-pleated sheets(29%-32%),β-turn(25%-27%) and coil structures (17%-19%).The receptor binding domainwas composed of R100,W161, T163,N191,198 (A/V/T),L202 andY203.Conclusion The sequence and conformation of domain with important function in H9 hemagglutinin of different strains of H9N2 avian influenza virus are conservative and stable.%目的：对不同来源的 H9N2亚型禽流感病毒血凝素蛋白进行生物信息学比较分析，以找出重要的生物信息学数据。
H9N2亚型禽流感病毒HA基因真核和原核表达及其单因子血清的制备的开题报告
H9N2亚型禽流感病毒HA基因真核和原核表达及其单因子血清的制备的开题报告
1. 研究背景和意义
禽流感是由禽流感病毒引起的一种传染病，主要影响禽类动物，但有时也可传染给人。
其中，H9N2亚型禽流感病毒是最常见的亚型之一，对于禽类的养殖业和食品安全都有着重要的影响。
在现有的研究中，禽流感病毒HA (血凝素) 基因是重点研究的对象之一。
HA基因编码了病毒表面的血凝素蛋白，是病毒感染宿主细胞和诱导免疫应答的关键分子。
因此，研究禽流感病毒HA基因的真核和原核表达及其单因子血清制备，对于病毒的病理学、免疫学及其防控具有重要意义。
这也是本研究的研究重点和意义所在。
2. 研究内容和方法
本研究的主要内容和方法如下：
2.1 真核和原核表达禽流感病毒HA基因
针对H9N2亚型禽流感病毒HA基因的序列，设计引物并采用PCR 扩增，获得HA基因。
将这一HA基因克隆到真核和原核表达载体中，利用真核表达系统和原核表达系统分别表达HA蛋白。
2.2 单因子血清的制备
将表达的HA蛋白纯化并制备成单因子血清。
接着，对单因子血清进行免疫活性鉴定。
具体方法包括Western blot和ELISA等。
3. 预期结果和意义
本研究预计能够成功表达H9N2亚型禽流感病毒HA基因，并获得对应的纯化蛋白。
此外，还将成功制备HA蛋白的单因子血清，并进一步验
证其免疫活性。
这些结果将为禽流感防控提供实验基础和技术支持，对于疫苗、诊断和防控具有重要意义。
表达H9亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力
表达H9亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力程坚;刘秀梵;彭大新;刘红旗【期刊名称】《微生物学报》【年(卷),期】2002(042)004【摘要】以RT-PCR法扩增获得H9亚型禽流感病毒(AIV)分离株(A/Chicken/China/F/1998)的血凝素(HA)基因,将其定向插入鸡痘病毒转移载体1175的痘苗病毒启动子P7.5的下游,得到重组转移载体1175HA.以脂质体转染法将1175HA转染至已感染鸡痘病毒282E4疫苗株(wt-FPV)的鸡胚成纤维细胞(CEF)中,通过在含X-gal的营养琼脂上连续挑选蓝色病毒蚀斑获得并纯化rFPV-HA.以间接免疫荧光法证实感染rFPV-HA的CEF表达了HA.rFPV-HA在免疫7日龄SPF 鸡7天后即能诱生可检出的血凝抑制(HI)抗体,14天后诱生的HI抗体到达高峰,且诱生的HI抗体保持较高水平达55天.在7日龄SPF鸡及含抗FPV母源抗体的商品鸡上进行的免疫效力试验表明,rFPV-HV能显著抑制静脉攻毒后免疫鸡从泄殖腔的排毒,效果与AIV全病毒灭活苗相当.【总页数】6页(P442-447)【作者】程坚;刘秀梵;彭大新;刘红旗【作者单位】扬州大学畜禽传染病学农业部重点开放实验室,扬州,225009;扬州大学畜禽传染病学农业部重点开放实验室,扬州,225009;扬州大学畜禽传染病学农业部重点开放实验室,扬州,225009;扬州大学畜禽传染病学农业部重点开放实验室,扬州,225009【正文语种】中文【中图分类】S852.65【相关文献】1.共表达鸡IL-6和H5亚型禽流感病毒HA基因重组鸡痘病毒免疫抗体消长规律及免疫效力研究 [J], 陈素娟;丁彦红;钱程;柴茂;彭大新;刘秀梵2.两株表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒的构建及其免疫效力 [J], 刘武杰;孙蕾;陈素娟;徐忠林;刘金彪;刘秀梵3.单表达和共表达NDV F和HN基因重组鸡痘病毒活疫苗的免疫效力比较试验[J], 甘军纪;田志鹏;陶鸽;陈素娟;彭大新;刘秀梵4.高效表达H9亚型禽流感病毒HA基因的重组鸡痘病毒的构建及免疫效力试验[J], 陈平;陈素娟;彭大新;刘秀梵5.共表达H_9亚型禽流行性感冒病毒血凝素基因和鸡Ⅱ型干扰素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力 [J], 程坚;刘秀梵;彭大新;刘红旗;吴艳涛;张如宽因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
H9亚型禽流感病毒的分离及初步鉴定
H9亚型禽流感病毒的分离及初步鉴定朱春华;江斌;刘斌琼;林甦;陈珍;黄瑜【摘要】2011 two strains (FZ-04 and FZ-11) were isolated respectively from two broiler farms in Fujian, Hemagglutination test results showed that the isolated allantoic fluid can induce 1% chicken erythrocytes agglutination. Hemagglutination inhibition test results showed that the isolates allantoic fluids were only inhibited by avian influenza virus subtype H9 standard serum specificly. Specified and conserved M (Matrix) gene and HA (Hemagglutinin) gene of H9 subtype were amplified by RT-PCR with the segment lengths of 229bp and 732bp respectively. The results indicated that the isolated strains were H9 subtype of influenza A virus. The phylogenetic analysis of HA genes showed that isolates and representative strains CK/FJ/G9/09 have a closest relationship, belonging to the major sublineage CK/BJ/1/94 in China.%2011年从福建省2个肉鸡场分离到2株病毒,分别为FZ-04株和FZ-11株.血凝试验结果表明,分离株尿囊液可凝集1％鸡红细胞.血凝抑制试验结果表明,分离株尿囊液只被抗禽流感病毒H9亚型标准阳性血清特异性抑制.采用RT-PCR法对分离株M基因和H9亚型HA基因保守片段进行扩增,分别扩增出229 bp和732 bp特异性目的片段.结果表明,分离株为A型H9亚型禽流感病毒.HA基因遗传进化分析结果表明,分离株与代表株CK/FJ/G9/09亲缘关系最近,属于国内常见的CK/BJ/1/94群系.【期刊名称】《福建农业学报》【年(卷),期】2011(026)004【总页数】4页(P537-540)【关键词】禽流感病毒;肉鸡;分离【作者】朱春华;江斌;刘斌琼;林甦;陈珍;黄瑜【作者单位】福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建福州350013;福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心,福建福州350013【正文语种】中文禽流感（AI）是由正粘病毒科流感病毒属A型流感病毒引起的禽类及其他鸟类的一种感染和／或疾病综合征[1]。
禽流感病毒HA蛋白的原核表达与鉴定
期的 ７０ｋＤ处有明显的蛋白印迹条带，说明已成功实现了在大肠杆菌中高效表达禽流感病毒
ＨＡ蛋白，为后续开展禽流感检测方法及疫苗的研究奠定了基础。
关 键 词：禽流感病毒；血凝素蛋白；原核表达；镍柱纯化；蛋白免疫印迹
中图分类号：Ｓ８５２．４ 文献标识码：Ａ
文章编号：１６７４－８４２５（２０１９）０５－０１３７－０５
白，并对纯化后的重组蛋白进行 ＳＤＳＰＡＧＥ分析及 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定。结果表明：当重组菌株
ｐＥＴ２８ａ（＋）－ＨＡ／ＢＬ２１（ＤＥ３）诱导条件为 ３０℃、ＩＰＴＧ浓度为 １ｍｍｏｌ／Ｌ诱导 ８ｈ时，ＨＡ蛋白
表达量最高；ＳＤＳＰＡＧＥ电泳显示经镍柱纯化后 ＨＡ蛋白纯度较高，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ实验发现在预
作者简介：李令臣，男，硕士研究生，主要从事疫苗与诊断试剂研究，Ｅｍａｉｌ：１５０６５３６７１９＠ｑｑ．ｃｏｍ；通讯作者 吴胜昔， 男，博士，教授，主要从事疫苗与诊断试剂研究，Ｅｍａｉｌ：ｓｘｗｕ２００４＠ｃｑｕｔ．ｅｄｕ．ｃｎ。
１３８
重庆理工大学学报
ＧｅｎＢａｎｋ，ＷｉｔｈｏｕｔｃｈａｎｇｉｎｇｔｈｅａｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆｔｈｅＨＡ ｐｒｏｔｅｉｎ，ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｌａｒｇｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎｅｂａｃｉｌｌｕｓｃｏｄｏｎｐｒｅｆｅｒｅｎｃｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅ，ｔｈｅｗｈｏｌｅｇｅｎｅｗａｓｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄｉｎｔｏＨＡ
禽流感病毒（H9亚型）LN株的分离鉴定及生物学特性研究
禽流感病毒（H9亚型）LN株的分离鉴定及生物学特性研究作者：王志国来源：《兽医导刊》 2017年第4期禽流行性感冒( 简称禽流感，Avain Influenza,AI)是由A 型流感病毒引起的一种禽类( 包括家禽和野禽)的感染疾病综合征，主要引起禽类的全身性或呼吸系统性疾病，被世界动物卫生组织确立为A 类传染病。
根据禽流感致病性的不同，可以将禽流感分为高致病性禽流感、低致病性禽流感和无致病性禽流感。
H9N2 亚型禽流感属于低致病性禽流感，发病率高，但死亡率低。
2010 年，笔者于辽宁某市某养殖场的发病鸡群中分离到一株禽流感病毒，经鉴定为H9N2 亚型禽流感，命名为LN 株，其具有经胰酶处理后能在细胞上增殖的特性。
为了评价MDCK 细胞高适应的禽流感疫苗株LN 的生物学特性和免疫效果，我们进行了一系列的试验研究。
一、试验方法（一）病毒的分离2010 年，从辽宁省某养鸡地区的疑似H9N2 禽流感发病鸡群中，无菌采取具有典型临床症状病鸡的肺脏和肝脏等剪碎，按1∶5（W/V）加入灭菌生理盐水后，研钵研磨后-40℃到室温冻融3 次，经3 000 r/min 离心15 min 取上清液备用。
将上述病料上清液通过0.22μm 微孔滤器除菌，尿囊腔接种10 日龄非免疫鸡胚。
每份病料接种8 枚鸡胚，每枚鸡胚接种0.2 ml，同时作不接种对照，37℃孵育。
弃去24 h 内死胚，无菌收集48 h 的鸡胚尿囊液，-40℃保存备用。
病毒分离后需要在SPF 鸡胚上进行3 次终点有限稀释克隆纯化，即每一次均取最高稀释度有血凝价鸡胚尿囊液作为下一次传代纯化的种毒，如此经三次纯化后，以10-3 稀释接种9 ～11 日龄SPF 胚，48 小时后收取鸡胚尿囊液，经菌检证明无污染，分装于小管中作为种毒贮存于-70℃。
（二）血清学及RT-PCR 鉴定将无菌收集的鸡胚尿囊液以1.0% 鸡红细胞悬液采用β 微量法进行HA 试验，以HA 价≥ 3 log2 为试验阳性。
H9N2型禽流感病毒核蛋白的原核表达及多克隆抗体制备
［ 中图 分 类 号 ］ Ｑ ８ ７
［ 文献 标 识 码 ］ Ａ
Ｅｘ ｅ ｓｏ ｏ Ｎｕｃｅ Ｐｒ ｔ ｉ ｏ Ａｖ ａ ｐｒ ｓ ｉ ｎ ｆ ｌａｒ ｏ ｅｎ ｆ ｉ ｎ Ｉ ｆｕ ｎ ａ ｎ ｅ ｚ Ｖｉ ｕ Ｈ９Ｎ２ ｎ ｌ ｒｓ ｉ Ｅｓ ｈ ｒｃ ａ ｏ ｉ ｃ ｅ ｉ ｈｉ ｃ ｌ
Ｃ ｌ ｇ ｆ Ｖｅｅ ｎ ｒ ｄ ｃ ｎ ，Ｈｕ ｚ ｏ ｇ Ａｇ ｉ ｕ ｔｒ ｌ Ｕｎ ｖ ｒｉ ，Ｗｕ ａ ３ ０ ０ ｏｌ ｅ ｏ ｔｒ ａ ｙ Ｍｅ ｉｉ ｅ ｅ ｉ ａ ｈ ｎ ｒｃ ｌ ａ ｉｅｓ ｔ ｕ ｙ ｈ ｎ ４ ０ ７ ，Ｃ ｉ ａ ｈｎ
［ ｂ ｔａｔ Ｏｂｅｔ ｅ ｓ ｇＥｃｌ ｔ ｅｐｅｓａｉ ｎ ｕ ｎａ ｖ ｕ （ Ｉ Ａ ｓ ｃ］ ｒ ｊｃｉ ：Ｕ ｉ ．ｏ ｘ ｒｓ ｖ ｎ ｉｆ ｅ ｚ ｉ ｓＡＶ）ｎ ｃｅｒｐｏｅ （ Ｐ 一 Ｓ ｕ ｉ ｒｔｉ． ｆ ． ｖ ｎ ｉｏ ａ ｌ ｒ ｕｌａ ｒｔｎ Ｎ ） Ｇ Ｔ ｆｓ ｎ ｐｏｅ Ａ ｉ ｉ ｏ ｎ ｎ
ｉ ｈ ｏ ｔｇ ａ ｈ ｗ ｓ ｕ ｅ ｏ ｐ ｒ ｙ ｈ ｕ ｉ ｎ ｐ ｏｅ ｎ ａ ｄ ｐ ｌｃｏ ａ ｎ ｉ ｏ ｙ ａ ａ ｎ ｔ ｔ ｅ ｐ ｏ ｅｎ ｗａ ｒ ｐ ｒ ｄ ｉ ａ ｂ ｔ ｔ ｃ ｒ ｍａｏ ｒ ｐ ａ ｓ ｄ ｔ ｕ ｆ ｔｅ ｆ ｓ ｒ ｔｉ ｎ ｏｙ ｌ ｎ ａ ｔ ｄ ｇ ｉ ｓ ｈ ｒｔ ｉ ｓ ｐ ｅ ａ ｅ ｎ ｒｂ ｉ ｙ ｉ ｏ ｌ ｂ ． Ｍ ｅ ｈ ｄ ： ＡＩ ＮＰ ｃ ｔｏ ｓ Ｖ ＤＮＡ ｗ ｓ ｉ ｓ ｒ ｄ ｉ ｔ ｈ ｅ ｔｒ ｐ ＥＸ— ｎ ｒ ｎ ｆ ｒ ｄ ｔ ｃ ｌ ＢＬ １ ｏ ｏ ｌ ｓ ｆｒ ｅ ｐ ｅ ｓ ａ ｎ ｅｔ ｎ ｏ ｔ ｅ ｖ ｃｏ Ｇ ｅ — ＫＧ ａ ｄ ｔ ｓ ｍｅ ｏ Ｅ．ｏｉ ａ ｏ ２ ｃ ｄ ｎ ｐ ｕ ｏ ｘ ｒ ｓ ・ ．
H9N2亚型禽流感病毒HA基因的原核表达及其免疫反应性分析
ＡＢ Ｓ Ｔ ＲＡＣＴ： Ｉ ｎ ｏ ｒ ｄ ｅ ｒ ｔ Ｏ ｅ ｘ ｐ ｒ ｅ ｓ ｓ ａ ｖ ｉ ａ ｎ ｉ ｎ ｆ ｌ ｕ ｅ ｎ ｚ ａ ｖ ｉ ｒ ｕ ｓ ＨＡ ｇ ｅ ｎ ｅ ａ ｎ ｄ ｔ Ｏ ａ ｎ ａ ｌ ｙ ｚ ｅ ｉ ｔ ｓ ｉ ｍｍｕ ｎ ｏ ｒ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｖ ｉ ｔ ｙ，ｔ ｈ ｅ ＨＡ ｇ ｅ ｎ ｅ ｗｉ ｔ ｈ ａ
（ １ ． Ｋｅ ｙ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｏ ｆ Ａｎ ｉ ｍ ａ ｌ Ｖ ｉ ｒ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ ｏ ｆ Ｍｉ ｎ ｉ ｓ ｔ ｒ ｙ ｏ ｆ Ａｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ｅ ， Ｓ ｔ ａ ｔ ｅ Ｋｅ ｙ Ｌ ａ ｂ ｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｏ ｆ Ｖ ｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎ ａ ｒ ｙ Ｅ ｔ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｉ ｃ ａ ｌ Ｂ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇ ｙ， Ｌ ａ ｎ ｚ ｈ ｏ ｕ Ｖ ｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎ ａ ｒ ｙ Ｒｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕ ｔ ｅ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ｅ ｓ ｅ Ａｃ ａ ｄ ｅ ｍｙ ｏ ｆ Ａｇ ｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕ ｒ ａ ｌ Ｓ ｃ ｉ ｅ ｎ ｃ ｅ ｓ ， Ｌ ａ ｎ ｚ ｈ ｏ ｕ ７ ３ ０ ０ ４ ６ ，Ｃ ｈ ｉ ｎ ａ ；
ｐ Ｅ Ｔ — ＨＡ， 该 载 体 能 高 效 表 达 ＨＡ 蛋 白， 相对分子质量约 ６ ２ ｋ Ｄ ａ ， 在约 ６ ２ ｋ Ｄ ａ处 出现 一 条 明 显 的特 异 性 蛋 白条 带 。结论 成 功
表 达 了禽 流 感病 毒 ＨＡ 蛋 白， 该 蛋 白纯 化 产 物 能 与 Ｈ９亚 型 的 ＡＩ Ｖ 鸡 血 清发 生特 异 性反 应 。 关 键词 ： 禽流感； 血凝 索； Ｈ９ Ｎ ２ ； 原核表达 ； 免疫 反 应 性 中 图分 类 号 ： Ｒ ３ ７ ３ ． ９ 文献标识码 ： Ａ
H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆与表达
动物 医学进 展 ．０ ６２ （） ５—０ ２０ ，７８ ：６６
Ｐ ｏ ｒ ｓ ｅｅ ｉａ ｙ Ｍ ｅ ｉｉｅ ｒ ｇ ｅ ｓｉ Ｖ ｔ ｒｎ ｒ ｄ ｃ ｎ ｎ
Ｈ９ 亚型禽 流感病 毒血 凝素基 因的克 隆与表达 Ｎ２
王金 萍 ， 建领 ， 富 强 ， 媛 媛 宋 张 胡
Ｙｕ ｎ ｎ Ｘ ｅＩ １ ９ （ Ｎ２ ， Ｃ ｉｋ ｎ Ｙｕ ｎ ｎ ｎ ａ ／ ｉ ／ ９ ９ Ｈ９ ） Ａ／ ｈｃ ｅ／ ｎ ａ ／ －
亚型的划分依据 ， 前 已知 ＨＡ共有 １ 种亚型（ Ｋ ０ ／０４ Ｈ５ ） 本实验室分 离 、 目 ６ Ｈ１ ０１ ２０ （ Ｎ１ ， 鉴定、 保存 ； 原 Ｈ１ ）ＮＡ 共 有 ９种 亚 型 （ ～ Ｎ９ 。 ＨＡ 是 由 核表 达 质粒 ｐ Ｔ ０ ／ ＴＯ Ｏ、 ６、 Ｎ１ ） Ｅ １ ０Ｄ－ Ｐ 大肠 埃 希 菌 ＴＯ Ｉ ＰＯ
未见 对云 南 Ｈｇ Ｎ２亚 型 流 行 毒 株 ＨＡ 全基 因 的 克
隆表达研究 。本研究在分析 Ｈ９ ２ Ｎ 亚型禽流感云南
对 Ｃ ｉ ｎ Ｙｕ － ｋ 禽流感 （ ｉｎｉｆ ｅｚ， ） 称 欧洲 鸡 瘟 、 Ａｖａ ｌ ｎａＡＩ曾 ｎｕ 真 地方 毒 株 ＨＡ 基 因 的 基 础 上 ， Ａ／ ｈｃｅ／ ｎ ａ／ ｉ ／ ９ ９Ｈ９ ） － 性 鸡瘟 （ｒｌ ｗｌ ｌｇ ｅ ， 由 Ａ 型流感 病毒 引起 ｎｎ Ｘｅ１１ ９ （ Ｎ２ 毒 株 ＨＡ 全 基 因进 行 克 隆 ｔｕｙｆ ａ ｕ）是 ｏ ｐ 并采 用 阳性 血 清 对 表 达 产 物 的免 疫 反应 性 进 的一种 禽 类 感 染 和 疾 病 综 合 征 ［ 。近 年 来 中 国香 表达 ， １ ］ 以期 获得 高 纯度重 组 抗 原 ， 为禽 流感 病毒 港 、 国、 南暴 发 Ｈ５ 、 Ｎ２亚 型禽 流感 ， 存 行 了分析 ， 泰 越 Ｎ１ Ｈｇ 并
H9N2亚型禽流感病毒非结构蛋白基因的克隆及原核表达
Ｌａ ｂｏ ｒ ａ ｔ ｏ ｒ ｙ ｏｆ Ｖｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎａ ｒ ｙ Ｅｔ ｉ ｏ ｌ ｏ ｇｉ ｃ ａ ｌ Ｂｉ ｏｌ ｏ ｇｙ， Ｌａ ｎ ｚ ｈ ｏｕ Ｖｅ ｔ ｅ ｒ ｉ ｎ ａ ｒ ｙ Ｒｅ ｓ ｅ ａ ｒ ｃ ｈ Ｉ ｎ ｓ ｔ ｉ ｔ ｕｔ ｅ， Ｃｈｉ ｎｅ ｓ ｅ Ａｃ ａ ｄ ｅ ｍｙ ｏｆ Ａｇｒ ｉ ｃ ｕ ｌ ｔ ｕｒ ａ ｌ Ｓｃ ｉ ｅ ｎｃ ｅ ｓ，Ｌａ ｎ ｚ ｈｏ ｕ ７３ ０ ０ ４６，Ｃｈｉ ｎ ａ
Ｗｅ ｓ ｔ ｅ ｒ ｎ ｂｌ ｏ ｔ ．Ｒｅ ｓ ｕｌ ｔ ｓ Ｔｈｅ ｐ ＥＴ— ＮＳ１ ｐｌ ａ ｓ ｍｉ ｄ ｃ ｏｕ ｌ ｄ ｈｉ ｇ ｈｌ ｙ ｅ ｘｐｒ ｅ ｓ ｓ ＮＳ１ ｐｒ ｏ ｔ ｅ ｉ ｎ ｗｉ ｔ ｈ ｒ ｅ ｌ ａ ｔ ｉ ｖ ｅ ｍｏ ｌ ｅ ｃ ｕｌ ａ ｒ ｍａ ｓ ｓ ｏｆ ａ ｐ ｐｒ ｏ ｘｉ ｍａ ｔ ｅ ｌ ｙ ２ ５ ０ ００ ｏｂ ｓ ｅｒ ｖ ｅ ｄ ｏ ｎ ｔ ｈ ｅ ＳＤＳ— ＰＡＧＥ ｇｅ １ ． Ｔｈ ｅ ｐｕｒ ｉ ｆ ｉ ｃ ａｔ ｉ ｏ ｎ ｐｒ ｏ ｄｕ ｃ ｔ ｉ ｏｎ ｏｆ
禽流感病毒血凝素与核蛋白在重组禽痘病毒中的共表达
禽流感病毒血凝素与核蛋白在重组禽痘病毒中的共表达乔传玲;张建林;贾永清;邓国华;姜永萍;王秀荣;孟庆文;于康震【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2003(024)001【摘要】为克服禽流感病毒(AIV)血凝素(HA)仅诱导机体产生亚型特异性免疫应答的不足,本研究拟将病毒核蛋白(NP)基因与HA基因在重组禽痘病毒中实现共表达.首先构建转移载体,从测序质粒pUCNP中切下目的基因克隆到载体pSY538早晚期启动子LP2EP2的下游,再将含有禽痘病毒早晚期启动子LP2EP2的NP基因片段亚克隆到已有的AIV HA基因重组禽痘病毒转移载体中,即得到同时含有HA和NP两种基因的重组转移载体pSY(HA+NP).将转移载体脂质体转染已感染禽痘病毒亲本株S-FPV-017的鸡胚成纤维细胞.根据报告基因β-半乳糖苷酶(LacZ)基因的表达,蓝白斑法筛选重组病毒,经数轮蚀斑纯化,PCR鉴定及Western-blot分析,结果表明所获得的重组病毒能高效表达AIV HA及NP两种蛋白.此研究为进一步研制更为有效的禽流感基因工程活病毒载体疫苗奠定了基础.【总页数】3页(P81-83)【作者】乔传玲;张建林;贾永清;邓国华;姜永萍;王秀荣;孟庆文;于康震【作者单位】中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150030;哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150030;哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院东北农业大学动物医学院,黑龙江哈尔滨150030;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150030;哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150030;哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150030;哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150030;哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心,黑龙江哈尔滨150001;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室,黑龙江哈尔滨150030;哈尔滨兽医研究所动物流感研究中心,黑龙江哈尔滨150001【正文语种】中文【中图分类】S852.659.5【相关文献】1.H9亚型禽流感病毒血凝素基因重组禽痘病毒的构建 [J], 陈红英;黄青云;崔保安;李新生;赵丽;管倩2.共表达禽流感病毒HA和NA基因的重组禽痘病毒在SPE鸡的免疫效力试验 [J], 乔传玲;姜永萍;于康震;田国斌;陈化兰3.共表达禽流感病毒HA和NA基因重组禽痘病毒的遗传稳定性 [J], 乔传玲;常洪涛;于康震;陈化兰4.表达H5亚型禽流感病毒血凝素和神经氨酸酶双基因重组禽痘病毒的构建 [J], 乔传玲;于康震;贾永清;刘明;孟庆文;田国彬;唐秀英5.共表达H5和H9亚型禽流行性感冒病毒血凝素基因的重组禽痘病毒及其免疫效力 [J], 陈素娟;石火英;孙蕾;刘秀梵因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
重组杆状病毒表达 H9亚型禽流感HA 基因的研究
重组杆状病毒表达 H9亚型禽流感HA 基因的研究石霖;王宏燕;魏澍;张雅为;王竹;曹东;熊永忠;李晓楠;赵晓彤;顾贵波;谷志大;邓炜娜;薛树山;吴运谱【摘要】为研究通过体外表达的方式获得具有生物学活性的禽流感 HA蛋白的方法，根据GenBank公布的禽流感H9亚型的基因序列设计引物，扩增出 H A基因全长片段，将扩增片段克隆到pFast-BacHTa载体上，构建重组杆粒rBacmid HA ，在脂质体介导下转染Sf9细胞制备重组杆状病毒，表达HA蛋白，并通过血凝抑制试验、Westernt blot、间接免疫荧光试验研究其生物学活性。
结果显示，在Sf9细胞中成功表达了 HA蛋白，分子量约为65 kD ，且表达蛋白具有良好的生物学活性。
%This study intends to express HA protein of avian influenza in vitro ,and lay the foun-dation for the serological diagnosis method which distinguish avian influenza subtypes .The pri-mers were designed according to sequences of subtype H 9 avian influenza virus in GenBank ,am-plified fragment of HA gene ,and amplified fragments were cloned into pFastBacHTa vector .The recombinant plasmid was transformed into DH10 competent cells to produce recombinant bacmid rBacmid-HA ,recombinant baculovirus was obtained through the liposome mediated transfection of Sf9 cells ,and the target protein was expressed in the Sf9 cells ,the molecular weight of about 65 kD .By hemagglutination test ,Westernt-blot ,indirect immuno fluorescence test showed that the protein was successfully expressed ,and had a good biological activity .【期刊名称】《河南农业科学》【年(卷),期】2014(000)001【总页数】4页(P120-122,126)【关键词】禽流感;H9亚型;HA基因;杆状病毒;表达【作者】石霖;王宏燕;魏澍;张雅为;王竹;曹东;熊永忠;李晓楠;赵晓彤;顾贵波;谷志大;邓炜娜;薛树山;吴运谱【作者单位】辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳110164; 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨150000;辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳110164;辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳110164;辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳110164;辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳110164;辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳110164;中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，黑龙江哈尔滨150000;辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳110164;辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳110164;辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳110164;辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳110164;第四军医大学西京医院，陕西西安710000;辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳110164;辽宁省动物疫病预防控制中心，辽宁沈阳110164【正文语种】中文【中图分类】S852.65+7禽流感(avian influenza,AI)是由A型流感病毒引起的一类禽类(家禽或者野禽)感染和/或疾病的综合征[1]。
禽流感血凝素基因的原核表达及其在H9亚型诊断中的应用
禽流感血凝素基因的原核表达及其在H9亚型诊断中的应用张瑞华;金梅林;王贵华;喻正军;赵思婷;李红超;谭亚娣;陈焕春【期刊名称】《生物工程学报》【年(卷),期】2005(21)2【摘要】根据H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因序列设计并合成引物,从本室分离并保存的H9N2亚型禽流感病毒中扩增了预计约1683bp的血凝素基因,将此扩增产物克隆进pMD18-T载体,限制性酶切及序列测定后,进一步将其亚克隆到pGEX-KG中,与GST蛋白融合表达.SDS-PAGE和Western印迹表明缺失信号肽后的HA 基因在大肠杆菌中获得了表达,表达产物具有免疫学活性,融合蛋白的分子量约为90kD,位于包涵体中.包涵体经变性、复性处理,利用复性产物作为抗原包被酶标板建立了检测H9亚型禽流感抗体ELISA方法.结果表明应用HA重组蛋白作为诊断H9亚型禽流感抗原具有特异性强、敏感性高、重复性好的特点,可用于H9亚型禽流感抗体的检测.【总页数】5页(P315-319)【作者】张瑞华;金梅林;王贵华;喻正军;赵思婷;李红超;谭亚娣;陈焕春【作者单位】华中农业大学动物医学院动物病毒室,武汉,430070;华中农业大学动物医学院动物病毒室,武汉,430070;华中农业大学动物医学院动物病毒室,武汉,430070;华中农业大学动物医学院动物病毒室,武汉,430070;华中农业大学动物医学院动物病毒室,武汉,430070;华中农业大学动物医学院动物病毒室,武汉,430070;华中农业大学动物医学院动物病毒室,武汉,430070;华中农业大学动物医学院动物病毒室,武汉,430070【正文语种】中文【中图分类】Q786【相关文献】1.H9亚型禽流感病毒血凝素基因重组禽痘病毒的构建 [J], 陈红英;黄青云;崔保安;李新生;赵丽;管倩2.H9N2亚型禽流感病毒血凝素基因的克隆及原核表达 [J], 李春红;董玉龙3.H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因的原核表达及间接ELISA方法的初步建立 [J], 郑其升;张晓勇;刘华雷;李鹏;陈溥言4.我国部分地区H9亚型禽流感病毒血凝素基因序列比较与遗传发生关系分析 [J], 刘红旗;程坚;彭大新;贾立军;张如宽;刘秀梵5.表达H9亚型禽流感病毒血凝素基因的重组鸡痘病毒及其免疫效力 [J], 程坚;刘秀梵;彭大新;刘红旗因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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ＢＬ １ ｗｈｉｈ ｗａ ｄ ｃ ｉ ｔ ＰＴＧ， ｄ ｐｒｄｕ ｔ ｓ ｃ ｌ ｔｅ Ｔｈ ｘ ｒ ｓ ｅ ｒ ｔ ｉ ｓ ｉｅ ｔ ｅｄｗｉ ２， ｃ ｓｌ ｕ ｔ ｗｉ Ｉ ｎ ｏｎ ｈ ａｎ ｏ ｃ ｌ ｗａ ｏ ｅｃ ｄ． ｅ ｅ ｐ ｅ ｓ ｄ ｐ ｏ ｅｎｗａ ｎ ｉ ｔ ｄ ｌ ｆ ｈ
达的蛋 白可被 禽流感 Ｈ９亚型阳性 血清特异性识 别。研 究结果表明 ，可 以用原核表达 系统 对禽流感病毒血凝素蛋
白进行表达 ，其产物具有免疫原性 ，可以用作禽流感抗体检测的免疫诊 断试 剂。 关键 词：禽流感 ；Ｈ９ ；原核表达 中图分类号：￥５ ． ￥ ５ ．５ ８ ５３ ８ ２ ； ６ 文献标志码 ：Ａ 文章编号：１０ — ３９ ２ １） ２ ０ ８ — ５ ０ ５ ９ ６ （０ １— ０ ６ ０ １
３ Ｓ ｈ ｏ ｆ ｉ ｃｅ ｃ ｓ Ｎｏｔ ｅ ｔ ｒ ｕｔｒ ｉｅ ｓ ｙ Ｈａ ｂｎ １ ０ ３ ， ｉａ ． ｃ ｏ Ｉ ｆ Ｓ ｉｎ ｅ ， ｒ ｓ ｉ ｌ ｅＵｎｖ ｒｉ ， ｒ ｉ ０ ０ Ｃｈｎ ） ｏ Ｌ ｅｎ ｆ ｖ ｎｉ ｕ ｎａｖｕ （ Ｉ） ａ ｘ ｒｓｅ ｙｐ Ｔｅ ｐｅ ｓ ｎｓｓ ｍｓｉ ｓｒ ｃ： ｈ Ａ ｐ ｔｉｏ ｉ ｆ ｅ ｚ ｒｓ Ｖ ｗ ｓ ｐｅｓ ｄｂ Ｅ ｘ ｒｓ ｉ ｙｔ ｏ ａａ ｎ ｌ ｉ Ａ ｅ ｏ ｅ ｎ
阅读 框 正 确 ， 获得 重 组 质 粒 ｐ Ｔ ０ — ９ Ｅ ３ ａ Ｈ 。将 此重 组 质 粒 转 化 到宿 主 菌 Ｂ ２ Ｌ １中 ，用诱 导 剂异 丙基 硫 代 一 半 乳糖 Ｄ
苷（Ｐ Ｇ） ＩＴ 进行诱 导，产物处理后进行 Ｓ Ｓ Ｐ Ｇ Ｄ — Ａ Ｅ电泳 、免疫印迹和薄层扫描 分析 。结果发现 Ｈ Ａ蛋 白可被 大量表
１ ０ ８ ， ｉａ ２ Ａｎｍ ａ Ｉｆ ｅ ｚ ａ ｏ ａ ｏ ｙ ｏ ｎｓ ｒ ｆ ｒ ｕｔ ｒ ｎ ｔ ｎ ｌ ｅ ａ ｏ ａ ｏ ｙ ０ １ Ｃｈ ｎ ； ． ｉ ｌ ｎ ｌ ｎ ａ Ｌ ｂ ｒ ｔ ｒ ｆＭｉｉｔ ｏ ｉ ｌ ｅ ａ ｄ Ｎａ ｉ ａ ｙ Ｌ ｂ ｒ ｔ ｒ ５ ｕ ｙ Ａｇ ｃ ｕ ｏ Ｋ ｏ ｔ ｒ ａ ｙ Ｂｉｔ ｃ ｎ ｌｇ ｆＨ ｒ ｉ Ｖｅ ｅ ｉａ ｓ ａ ｃ ｎ ｔ ｕ ｅ ｏ ｆ Ｖｅ ｅ ｉ ｒ ｏ ｅ ｈ ｏｏ ｙ ｏ ａ ｂ ｎ ｎ ｔ ｒ ｒ Ｒｅ ｅ ｒ ｈ Ｉ ｓ ｉ ｔ ｆ ｎ ｙ ｔ ＣＡＡＳ， ｒ ｉ ０ ０１ Ｃｈｎ ； Ｈａ ｂ ｎ １ ０ ． ｉａ ５
ｅ ｐ ｅ ｓｏｎｐａ ｍ ｉ ＥＴ３ ａｗｉ 一 ｓｔ ｇ． ａ ｅ ｏｍ ｂｎ ｎ ｅｃｏ Ｔ３ ａ Ｈ９ｗａ ｒ ｓｏ ｍ ｅ ｔ ｃ ｌ ｘ ｒ ｓ ｉ ｌｓ ｄｐ ０ ｔ ６ Ｈｉ ｈ ａ Ｔｈ ｔ ｃ ｒ ｉａ ｔ ｖ ｔｒ ｐＥ ０ － ｓｔ ａｎ ｆ ｒ ｄ ｉ ｏ Ｅ．ｏｉ ｎ
第 ４ 卷 第 １ 期 ２ ２
２１年 １ ０ １ ２月
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北
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Ｈ ９亚型禽流感病毒血凝素蛋 白在原核 系统 中的表达
Ｅ ｐ ｅ ｓｏ Ｏ ＨＡ ｘ ｒ ｓ ｉｎ ｆ ｐ ｏ ｅ ｎ ｆ ｒ ｔ ｉ ｏ Ｈ９ ｕ ｔ ｐ ａ ｉｎ ｎ ｌｅ ｚ ｖ ｒ ｓ ｎ ｓ ｂ ｙ ｅ ｖ ａ ｉｆ ｎ ａ ｉ ｉ ｕ ｕ
ｐ ｏ ａ ｙ ｔ ｙ ｔ ｍ／ ｉ ｕ， Ａ ｏ ｇ ｅ ， ＩＮ ｏｇ ｉ ＱＩ ｈ ａ ｌｇ， Ｈ Ｎ ｒ ｋ ｒ ｏ ｉ ｓ ｓｅ ｓ ｌ ｉ Ｂ Ｏ Ｈ ｎｍ ｉ Ｊ Ｇ Ｙ ｎ ｐ ｇ Ａ Ｃ ｕｎｎ 。Ｃ Ｅ ｃ ｌ Ｒ’ Ａ ｎ， Ｏ ｉ
Ｈ ａ ｎ。 Ａ Ｇ Ｘｕｏ ｇ， Ｅ ｅｄ ｏ （． ｅｌｎａ ｇＶ ｃ ｔ ｎ ｌ ｏｌ ｅｆｒ ａｉｎ ｌｅ ， ａｂ ｕ ｌ ２Ｗ Ｎ ｉｒｎ ＣＨ ＮＷ ｉ ０ １ Ｈ ｉ ｊ ｎ ｏ ａｉ ａ Ｃ ｌｇ ｔ ａｔ ｓ Ｈ ｒｉ ａ ｕ ｏ ｉ ｏ ｅ ｏＮ ｏ ｉ ｉ ｎ
Ｅ ｏ ｈ ｅ ｇ ｌ ｉｎＨ ）ｅ ｅ ｆ ／ｕｋｙ ｓｏ ｓ ／ （ ９ ２ｓ ａｎ ａ ｅ ｎ ｌ ｅ ｔ ｐｏａｙｔ ． ｌＴ ｅ ｍａ ｇ ｔ ｉ Ａｇ ｎ Ｔ ｒ ／ ｃ ｎ ｉ６ Ｈ Ｎ ）ｒｉ ｈ ｓ ｅ ｏ ｄｉｏ ｒｋ ｒ ｉ ｃＬ Ｈ ｕｎ （ ｏＡ ｅ Ｗｉ ｎ６ ｔ ｂ ｃｎ ｎ ａ ｏｃ
摘
要 ：应 用带有 Ｈｉ ｓ 的 ｐ Ｔ原核 表 达 系统 对 禽流 感病毒 血 凝 素蛋 白进 行表 达 ，将 禽 流感 ＡＴ ｒｅ／ ６尾 Ｅ ／ｕｋ ｙ
基 因克隆至原核表达载体 ｐ Ｔ ３ ａ中，经酶切 、Ｐ Ｒ扩增和测序分析确讧 其插入 ，并且 Ｅ 一０ Ｃ
Ｗｉ ｏ ｓｄ ６Ｈ Ｎ ） ｓ ｎｉ ６ （ ９ ２的 ｃ ｒ
石 锐 ，包 红梅 ，姜永萍 ，乔传 玲 ，陈化 兰 ，王秀荣 ，陈维 多。
（． １ 黑龙江民族职业学院，哈尔滨 １０ ８ ；２ 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所农业部动物流感重 点开放实验室及 ５０ １ ． 兽医生物技术国家重点实验室，哈尔滨 １０ ０ ；３ 东北农业大学生命科学学院 ，哈尔滨 １０ ３ ５０ １ ． ５ ０ ０）
达 ，主要 以包涵体形式存在 ，表达产物分子质量约 ６ ｕ ４ｋ ，与理论推 测值一致 ；菌液 ０ 值 为 １ 、ＩＴ Ｄ ． Ｐ Ｃ终浓度 ０ 为 ０ ｍ １ 、诱导时间 ４ｈ ． ｍ ｏ・ ３ ，其蛋 白表达量最大 ，约 占菌体蛋 白总量 的 ３ ％左右 ；通过免 疫印迹试验发现 ，表 ５