第十章 酶的催化机理

溶菌酶催化中的底物形变
O
O
+
H H H3 3C C
O
O H O NH O C H H C H H H
H H
O C O-O
蛋白酶的催化机制
肽键水解在热力学上是十分有利的，但若无蛋白酶的催化，1 个肽键在中性pH和25℃条件下约需300~600年的时间才能完 成水解。 根据活性中心催化基团的性质，蛋白酶可分为四类：（1）丝 氨酸蛋白酶——此类蛋白酶的催化基团包括1个不可缺少的 Ser残基，DIFP是它们的不可逆抑制剂；（2）金属蛋白酶— —这类蛋白酶在活性中心结合有金属离子，其活性绝对需要 金属离子，故金属离子螯合剂可导致活性的丧失；（3）天冬 氨酸蛋白酶——其催化基团包括2个Asp，在偏碱性的pH下无 活性；（4）巯基蛋白酶——其催化基团包括1个Cys的巯基， 碘代乙酸为它们的不可逆抑制剂。 所有蛋白酶在催化中都经历四面体的过渡态，该过渡态形成 的原因是反应涉及一个亲核基团进攻肽键的羰基碳。若是丝 氨酸蛋白酶和巯基蛋白酶，进攻的亲核基团分别是Ser残基的 羟基和Cys残基的巯基，否则就是水分子。
广义的酸催化
广义的碱催化
广义的酸、碱催化
pH 和缓冲溶液浓度对特定酸碱催化和广义酸碱催化的影响
溶菌酶Glu35的广义酸催化
核糖核酸酶A的广义酸碱催化
静电催化
活性中心电荷的分布可用来稳定酶促反应的过 渡态，酶使用自身带电基团去中和一个反应过 渡态形成时产生的相反电荷而进行的催化称为 静电催化。 有时，酶通过与底物的静电作用将底物引入到 活性中心。
过渡态稳定学说
HA-HB + HC→HA-HB-HC（过渡态）→HB-HC + HA 根据过渡态理论，在任何一 个化学反应体系中，反应物 需要到达一个特定的高能状 态以后才能发生反应。这种 不稳定的高能状态被称为过 渡态。达到过渡态要求反应 物必须含有足够的能量以克 服活化能。 1946年Pauling 提出，酶与 过渡态的亲和力要比对基态 （底物）的亲和力高得多， 酶的催化源于其对过渡态的 稳定作用。
① ② ③ ④ ⑤ ⑥
邻近定向效应
邻近定向效应是指两种或两种以上的底物（特别 是双底物）同时结合在酶活性中心上，相互靠近 （邻近） ，并采取正确的空间取向（定向） ， 这样大大提高了底物的有效浓度，使分子间反应 近似分子内反应从而加快了反应速度。 底物与活性中心的结合不仅使底物与酶催化基团 或其它底物接触，而且强行“冻结”了底物的某 些化学建的平动和转动，促使它们采取正确的方 向，有利于键的形成。
广义的酸碱催化
广义的酸碱催化是指水分子以外的分子作为质子供体 或受体参与催化，这种机制参与绝大多数酶的催化。 蛋白质分子上的某些侧链基团（如Asp、Glu和His） 可以提供质子并将质子转移到反应的过渡态中间物而 达到稳定过渡态的效果。如果一个侧链基团的pKa值 接近7，那么该侧链基团就可能是最有效的广义的酸 碱催化剂。His残基的咪唑基就是这样的基团，因此 它作为很多酶的催化残基。
丝氨酸蛋白酶
这类蛋白酶以一个特定的Ser残基作为必需的催化基团，属 于该家族成员的有胰蛋白酶、糜蛋白酶、弹性蛋白酶、枯 草杆菌蛋白酶、激肽释放酶原、凝血酶、纤溶酶等。 丝氨酸蛋白酶的催化机制属于共价催化和广义酸碱催化的 混合体，还有氧阴离子穴对过渡态的稳定，由3个不变的 Ser、His和Asp残基构成的催化三元体起主导作用，这3个 氨基酸任何一种突变或修饰均可导致酶活性的丧失。 构成催化三元体的3个氨基酸在催化中的具体功能是：
① ② ③ ④ ⑤
碳酸酐酶的金属催化机制
共价催化
共价催化是指酶在催化过程中必须与底物上的 某些基团暂时形成不稳定的共价中间物的一种 催化方式。许多氨基酸残基的侧链可作为共价 催化剂，例如Lys、His、Cys、Asp、Glu、Ser 或Thr，此外，一些辅酶或辅基也可以作为共 价催化剂，例如硫胺素焦磷酸（TPP）和磷酸 吡哆醛。
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溶菌酶Asp52的静电催化
Glu35和Asp52 分别所起的广 义酸催化和静 电催化，解释 了溶菌酶的活 性与pH之间的 关系以及它的 最适pH
pH对溶菌酶活性的影响
金属催化
近三分之一酶的活性需要金属离子的存在，这些酶分 为两类，一类为金属酶，另一类为金属激活酶。前者 含有紧密结合的金属离子，多数为过渡金属，如Fe2+ 、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+或Co3+，后者与溶液中的金 属离子松散地结合，通常是碱金属或碱土金属，例如 Na+、K+、Mg2+或Ca2+。 金属离子以5种方式参与催化： 作为Lewis酸起作用 与底物结合，促进底物在反应中正确定向 作为亲电催化剂，稳定过渡态中间物上的电荷 通过价态的可逆变化，作为电子受体或电子供体参与 氧化还原反应 酶结构的一部分
第十章 酶的催化机制
提纲
一、酶催化机理研究的主要方法 二、过渡态稳定学说 三、过渡态稳定的化学机制
1. 2. 3. 4. 5. 6. 邻近定向效应 广义的酸碱催化 静电催化 金属催化 共价催化 底物形变
四、几种常见酶的结构与功能
1. 蛋白酶 2. 溶菌酶
酶催化机理研究的主要方法
① ② ③ ④ ⑤ ⑥ 找出保守性的氨基酸残基 三维结构的研究 定点突变 动力学分析 化学修饰 计算机模拟
几种酶的共价催化
亲核共价修饰反应
乙酰乙酸脱羧酶的亲核催化
磷酸吡哆醛的亲电催化
底物形变
底物形变是指当酶与底物相遇时，酶分子诱 导底物分子内敏感键更加敏感，产生“电子 张力”发生形变，比较接近它的过渡态。 溶菌酶也利用这种方式进行催化：与溶菌酶 活性中心结合的6碳糖在溶菌酶的诱导下，从 椅式构象变成半椅式构象而发生形变，周围 的糖苷键更容易发生断裂。
可卡因
抗 体 酶 水解
筛选 免疫动物 产生抗体
催化可卡因水解的抗体酶的制备
过渡态稳定的化学机制
与酶催化相关联的过渡态稳定是酶活性中心结构和 反应性以及活性中心与结合底物之间的相互作用的 必然结果。酶充分使用一系列的化学机制来实现过 渡态的稳定并由此加速反应。它们包括： 邻近定向效应 广义的酸碱催化 静电催化 金属催化 共价催化 底物形变
化学反应的过渡态及 其前后的自由能变化
“铁丝酶”催化反应的过渡态稳定机制
支持过渡态稳定学说的证据
根据过渡态的结构设计的过渡态类似物可作 为酶的强抑制剂，抑制效果远高于竞争性抑 制剂。 利用过渡态类似物作为抗原或半抗原，去免 疫动物，由此产生的抗体可能有类似酶的催 化作用。
脯氨酸消旋酶的过渡态及其过渡态类似物抑制剂