蛋白质与核酸的定性与定量实验方法资料

蛋白质与核酸的定性与定量

一、实验目的

1、学习和掌握纯化蛋白质的原理和方法、蛋白质等电点的测量原

理和方法。

2、进一步掌握使用双缩脲法对蛋白质的定性测定、利用定糖法对

核酸的定性与定量测定

二、实验原理

1、蛋白质的定性测定：双缩脲法，课本P99

2、蛋白质的定量测定：Folin-酚法，实验P19

3、核酸的定性与定量测定：定糖法，课本P131、

4、蛋白质等电点的测量

在IEF的电泳中，具有pH梯度的介质其分布是从阳极到阴极，pH值逐渐增大。如前所述，蛋白质分子具有两性解离及等电点的特征，这样在碱性区域蛋白质分子带负电荷向阳极移动，直至某一pH位点时失去电荷而停止移动，此处介质的pH恰好等于聚焦蛋白质分子的等电点（pl）。同理，位于酸性区域的蛋白质分子带正电荷向阴极移动，直到它们的等电点上聚焦为止。可见在该方法中，等电点是蛋白质组分的特性量度，将等电点不同的蛋白质混合物加入有pH梯度的凝胶介质中，在电场内经过一定时间后，各组分将分别聚焦在各自等电点相应的pH位置上，形成分离的蛋白质区带

pH梯度的组成

pH梯度的组成方式有二种，一种是人工pH梯度，由于其不稳定，重复性差，现已不再使用。另一种是天然pH梯度。天然pH梯度的建立是在水平板或电泳管正负极间引入等电点彼此接近的一系列两性电解质的混合物，在正极端吸入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在负极端引入碱液，如氢氧化钠、氨水等。电泳开始前两性电解质的混合物pH为一均值，即各段介质中的pH相等，用pH0表示。电泳开始后，混合物中pH最低的分子，带负电荷最多，pI1为其等电点，向正极移动速度最快，当移动到正极附近的酸液界面时，pH突然下降，甚至接近或稍低于PI1，这一分子不再向前移动而停留在此区域内。由于两性电解质具有一定的缓冲能力，使其周围一定的区域内介质的pH保持在它的等电点范围。pH稍高的第二种两性电解

琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶等

5、蛋白质的纯化：凝胶层析，实验课本

DEAE-Cellulose离子交换：

氨基酸、蛋白质、核酸等大多是两性物质，在水溶液中带有电荷，由于生物分子自身的性质差异，造成了特定的介质中所带的点和种类和密度不同，这就是离子交换的理论依据。

离子交换现象可用下面的方程式表示：

Resin-SO3H+Na+H+

Resin-SO3Na+H+=Resin-SO3H+Na+\

阴离子交换反应：

Resin-N(CH3)3OH+Cl-=n(ch3)3Cl-+OH-

二乙基氨基纤维素DEAE/view/9901378102d276a200292e37.html

三、实验材料

1、试剂

(1)双缩脲试剂实验P13

(2)Folin-酚试剂，实验P19

(3)地衣酚试剂、二苯胺试剂

(4)0.02mol/LNH4Ac、0.06mol/L NH4Ac流洗、0.3mol/L NH4Ac、

1.5mol/LNaCl- 0.3mol/LNH4Ac

2、器材

（1）紫外检测仪、自动部份收集器、记录仪

（2）M anifold聚焦盘、电极平台、样品杯

四、实验方法

1、双缩脲区分蛋白质与核酸

2、蛋白质纯化

1. 平衡:0.02mol/LNH4Ac缓冲液平衡离子交换柱，紫外检测仪、记录仪基线稳定;

2. 上样:取下柱上端套塞，当柱上液面与凝胶床面相切，立即将样品小心而缓慢地加到柱床表面;

3.洗涤:样品降至床面，用0.02mol/LNH4Ac洗涤柱壁1次;

4. 收集γ-球蛋白:将0.02mol/LNH4Ac缓冲液充满层析柱，与高位恒压槽连通，开启自动部分收集器进行收集；

5. 洗涤其他球蛋白:记录仪基线恢复到零后,用0.06mol/L NH4Ac流洗，不用进行收集

6.收集白蛋白:待记录仪基线恢复到零后，用0.3mol/L NH4Ac缓冲液流洗，自动部分收集器进行收集;

7. 柱上再生:待记录仪基线恢复到零后,用 1.5mol/LNaCl- 0.3mol/LNH4Ac流洗，不用进行收集;

8. 再次平衡:待记录仪基线恢复到零后，用0.02mol/L NH4Ac流洗1-2个柱体积

3、蛋白质等电点的测定

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ml/p-36650008.html

Ettan IPGphor 3简要操作指南

注意：

•使用过程中，请确保室内温度在20！

•该设备为高压设备，任何不当操作都可能会造成受伤或死亡！

•该设备为双向电泳系统中的一个设备，请阅读双向电泳原理和方法手册了解其他信息！

1．水化：

⑴参照水化液用量表，将水化液或适量样品(若水化上样)混合；调节泡涨盘水平，液体小心加入泡涨盘。

⑵胶条室温平衡30min，从酸性端（尖端）一侧剥去IPG胶条的保护膜。胶面朝下，先将IPG胶条尖端(阳性端)放入聚焦盘中，慢慢放下胶条，并前后拖动，避免生成气泡。

⑶从两端向中间加入约3ml覆盖油防止水分蒸发。盖上泡涨盘上盖，室温水化至少10小时。

2．将Manifold聚焦盘放置在Ettan IPGphor 3的电极平台上，T形口对齐。

3．将已水化的IPG 胶条转移到任一聚焦盘胶条槽内。胶面朝上，酸端放+极，碱端放－极，并确保胶条位于胶条槽的中央(聚焦盘胶条槽内四对凸起可用于指导胶条放置在居中位置)。

4．在每根IPG 胶条表面覆盖6-8ml Immobiline DryStrip 覆盖油，胶条附近的空胶条槽内也要加覆盖油。

5．取两个IEF 电极片，用去离子水浸湿后放在滤纸上，去除多余的水。

6．分别将两个IEF 电极片放在IPG 胶条胶的两端，将电极压在两个电极片的外缘，并关闭锁扣。

7．样品杯（若杯上样）可放在两个电极间除聚焦盘内侧凸起外任何位置（切忌放在