染色体核型分析

姓名程开源系年级2010级临床医学八年制同组者孙琳、孙晶鑫、窦云德

科目分子细胞生物学题目染色体核型分析学号201000232012

【实验目的】

1.了解小白鼠睾丸细胞染色体的形态及数目。

2.初步掌握小白鼠睾丸细胞染色体的玻片标本制作方法。

3.观察动物细胞染色体的数目和形态。

【实验原理】

染色体的制备在原则上可以从所有发生有丝分裂的组织和细胞悬浮液中得到。最常用的途径是从骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞中制备染色体。小型动物的染色体制片最好最有效的材料就是骨髓组织。骨髓细胞中，有丝分裂指数相当高，因此可以直接得到中期细胞而不必象淋巴细胞或其它组织那样要经过体外培养；对大型动物通常采用对骨骼、脊或胸骨穿刺术吸取红骨髓，小型动物多采用剥离术取股骨以获得骨髓细胞。

制作染色体标本的先决条件

1. 细胞具有旺盛的分裂能力

选择活跃的组织：胸腺，骨髓，睾丸，小肠

施加药物使细胞分裂：PHA

2. 设法得到大量的中期细胞：秋水仙素

(1) PHA：粗细胞分裂，使淋巴细胞返幼，变为淋巴母细胞

(2) 秋水仙素：破坏微管装配，使纺锤体不能形成，使大量细胞停止在分裂中期。

(3) 低渗作用：水进入细胞内，细胞内容空间变大，染色体间的距离拉大，易于染色体展开

(4) 空气干燥：使细胞和染色体展开

(5) 固定：用甲醇：冰醋酸=3:1作用使蛋白质变性，对染色体内的组蛋白讲，变性后硬度增加，保持了染色体的“及时形态”，对细胞膜蛋白讲，变性使细胞膜硬度增强，形成屏障作用，防止了细胞内物质外溢和丢失。

对于小鼠精巢染色体标本的制作，一般包括以下几个要点: 1. 用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在中期, 使中期染色体停留在赤道面处; 2. 用低渗法使将细胞膨胀, 以至于在滴片时细胞被胀破, 使细胞的染色体铺展到载玻片上; 3. 空气干燥法可使使细胞的染色体在载片上展平, 经Giemsa染色后便可观察到染色体的显微图象。

【实验材料】

1.材料：小白鼠。

2.试剂：秋水仙素、0.3%KCl溶液、甲醇、冰醋酸、磷酸缓冲液（pH=6.8）吉

姆萨原液。

3.器械：手术刀、手术剪、镊子、试管架、解剖盘、注射器、针头、吸管、离

心管、离心机、玻片(冰片)、天平、试镜纸、二甲苯、吸水纸、香柏油、烧杯、水浴锅。

【实验步骤】

4.取雄性小鼠以每克体重4ug注射秋水仙素，经14-16小时后，断头法杀死小

鼠，取出睾丸，用生理盐水（0.9%的NaCl）吸去血污。

5.放入装有1ml 0.3% KCl 液的小烧杯中剪碎（呈乳白色）。

姓名程开源系年级2010级临床医学八年制同组者孙琳、孙晶鑫、窦云德

科目分子细胞生物学题目染色体核型分析学号201000232012

6.用铜网过滤到刻度离心管中，再加0.3% KCl 液至4ml。

7.37℃静置30分钟，进行低渗处理。

8.以800-1000转/分离心8分钟。

9.弃上清液，加入2ml甲醇、冰醋酸固定液（3:1），并用吸管吹气，轻轻打散

细胞，固定8min。

10.再以800-1000转/分，离心8min。

11.弃上清液，加1ml固定液，制成细胞悬液，固定5min。

12.取洁净的低温预冷载玻片，距10-15cm高度滴下2-3滴细胞悬液，从一边轻

轻吹气，并随时轻轻敲打，以使细胞均匀分布和促使染色体展开。

13.用滤纸擦去载玻片上多余液体，空气干燥或文火干燥，染色。

14.用Giesma染色20-30分钟，细水吸取多余染液，气干。

15.镜检：低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，高倍镜或油镜下观察染

色体形态并计数。

附：倒置染色法——在玻璃板上用废旧载玻片作支架，使标本载玻片的标本面向下放置到支架上，在玻璃板和标本载玻片之间滴加Giemsa染液，目的一可以节省染料，二可以避免染液快速挥发，三可以防止染色颗粒沉淀，影响观察，在操作时应注意，多个样品同时染色应摆放紧密，不要有间隙；滴染液时应尽量满，不要有气泡，以免部分染色体不能着色。

【实验结果】

图一染色体中期（10*40）图二染色体中期未摔开（10*40）

图三染色体间期（10*40）

姓名程开源系年级2010级临床医学八年制同组者孙琳、孙晶鑫、窦云德

科目分子细胞生物学题目染色体核型分析学号201000232012

【实验结果分析】

图一：此图接近染色体分裂期的中期，染色体较粗，已发生固着，但是程度还不够。在40*10的镜下看到的染色体应为颗粒状，隐约能看到颗粒中的分叉。

图二：此图明显为染色体的中期，可以清楚地看到从两级发出的纺锤丝牵拉染色体到细胞的赤道板。但是细胞膜没有摔破，无法确认染色体的个数。

图三：此图为染色体的分裂间期或分裂期前期，染色体还较细，呈丝状。

【反思与总结】

本次实验我们一共做了三只小鼠，但最终的结果还是不够理想。第一只小鼠的注射时间为21个小时左右，实验操作时在第一次进行低渗时，我们实际加入的是等渗溶液，发现后立即加入水降低溶液的渗透压，而且又补了一些低渗液，等离心，沉降等过程完成后，我们低渗已经超过了规定时间。经过观察，发现中期的细胞较少，而且很多细胞堆叠在一起，没有摔开。

第二只小鼠全过程都是按照实验步骤规范地操作，由于第一次的许多细胞没有摔开，我们就将滴片的高度增加到 1.8m。经过观察，我们和第一次的结果做比较发现：虽然本次细胞摔得较散，但是摔开的细胞形态并没有第一的效果好，初次之外，中期的细胞较少，绝大部分的细胞处于分裂间期。

经过比较两次的实验结果与实验步骤，我们归纳出了一下几个需要注意的地方：

1.两次制得的片中中期的细胞都比较少，说明秋水仙素的作用效果不明显，我

们怀疑：秋水仙素在小鼠体内一定时间后，可能会被机体代谢，停滞在中期的细胞可能会在细胞信号分子的诱导下发生凋亡或着将细胞中的秋水仙素代谢出去，恢复正常状态，所以我们认为注射秋水仙素的时间不是越长越好。

我们通过查文献，看到注射实验为4-6个小时，决定将第三只老鼠的注射时间控制在这个范围内。

2.第一次的细胞虽然摔得没有第二次的细胞好，但是第一次细胞的形态要比第

二次好许多。我们认为这与低渗这一步有很大的关系。第一次我们做的低渗时间较长，使细胞已经膨胀到了一定程度，效果较好。第二次的时间较短，低渗不充分，因此应该适当地延长低渗时间。不过，据其他的实验组所说，低渗时间过长可能导致细胞在滴片之前裂解，在观察的时候视野中都是杂乱、散落的染色体。除此之外，低渗的温度也很重要，之前低渗的时候，所取的低渗液，用滴管吹细胞时均没有进行恒温，在第三次实验时我们要做到全方位的恒温，在低渗和用固定之前，先把低渗液和固定液放入恒温水中。

3.用铜网过滤的时候我们发现，若只是将铜网平铺在试管上，则倾倒液体时，

液体很容易沿着试管壁流出。改进的办法是：将铜网覆盖在试管上时，用拇指压一下铜网，使其形成一个凹槽，将液体倒人凹槽中，让其慢慢地过滤，液面不要超过试管的高度，防止外溢。

4.用剪刀剪小鼠的睾丸，吸管吹气打散细胞的时候要尽可能地仔细，使组织或

细胞尽可能分散，体积尽可能小。这样过滤得到的液体就比较充裕，离心后，最终制得的细胞悬液也比较多，细胞的密度也较大。

5.第二次摔细胞的高度明显比第一次的高度高，所得的细胞较分散，这点应该