核酸的提取、纯化和电泳检测实验报告

核酸的提取、纯化和电泳检测实验报告

分子生物学实验山东大学生命科学学院

核酸的提取、纯化和电泳检测

摘要质粒是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。提取和纯化质粒DNA 的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法等等，其中碱变性法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的，本实验采用碱变性法提取E.coli DH5α中Puc19质粒DNA，并通过RNase消化及酚-氯仿抽提除去质粒DNA溶液中的RNA以及RNase等一些可溶性蛋白，最后获得纯度较高的质粒DNA。细菌基因组DNA呈环状裸露于拟核区，本实验中细菌染色体DNA的提取采用试剂盒的方式。本实验的目的在于掌握碱变性法提取质粒DNA及染色体DNA提取的原理、各种试剂的作用和方法，掌握DNA的纯化方法，即用RNase 消化RNA以及用酚、氯仿抽提法除去质粒中的蛋白质，学习并掌握凝胶电泳进行DNA的分离纯化及纯度检测的实验原理，凝胶的制备及电泳方法及相应的方法操作。关键词质粒DNA 碱变性提取法琼脂糖凝胶电泳细菌染色体DNA

引言

1. 核酸分离纯化

1.1总原则

保证核酸一级结构的完整性

化学损伤——缩短化学试剂作用时间，以减少其对核酸的损失；

物理损伤——动作轻柔以减少机械剪切力；尽量低温操作以减少高温损伤；

生物降解——加入相应酶抑制剂，防止生物降解排除其他分子的污染

蛋白质——苯酚/氯仿/蛋白酶K RNA污染——RNase

其他DNA——区别变性与复性

有机溶剂——萃取、乙醇沉淀与洗涤金属离子——乙醇沉淀与洗涤 1.2核酸纯化应达到的要求

核酸样品不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子其他生物大分子的污染应降到最低程度排除其他核酸分子的污染 1.3核酸提取的一般过程

破碎细胞（防止核酸酶的作用）

破碎抽提核酸(裂解细胞释放内容物)——关键步骤

核酸的纯化除去杂质（蛋白质、脂类、核酸）4°C最佳和最简单；-70°C是长期保存的良好温度，为一次性保存；-20°C 核酸样品的保存（主要条件时温度和介质）-TE缓冲液最常用

分子生物学实验山东大学生命科学学院

2. 质粒DNA的提取及纯化——碱变性提取法（碱裂解/变性法）

RNase消化及酚-氯仿抽提

2.1 质粒DNA的制备方法

质粒(Plasmid)是独立存在于染色体外、能自主复制并能稳定遗传的一种环状双链DNA分子，分布于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，但在细菌细胞中含量最多。细菌质粒大小介于1～200Kb之间，是应用最多的质粒类群，在细菌细胞内它们利用宿主细胞的复制机构合成质粒自身的DNA。

提取和纯化质粒DNA的方法很多，目前常用的有：碱变性提取法、煮沸法、羟基磷灰石柱层析法、EB-氯化铯密度梯度离心法和Wizard法等。其中，碱变性提取法最为经典和常用，适于不同量质粒DNA的提取。该方法操作简单，易于操作，一般实验室均可进行。提取质粒DNA纯度高，可直接用于酶切、序列测定及分析。EB-氯化铯密度梯度离心法，主要适合于相对分子质量与染色体DNA相近的质粒，具有纯度高、步骤少、方法稳定，且得到的质粒DNA多为超螺旋构型等优点，但提取成本高，需要超速离心设备。少量提取质粒DNA还可用沸水浴法、Wizard法等，沸水浴法提取的质粒DNA中常含有RNA，但不影响限制性核酸内切酶的消化、亚克隆及连接反应等。在实际操作中可以根据宿主菌株类

型、质粒分子大小、碱基组成和结构等特点以及质粒DNA的用途进行选择。本实验选择碱裂解法提取质粒DNA。

提取原则：①尽量保持核酸的完整性，即保持天然状态，防止核酸酶对核酸的降解（生物损伤），也要防止化学因素（酸、碱等）或物理因素（高温、机械剪切等）引起核酸变性或破坏。

②最大限度减少染色体DNA的污染，去除RNA、可溶性蛋白质杂质。 2.2 碱裂解法

碱裂解/碱变性法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，是基于染色体DNA（线性DNA）与质粒DNA（超螺旋DNA）的变性与复性的条件差异而达到分离目的。质粒DNA 具特定的形态结构，在特殊的环境条件下，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等会导致质粒DNA变性，去除变性条件又可以使DNA 复性。碱裂解法根据共价闭合环状质粒DNA和线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离质粒DNA。在细菌细胞中，染色体DNA以双螺旋结构存在，质粒DNA以共价闭合环状形式存在。SDS是一种阴离子表面活性剂，它既能裂解细菌细胞，又能使细菌蛋白质变性。SDS处理细菌细胞后会导致细菌细胞壁破裂，从而使质粒DNA 及细菌基因组DNA从细胞中同时释放出来，但两者变性与复性所依赖的溶液pH值不同。在pH12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。当以pH4.8的KAc(或NaAc)高盐缓冲液调节其pH值至中性

时，因为共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，变性的质粒DNA恢复原来的共价闭合环状超螺旋构型，而溶解于溶液中；而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，染色体DNA不能复性而与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起形成缠连的、可见的网状结构呈白色絮状沉淀，这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA分离。溶于上清的质粒DNA，可用无水乙醇和盐溶液，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA与RNA性质类似，乙醇沉淀DNA的同时，也伴随着RNA沉淀，可利用RNase A将RNA降解。质粒DNA 溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚/氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA，之后可再用超离心、电泳、离子交换柱层析等方法进一步纯化质粒。

分子生物学实验山东大学生命科学学院

总结：

坚韧细胞壁、细胞膜

染色体DNA

RNA、可溶性蛋白质

溶菌酶、SDS

变性复性条件不同

蛋白酶、RNase、有机溶剂