聚合酶链式反应PCR实验报告

实验二聚合酶链式反应(PCＲ)

一、实验原理

聚合酶链式反应（ＰCR）是利用DNA片段旁侧两个短的单链引物,在体外快速扩增特异ＤNＡ片段的技术。它应用热稳定的聚合酶,通过双链DNA模板的热变性、引物退火和引物延伸的重复循环，DNＡ片段以指数方式增加了百万倍。从非常微量的DNA甚至单个细胞所含有的DＮA起始,可产生ug量的PCＲ产物。

二、器材与试剂

1.器材:移液器,ＥP管，热盖PＣR仪，电泳仪,量筒，锥形瓶,微波炉，电子天平,紫外照色仪

2.试剂:引物,模板，Taq ＤNA聚合酶,原料(dNTPs），缓冲液与Mｇ2+,H2Ｏ, 2*P ＣRmｉx溶液，DNA染料

三、实验步骤

PＣR反应体系的建立

取离心管,依次加入试剂混匀

1．H2O 1２μｌ

2.模板１μl

3.引物T7 1μl

4．引物sp６ 1μl

5．2＊ＰCＲｍix １5μl

PCR仪的热循环反应

把离心管放入PCR仪中，由变性－－退火--延伸三个基本反应步骤构成

1.模板DNA的变性:模板DＮA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DＮA双

链或经ＰＣR扩增形成的双链DNＡ解离,使之成为单链,以便它与引物结合,为下轮反应作准备；

2.模板DNA与引物的退火（复性)：模板DNＡ经加热变性成单链后，温度降至

56℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

3.引物的延伸：经加热至72℃左右DＮA模板-－引物结合物在TaqＤNA聚合酶

的作用下，以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板ＤNA链互补的半保留复制链。重复该循环３0次,每次需要2-３分钟。

电泳检测结果

扩增产物在琼脂糖凝胶电泳中,电泳结束后，放到紫外照射仪中进行透射,电泳明胶显示清晰的条带，如下图所示加入的为1号样,出现在５0０ｂp左右条带，而预算结果为扩增出４9２bp条带，故实验成功。

四、讨论

1.Ｍg2＋离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异

性浓度过低则影响ＰCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。

2.变性温度低，变性时间短，极有可能出现假阴性;退火温度过低,可致非特异

性扩增而降低特异性扩增效率退火温度过高影响引物与模板的结合而降低P ＣR扩增效率。

3.EB:溴化乙锭是一种高度灵敏的荧光染色剂，用于观察琼脂糖中的DNA,可与D

ＮＡ结合，用标准3０2nm 紫外光透射仪激发并放射出橙红色信号。

4.溴酚蓝：电泳指示剂,相当于3００bp的DNＡ的电泳速度。

5.100bp DNA MarｋeｒⅠ是由单独的ＰＣR扩增产物混合而成,已含有1xLoad

ｉｎg Bｕｆfer，可以直接电泳。包括11条双链DＮA片断：100bp、2０0bp、３00bp、4０0bp、5０0bｐ、60０ｂｐ、7０0bp、800bp、9０0bｐ、1００0b ｐ和1５00bp。特异性加强500bｐ。每次上样4～5μL。

6.模板一般采用5０ng-1ug或102－－1０5 拷贝，浓度过高反而会抑制反应的

进行。

7.引物的与模板的互补程度决定了PＣＲ的特异性，常用０.1—０．５uＭ，浓

度过高则特异性下降,会形成引物二聚体影响试验结果。

五、结果及结论：

经电泳检测到PＣR扩增产物中出现５0０bp左右条带,PＣR扩增成功。