基因组学试题

基因组学与生物信息学闭卷考试I：笔试题1、请介绍用于遗传图谱构建的至少三种DNA分子标记，包括其名称（中英文）、基本原理及优缺点。

（15分）4 SSR（SSLP）简单序列重复标记（Simple sequence repeat, 简称SSR标记）或简单序列长度多态性（Simple sequence length polymorphism, 简称SSLP标记）由Moore等于1991年创立。

SSR即微卫星DNA，是一类由几个（多为1-5个）碱基组成的基序（motif）串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置，如（CA）n、（AT）n、（GGC）n等重复。

不同遗传材料重复次数的可变性，导致了SSR长度的高度变异性，这一变异性正是SSR标记产生的基础。

尽管微卫星DNA分布于整个基因组的不同位置，但其两端序列多是保守的单拷贝序列，因此可以根据这两端的序列设计一对特异引物，通过PCR技术将其间的核心微卫星DNA序列扩增出来，利用电泳分析技术就可获得其长度多态性，即SSR标记。

SSR标记的主要特点有：（1）数量丰富，广泛分布于整个基因组；（2）具有较多的等位性变异；（3）共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；（4）实验重复性好，结果可靠；（5）由于创建新的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定困难，费用也较高。

5STS序标位（Sequence tagged sites, 简称STS标记）由Olson于1989年开发成功。

STS是指基因组中长度为200-500bp，且核苷酸顺序已知的单拷贝序列，通过PCR可将其专一扩增出来。

其基本原理是，依据单拷贝的RFLP探针、微卫星序列、Alu因子等两端序列，设计合适的引物，进行PCR扩增，电泳显示扩增产物多态性。

有时扩增产物还需要特定的限制性内切酶酶解后才能表现出多态性。

目前用于STS引物设计的主要是RFLP探针。

STS标记的主要特点有：（1）标记来源广，数量多；（2）共显性遗传，可区分纯合子和杂合子；（3）技术简便，检测方便；（4）与SSR标记一样，开发依赖于序列分析及引物合成，成本较高；（5）多态性常常低于相应的RFLP标记，这是因为STS仅仅检测该引物所分布区域的片段差异或酶切位置差异，而RFLP标记的多态性往往可能是探针以外区域的差异，这一部分差异无法转化成STS标记的多态性。

1 RFLP限制性片段长度多态性标记（Restriction fragment length polymorphism, 简称RFLP标记）该技术由Grodzicker等于1974年创立。

特定生物类型的基因组DNA经某一种限制性内切酶完全酶解后，会产生分子量不同的同源等位片段，或称限制性等位片段。

RFLP标记技术的基本原理就是通过电泳的方法分离和检测这些片段。

凡是可以引起酶解位点变异的突变，如点突变（新产生和去除酶切位点）和一段DNA的重新组织（如插入和缺失造成酶切位点间的长度发生变化）等均可导致限制性等位片段的变化，从而产生RFLP。

该技术包括以下基本步骤：DNA提取；用DNA限制性内切酶消化；凝胶电泳分离限制性片段；将这些片段按原来的顺序和位置转移到易操作的滤膜上；用放射性同位素或非放射性物质标记的DNA作探针与膜上的DNA杂交（称 Southern杂交）；放射性自显影或酶学检测显示出不同材料对该探针的限制性酶切片段多态性。

RFLP标记的主要特点有：（1）遍布于整个基因组，数量几乎是无限的；（2）无表型效应，不受发育阶段及器官特异性限制；（3）共显性，可区分纯合子和杂合子；（4）结果稳定、可靠；（5）DNA需要量大，检测技术繁杂，难以用于大规模的育种实践中。

2、什么是基因组诠释（Genome Annotation）？可以从哪几个水平进行？试举例分析其对基因组学研究的意义。

（15分）In the context of genomics, annotation is the process of marking the genes and other biological fea tures in a DNA sequence.在基因组图谱中，基因组诠释是一个在DNA序列中标记基因和生物学功能的过程。

基因组序列诠释可以从以下两个水平进行：基因水平、蛋白水平、转录水平。

步骤：1。

寻找基因；2。

获取基因全长cDNA序列；3。

确定DNA顺序中基因的位置；4。

实验确认基因的功能；5。

基因表达；6。

蛋白质组学意义：基因组是由编码序列和非编码序列组成，基因诠释能有效寻找基因在基因组中的位置，并对其功能进行研究，能有效揭示基因组序列所包含的全部遗传信息、基因组作为一个整体是如何行使其功能的。

3. 1988年建立的美国国家生物技术信息中心（NCBI）是生命科学研究者经常要访问的重要网站，因为它可以提供许多免费的资源服务和在线分析工具（或软件），那么请列举至少5种并说明其功能（或用途）。

（15分）4．简述研究蛋白质与蛋白质相互作用的方法。

（15分）双杂交酵母双杂交系统由Fields和Song等首先在研究真核基因转录调控中建立。

典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4、等都含有二个不同的结构域: DNA结合结构域(DNA-binding domain)和转录激活结构域(transcription-activating domain)。

前者可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，转录激活结构域可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。

二个结构域不但可在其连接区适当部位打开，仍具有各自的功能。

而且不同两结构域可重建发挥转录激活作用。

酵母双杂交系统利用杂交基因通过激活报道基因的表达探测蛋白－蛋白的相互作用。

主要有二类载体: a 含DNA -binding domain的载体; b 含DNA-activating domain的载体。

上述二类载体在构建融合基因时，测试蛋白基因与结构域基因必须在阅读框内融合。

融合基因在报告株中表达，其表达产物只有定位于核诓拍芮 ǜ婊 虻淖 肌＠ 鏕AL4-bd具有核定位序列(nuclear-localization sequence)，而GAL4-ad没有。

因此，在GAL4-ad氨基端或羧基端应克隆来自SV40的T-抗原的一段序列作为核定位的序列。

双杂交系统的另一个重要的元件是报道株。

报道株指经改造的、含报道基因(reporter gene)的重组质粒的宿主细胞。

最常用的是酵母细胞，酵母细胞作为报道株的酵母双杂交系统具有许多优点: 〈1〉易于转化、便于回收扩增质粒。

〈2〉具有可直接进行选择的标记基因和特征性报道基因。

〈3〉酵母的内源性蛋白不易同来源于哺乳动物的蛋白结合。

一般编码一个蛋白的基因融合到明确的转录调控因子的DNA－结合结构域(如GAL4-bd， LexA-bd)；另一个基因融合到转录激活结构域(如GAL4-ad， VP16)。

激活结构域融合基因转入表达结合结构域融合基因的酵母细胞系中，蛋白间的作用使得转录因子重建导致相邻的报道基因表达(如lacZ)，从而可分析蛋白间的结合作用。

酵母双杂交系统能在体内测定蛋白质的结合作用，具有高度敏感性。

主要是由于：①采用高拷贝和强启动子的表达载体使杂合蛋白过量表达。

②信号测定是在自然平衡浓度条件下进行，而如免疫共沉淀等物理方法为达到此条件需进行多次洗涤，降低了信号强度。

③杂交蛋白间稳定度可被激活结构域和结合结构域结合形成转录起始复合物而增强，后者又与启动子DNA结合，此三元复合体使其中各组分的结合趋于稳定。

④通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。

同时，酵母表型， X-Gal及HIS3蛋白表达等检测方法均很敏感亲和层析亲和层析（affinity chromatography）利用共价连接有特异配体的层析介质分离蛋白质混合物中能特异结合配体的目的蛋白或其它分子的层析技术。

（一）原理亲和层析是一种吸附层析，抗原（或抗体）和相应的抗体（或抗原）发生特异性结合，而这种结合在一定的条件下又是可逆的。

所以将抗原（或抗体）固相化后，就可以使存在液相中的相应抗体（或抗原）选择性地结合在固相载体上，借以与液相中的其他蛋白质分开，达到分离提纯的目的。

此法具有高效、快速、简便等优点。

（二）载体的基本要求和选择理想的载体应具有下列基本条件：①不溶于水，但高度亲水；②惰性物质，非特异性吸附少；③具有相当量的化学基团可供活化；④理化性质稳定；⑤机械性能好，具有一定的颗粒形式以保持一定的流速；⑥通透性好，最好为多孔的网状结构，使大分子能自由通过；⑦能抵抗微生物和醇的作用。

可以做为固相载体的有皂土、玻璃微球、石英微球、羟磷酸钙、氧化铝、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素和琼脂糖。

在这些载体中，皂土、玻璃微球等吸附能力弱，且不能防止非特异性吸附。

纤维素的非特异性吸附强。

聚丙烯酰胺凝胶是目前的首选优良载体。

琼脂糖凝胶的优点是亲水性强，理化性质稳定，不受细菌和酶的作用，具有疏松的网状结构，在缓冲液离子浓度大于0.05Mol/L时，对蛋白质几乎没有非特异性吸附。

琼脂糖凝胶极易被溴化氢活化，活化后性质稳定，能经受层析的各种条件，如0.1Mol/L NaOH或1Mol/L HCl 处理2h~3h及蛋白质变性剂7Mol/L尿素或6Mol/L盐酸胍处理，不引起性质改变，故易于再生和反复使用。

琼脂糖凝胶微球的商品名为Sepharose，含糖浓度为2%、4%、6%时分别称为2B、4B、6B。

因为Sepharose 4B的结构比6B疏松，而吸附容量比2B大，所以4B应用最广。

免疫共沉淀免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。

是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。

其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。

如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。

这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。

其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。

缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。