溶菌酶的提取工艺路线
鸡蛋清溶菌酶提取实验具体步骤
鸡蛋清溶菌酶提取实验具体步骤从鸡蛋中提取溶菌酶的步骤1.鸡蛋清样品制备及粗分离将4～5 个（为⼀个⼩组，同时两个⼩组共同进⾏试验）新鲜鸡蛋打⼊烧杯然后⽤矿泉⽔瓶⼦吸出蛋黄，分离得鸡蛋清（鸡蛋清pH 值不得⼩于8.0），量其体积（量筒50ml），加⼊两倍蛋清体积的（可⽤双蒸⽔替代）去离⼦⽔，边加边缓慢搅拌，拌匀后⽤两层纱布过滤除去脐带块和碎蛋壳等，然后⽤1 mol ／L 的HCl 溶液调pH 值⾄7.0 左右，再⽤脱脂棉过滤收集滤液。
2. 724 弱酸性阳离⼦交换树脂的再⽣及层析1.吸附：将处理好的蛋清约200 mL，加⼊32 g再⽣的724 树脂中，缓慢搅拌吸附6 h。
2.洗涤、洗脱：待分层后，将蛋清液倒去，⽤去离⼦⽔反复冲洗，以去除杂蛋⽩，滤⼲树脂，⽤等体积的0.15mol ／L pH 值为6．5 的磷酸缓冲液洗涤，加⼊等量的10％（NH4）2SO4溶液搅拌洗脱30 min，使溶菌酶从树脂上洗脱下来，收集洗脱液，4℃冰箱静置过夜。
第⼆天，有⽩⾊沉淀析出，离⼼（15 min，10 000r ／min）收集沉淀，沉淀物为溶菌酶粗产品浓缩1·透析除盐、去碱性蛋⽩：4℃条件下，⽤去离⼦⽔透析24 h 左右（1天）直到透析完全（⽤BaCl2与透析液发⽣反应直到没有浑浊产⽣为⽌）。
离⼼去除透析袋中沉淀，向透析清液中慢慢加⼊1 mol ／L 氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，使pH 值上升⾄8．0～9．0，如有⽩⾊沉淀，即离⼼去除；（碱性蛋⽩在此pH条件下会到等电点然后就会沉淀）2·聚⼄⼆醇浓缩：盐析物⽤1 倍去离⼦⽔溶解成稀糊状，装⼊透析袋，在装有聚⼄⼆醇的试管中吸⽔浓缩，收集浓缩液；3·冷冻⼲燥：⽤3 mol ／L 盐酸调pH值⾄5．0，冷冻⼲燥，即得⽩⾊⽚状溶菌酶。
溶菌酶纯度检测SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳法①凝胶板的制备：⽤30％分离胶贮液、pH 值为8.9 分离胶缓冲液、10％浓缩胶贮液、pH 值为6.7浓缩胶缓冲液、10％SDS、1％TEMED、重蒸馏⽔、10％APS 溶液配制⽽成；②溶菌酶的处理：⽤磷酸缓冲液制成50 µg ／mL 的溶液，取10~80 µL 点样于凝胶板上③电泳：电流为10 mA，时间4 h；④固定、染⾊和脱⾊：电泳完毕，将胶板从玻璃板上取下，分别在固定液与染⾊液中浸泡10～30 min，⽤⽔漂洗⼲净，再⽤脱⾊液脱⾊。
实验3 溶菌酶分离提纯
【实验原理】 实验原理】
溶菌酶(lysozyme) 溶菌酶 又称胞壁质酶， 又称胞壁质酶，或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶 乙酰胞壁质聚糖水解酶 相对分子量为14600Da，由129个氨基酸残基组成 ， 相对分子量为 个氨基酸残基组成 等电点在11.0附近 附近 等电点在 最适pH 6-7，最适温度为 ℃ 最适 ，最适温度为50℃ 切断细菌细胞壁多糖中NAM和NAG之间的 1,4糖 和 之间的β- 糖 切断细菌细胞壁多糖中 之间的 苷键
【思考题】 思考题】
1. 离子交换层析法分离纯化蛋白质具有哪些优缺点？ 离子交换层析法分离纯化蛋白质具有哪些优缺点？ 2. 概述蛋白质分离提纯的基本原理和一般流程。 概述蛋白质分离提纯的基本原理和一般流程。
CM Sepharose FF（快速羧甲基琼脂糖凝胶） （快速羧甲基琼脂糖凝胶）
弱酸性阳离子交换剂 物理化学性质稳定、交换容量大、流速快、 物理化学性质稳定、交换容量大、流速快、洗脱条件温和
琼脂糖凝胶— 琼脂糖凝胶 O—CH2COO+
琼脂糖凝胶— 琼脂糖凝胶 O—CH2COONaCl
+
+
琼脂糖凝胶— 琼脂糖凝胶 O—CH2COO- Na+
实验原理溶菌酶lysozyme又称胞壁质酶或n乙酰胞壁质聚糖水解酶最适ph67最适温度为50切断细菌细胞壁多糖中nam和nag之间的14糖等电点在110附近实验原理实验原理溶菌酶的粗提溶菌酶耐热性较高而其它杂蛋白在高温下变性沉淀鸡蛋清液酸性条件85溶菌酶带正电荷与酸根负离子生成可溶性盐使溶菌酶与其他蛋白质分开得到溶菌酶的粗提液离心离子交换层析iec是基于待分离物质的酸碱性极性等差异它们与离子交换剂的亲和力不同通过离子之间的吸附和脱吸附而将各组分依次从层析柱中洗脱下来从而达到分离目的
溶菌酶的制备实验报告
一、实验目的1. 学习溶菌酶的提取、分离和纯化方法。
2. 掌握酶活性测定和蛋白质浓度测定技术。
3. 了解溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定方法。
二、实验原理溶菌酶（Lysozyme）是一种胞壁质酶，具有破坏细菌细胞壁的能力。
本实验采用鸡蛋清为原料，通过提取、分离和纯化等步骤，制备高纯度的溶菌酶。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 鸡蛋清- 酶活性测定试剂盒- 蛋白质浓度测定试剂盒- 溶菌酶纯度鉴定试剂盒- 分子量测定试剂盒2. 实验仪器：- 低温高速离心机- 酶标仪- 荧光分光光度计- 凝胶电泳仪- 凝胶成像系统四、实验方法1. 溶菌酶粗提取（1）取一定量的鸡蛋清，加入适量的生理盐水，搅拌均匀。
（2）将混合液用低温高速离心机以4,000 rpm离心10分钟，取上清液。
（3）用酶活性测定试剂盒检测上清液中的溶菌酶活性。
2. 溶菌酶分离纯化（1）取上清液，加入适量的硫酸铵，使蛋白质沉淀。
（2）将混合液用低温高速离心机以4,000 rpm离心10分钟，取沉淀。
（3）将沉淀用生理盐水溶解，加入适量的G-25凝胶柱，进行凝胶过滤。
（4）收集洗脱液，用酶活性测定试剂盒检测洗脱液中的溶菌酶活性。
3. 溶菌酶纯度鉴定（1）取适量的溶菌酶溶液，加入溶菌酶纯度鉴定试剂盒，进行电泳分析。
（2）观察电泳图谱，鉴定溶菌酶的纯度。
4. 溶菌酶分子量测定（1）取适量的溶菌酶溶液，加入分子量测定试剂盒，进行SDS-PAGE电泳分析。
（2）观察电泳图谱，计算溶菌酶的分子量。
5. 溶菌酶活性测定（1）取适量的溶菌酶溶液，加入酶活性测定试剂盒，进行酶活性测定。
（2）记录酶活性值。
6. 溶菌酶蛋白浓度测定（1）取适量的溶菌酶溶液，加入蛋白质浓度测定试剂盒，进行蛋白浓度测定。
（2）记录蛋白浓度值。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶粗提取上清液中溶菌酶活性为XX单位/mL。
2. 溶菌酶分离纯化洗脱液中溶菌酶活性为XX单位/mL。
3. 溶菌酶纯度鉴定电泳图谱显示，溶菌酶的纯度为XX%。
溶菌酶生产工艺
溶菌酶生产工艺溶菌酶是一种酶类制剂，具有较强的抗菌和溶菌作用，可以作为医药和食品工业中的重要原料。
溶菌酶的生产工艺需要经过发酵、提取和纯化等步骤。
首先，溶菌酶的生产需要选择适合的菌株进行发酵。
常用的菌株有溶血链球菌、溶菌链球菌等。
选取菌种后，进行菌株的培养和保藏，以备后续发酵使用。
其次，进行溶菌酶的发酵过程。
发酵工艺主要包括菌种的培养、菌种的接种和培养液的发酵。
首先，将菌种接种至培养基中，进行预培养。
然后，将预培养的菌液加入到大规模培养罐中，进行发酵。
发酵的过程需要控制温度、pH值、溶氧量和搅拌速度等参数，以提高溶菌酶的产量和活性。
发酵结束后，通过离心将发酵液分离成菌体和发酵液两个部分。
菌体可以用于下一轮的发酵，发酵液则需要进行溶菌酶的提取和纯化。
溶菌酶的提取主要包括细菌细胞的破碎和酶液的沉淀等步骤。
首先，将发酵液经过超声波处理或高压破碎器破碎细菌细胞，释放出溶菌酶。
然后，通过离心将破碎后的细胞碎片从酶液中分离出来。
最后，将酶液经过适当的浓缩和纯化步骤，得到高纯度的溶菌酶。
溶菌酶的纯化过程主要包括纯化液的浓缩、溶菌酶的层析和纯化液的再浓缩等步骤。
首先，通过浓缩设备将溶菌酶的含液量减少，使溶菌酶的浓度增加。
然后，将浓缩后的酶液经过柱层析将杂质和溶菌酶分离。
最后，通过再浓缩过程将溶菌酶的纯度进一步提高。
总的来说，溶菌酶的生产工艺主要包括发酵、提取和纯化等步骤。
在这些步骤中，需要控制适当的发酵参数，如温度、pH 值、溶氧量和搅拌速度等，以提高溶菌酶的产量和活性。
此外，还需要使用适当的设备和方法来分离和纯化溶菌酶，以获得高纯度的溶菌酶制剂。
如何从蛋清中提取溶菌酶
盐析法实验步骤
• 将预处理的蛋清倾人烧杯中，边搅拌边加入蛋白质5％的 食盐粉末，促使氯化钠细粉及时溶解，以避免局部浓度过 高或沉淀于容器底部，否则会引起蛋白质的变性而产生大 量的白色沉淀．溶解后再用0．1mol／L的NaOH溶液调节 pH9．5-pH10.0。置于4℃环境中，数天后即有溶菌酶结 晶出现，将酶晶体过滤，收集结晶沉淀粉，用丙酮脱水， 真空干燥即为粗产品。将制得的粗品用pH4．6的醋酸溶 解，然后让酶液静置24小时，接着过滤除去不溶物，收集 滤液并量出体积，按每100毫升液体加5毫克NaCl的比例 加入，然后用0．1mol／L的NaOH溶液缓慢地将其pH值 调节到10．8后，低温下静置结晶。为加速结晶过程可向 酶液中加入溶菌酶晶种，待结晶完全后再倾去上清液，用 布氏漏过滤可得溶菌酶结晶。如纯度不高，可重复操作提 纯，直至达到所需的纯度为止，结晶于30—40℃得溶菌酶 产品。
离子交换法
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
从蛋清中提取溶菌酶的方法
溶菌酶作用机制
• 溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶。 • 它作用于N一乙酰氨基葡萄糖胺和N一乙酰胞壁酸 之间的B一1，4糖苷键，能使某些细菌细胞中粘 多糖成分分解。因而具有溶菌能力。 • 溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，处理革 兰氏阳性细菌可得到原生质体。溶菌酶是一种无 毒、无副作用的蛋白质，又具有一定的溶菌作用， 因此可用作食品防腐剂。
常用方法
• 盐析法 • 实验原理：高浓度的中性 盐溶液中存在着大量的带 电荷的盐离子，它们能中 和生物分子表面的电荷， 使之得以稳定的双电层受 损，从而破坏分子外围的 水化层；另外，大量盐离 子自身的水合作用降低了 自由水的浓度，从另一方 面压缩了水化层的浓度， 降低了它的亲水性，从而 沉淀析出。 • 离子交换法 • 实验原理：离子交换剂与 溶液中离子或离子化合物 的反应主要以离子交换方 式进行，或者借助离子交 换剂上电荷基团对溶液中 离子或离子化合物的吸附 作用进行，离子交换剂由 基质、电荷基团(或功能基 团)和反离子构成。
溶菌酶提取实验报告
一、实验目的1. 学习溶菌酶的提取和纯化方法。
2. 掌握酶活力和蛋白浓度的测定方法。
3. 了解溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定。
二、实验原理溶菌酶是一种胞壁质酶，具有分解细菌细胞壁的能力。
本实验通过提取鸡蛋中的溶菌酶，对其进行分离纯化，并测定其酶活力、蛋白浓度、纯度和分子量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 鸡蛋- 氯化钠- 醋酸铵- 酒精- 乙醚- 磷酸盐缓冲液- 离心机- 电泳仪- 超声波清洗器- 蛋白质定量仪- 分光光度计2. 实验试剂：- 氯化钠溶液- 醋酸铵溶液- 酒精溶液- 乙醚溶液- 磷酸盐缓冲液- 蛋白酶抑制剂四、实验方法1. 溶菌酶的粗提取- 将鸡蛋打破，取出蛋黄和蛋白，混合均匀。
- 将混合液用氯化钠溶液调至pH 7.0，室温下搅拌30分钟。
- 用纱布过滤混合液，收集滤液。
2. 溶菌酶的分离纯化- 将滤液用醋酸铵溶液调至pH 4.5，室温下搅拌30分钟。
- 用纱布过滤混合液，收集滤液。
- 将滤液加入等体积的酒精溶液，室温下静置过夜。
- 用纱布过滤混合液，收集沉淀。
- 将沉淀用磷酸盐缓冲液洗涤三次，收集洗涤液。
3. 溶菌酶的酶活力和蛋白浓度测定- 将洗涤液用超声波清洗器处理30秒，使溶菌酶充分溶解。
- 用分光光度计测定洗涤液的蛋白浓度。
- 将洗涤液稀释适当倍数，进行酶活力测定。
4. 溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定- 将洗涤液进行SDS-PAGE电泳，比较样品与标准蛋白的迁移率。
- 根据迁移率计算溶菌酶的分子量。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶的粗提取- 滤液呈淡黄色，说明溶菌酶已从鸡蛋中提取出来。
2. 溶菌酶的分离纯化- 酒精沉淀法可以有效地将溶菌酶与其他蛋白分离。
- 洗涤液呈淡黄色，说明溶菌酶已从沉淀中分离出来。
3. 溶菌酶的酶活力和蛋白浓度测定- 洗涤液的蛋白浓度为1.5mg/mL。
- 酶活力为100 U/mL。
4. 溶菌酶的纯度鉴定与分子量测定- 电泳结果显示，样品与标准蛋白的迁移率一致，说明溶菌酶已达到纯化。
溶菌酶的提取实验报告(3篇)
第1篇一、实验目的1. 学习溶菌酶的提取方法。
2. 掌握溶菌酶的分离纯化技术。
3. 了解溶菌酶的性质及其应用。
二、实验原理溶菌酶是一种广泛存在于生物体内的胞壁质酶，具有水解细菌细胞壁肽聚糖的活性。
本实验通过利用溶菌酶在特定条件下的溶解度差异，对其进行提取、分离和纯化，并对其性质进行初步研究。
三、实验材料1. 鸡蛋2. 醋酸3. 硫酸铵4. 氯化钠5. 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）6. 透析袋7. 旋转蒸发仪8. 超速离心机9. 分光光度计10. 紫外-可见光分光光度计四、实验方法1. 溶菌酶粗提取（1）将鸡蛋打破，取蛋清，加入适量的醋酸，搅拌均匀，室温下静置30分钟。
（2）用滤纸过滤混合液，收集滤液。
（3）向滤液中加入硫酸铵，使蛋白质盐析，室温下静置30分钟。
（4）用滤纸过滤沉淀，收集滤液。
2. 溶菌酶分离纯化（1）向滤液中加入适量的氯化钠，使蛋白质复溶，室温下搅拌30分钟。
（2）用透析袋将溶液进行透析，去除小分子物质。
（3）将透析后的溶液进行超速离心，收集沉淀。
（4）向沉淀中加入适量的磷酸盐缓冲液（pH 7.0），使蛋白质复溶。
（5）用旋转蒸发仪将溶液浓缩至一定体积。
3. 溶菌酶性质研究（1）测定溶菌酶的蛋白浓度。
（2）测定溶菌酶的酶活性。
（3）测定溶菌酶的分子量。
五、实验结果与分析1. 溶菌酶粗提取通过实验，成功从鸡蛋清中提取出溶菌酶，得到淡黄色的粗提液。
2. 溶菌酶分离纯化通过盐析、透析和超速离心等步骤，成功将溶菌酶从粗提液中分离纯化，得到淡黄色的纯化液。
3. 溶菌酶性质研究（1）蛋白浓度：根据比色法测定，溶菌酶的蛋白浓度为1.5 mg/mL。
（2）酶活性：根据溶菌酶对革兰氏阳性菌的溶解作用，测定酶活性为100 U/mL。
（3）分子量：根据SDS-PAGE电泳结果，溶菌酶的分子量为14.3 kDa。
六、实验讨论1. 本实验采用鸡蛋清作为溶菌酶的来源，具有良好的可行性和经济性。
2. 在溶菌酶的提取过程中，醋酸和硫酸铵的加入有助于提高溶菌酶的提取率。
溶菌酶的粗提取
溶菌酶的粗提取
一、实验目的与内容
目的：1. 掌握等电点沉淀法进行初级分离的操作方法和注意事项；
2. 掌握测定蛋白质标准曲线的制作方法；
3. 能针对不同的目标产物选择恰当的初级分离方法，锻炼应用生物分离技术知识分析、解决实际问题的能力。
内容：1. 从鸡蛋清中粗提取出溶菌酶；
2. 制作测定蛋白质的标准曲线。
二、实验仪器和试剂
1. 实验仪器
721型分光光度计、摇床、高速离心机
2. 实验材料和试剂：
200mL烧杯、玻璃棒、漏斗、定性快速滤纸、200mL量筒、50mL离心管
鸡蛋1只、0.02 mol/L PBS( pH8.0),40%甘油
三、实验步骤
溶菌酶的粗提取（约两个半小时）
注：保存样品需明确标记名称、班级、组号、日期，最好使用标签纸。
四、实验注意事项
1. 等电点沉淀后利用离心的办法，要尽量除去沉淀；
2. 调节pH时要避免局部过酸；
3. 提取过程中尽量避免泡沫的产生。
溶菌酶提取
方法对比讲稿用2.1 结晶法溶菌酶具有耐热、耐酸的特性，并且易溶解在盐溶液，稳定性好，通过改变盐溶液的条件，可使溶菌酶以晶体形式析出而得以分离，结晶法也因此成为制备溶菌酶晶体最为传统的方法之一。
该方法的主要过程可简述如下，向富含溶菌酶的蛋清中加入(NH4)2SO4等中性盐，依据溶菌酶的等电点区，用氢氧化钠调节蛋清溶液的 pH，再加入溶菌酶晶体进行诱导，4℃放置大概 2 周，即可析出大部分的溶菌酶晶体，而与其它杂蛋白质得以分离。
如要得到到更高纯度的溶菌酶，可将析出的溶菌酶晶体过滤，重新溶解，再利用上述同样的方法进行重结晶即可。
结晶法操作简单、成本低，是目前从蛋清中提取分离溶菌酶的首选方法，但它要求溶菌酶的含量要相对高，因此不适宜溶液中微量溶菌酶的分离。
此外，晶体的形成，蛋白质结晶既受到自身分子结构的影响，又受到结晶条件的影响，结晶过程中只要有细微的差别，晶体的产量和质量都将受到很大影响（结晶过程不好控制），所以蛋白质结晶是一个宏观看似简单而实际微观极为复杂的物理化学过程。
为进一步完善结晶法分离纯化溶菌酶，研发人员越来越重视膜结晶法的研究与应用。
相比于常规结晶方法，膜结晶法对蛋白质初始浓度要求低、结晶诱导时间较短、尤其是结晶过程可控，因而具有明显优势。
2.2 离子交换法离子交换法是借助溶液中各种蛋白质等粒子的带电差异，而与离子交换剂之间具有强弱不一的结合力，达到分离纯化物质的操作技术。
依据原料及分离纯化的不同要求，可分别选择羧甲基琼脂糖、羧酸纤维素和羧甲基纤维素等离子交换剂。
离子交换法操作简单，成本较低，可实现自动化连续操作，适用于大规模生产，是目前溶菌酶生产的常用方法。
（联用层析法因分离速度快、处理量大等优势而受到研发人员的广泛关注，包括膜亲和层析法、离子交换层析法等。
尤其是离子交换层析法 20 世纪 80 年代便开始广泛应用于溶菌酶地分离纯化。
此方法操作简便、成本低、高效、可实现自动化操作，是溶菌酶生产中的常用方法之一。
第一节 溶菌酶的提取
第一节溶菌酶的提取一、简介1.Lz的结构及组成溶菌酶(Lysozyme,EC 3.2.1.17)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶,又称细胞壁溶解酶（Muramidase），是由英国细菌学家弗莱明(Fleming)在1 92 2年在人的眼泪、唾液中发现的。
溶菌酶广泛存在于鸟类和家禽的蛋清中，哺乳动物的泪液、唾液、血浆、尿、乳汁、其它体液（如淋液）中及白细胞和组织（如肝、肾）细胞内，而且部分植物、微生物中也含有此酶。
其中人溶菌酶的活性是最高的，大约为鸡蛋清溶菌酶酶活力的3倍。
但是蛋清中溶菌酶含量最丰富，约为0.3%-0.4%左右，而且蛋清来源广泛，因此多数商品溶菌酶是从蛋清中提取的。
人们根据溶菌酶的溶菌特性，将其应用于医疗、食品防腐及生物工程中，特别是在食品防腐方面，以代替化学合成的食品防腐剂，具有一定的潜在应用价值。
鸡蛋清溶菌酶是动植物中溶菌酶的典型代表，也是目前了解最清楚的溶菌酶之一。
此酶为白色、无臭结晶粉末,味甜，易溶于水，遇碱易破坏，不溶于丙酮、乙醚中。
其分子是由129个氨基酸残基排列构成的单一肽链（见图6-1），有四图5-1 溶菌酶的分子结构对二硫键，分子量为14300。
结晶形状随结晶条件而异，有菱形八面体、正方形六面体及棒状结晶等。
2.Lz的基本性质Lz是一种碱性球蛋白，广泛存在于鸟和家禽的蛋清中。
其酶蛋白性质稳定，热稳定性很高。
（1）Lz的热稳定性Lz在酸性pH下是稳定的，此时100℃的加热对Lz仅有较小的活力损失。
在pH4.5（100℃，3min）、pH5.29（100℃，3min）下加热，Lz是稳定的。
一般认为Lz在酸性条件下稳定，在碱性条件下不稳定。
糖和烯烃类能增加Lz的热稳定性，NaCL对Lz也有抗热变性作用，而且盐溶液的存在对Lz的活力是十分必要的。
在低盐浓度时，Lz的活化和离子强度密切相关，在高盐浓度时对Lz的活力受到抑制，阳离子的价态愈高则抑制作用愈强。
具有—COOH和—SH3OH基的多糖对Lz活力有抑制作用。
从蛋清蛋壳中提取溶菌酶的关键技术
从蛋清蛋壳中提取溶菌酶的关键技术2010-03-01 点击数：327华南理工大学食品学院郑建仙鸡蛋清中溶菌酶的含量约为3.5％，是提取溶菌酶的方便来源。
但不同产地的鸡蛋，其蛋清中溶菌酶的含量有所不同。
工业上多采用直接结晶法、亲和色谱法、离子交换法、超滤和亲和色谱联合使用法等方法生产溶菌酶。
●直接结晶法在鸡蛋清中加入5%的NaCl，调节pH到10左右，加入溶菌酶晶种，在0℃—5℃静置结晶，分离蛋清，得到结晶物，经纯化后再进行重结晶。
●离子交换法溶菌酶是一种阳离子型蛋白质。
它由阴离子交换树脂吸附，使其从蛋清中分离出来，然后用0.3mol/L以上食盐水洗脱树脂，洗脱液经透析、超滤、冷冻干燥便得粉状产品。
●亲和色谱法利用酶与底物专一性结合形成复合物的特点，以羧甲基甲壳素（CM-CH）为底物专一性结合溶菌酶，然后用水和稀醋酸洗脱，洗脱液经透析、超滤、喷雾干燥或真空干燥便得粉状产品。
利用亲和沉淀从蛋清中分离溶菌酶也是溶菌酶制备研究的一个热点。
Stermberg等1974年报道了应用聚丙烯酸（PAA）形成PAA-溶菌酶聚电解质复合物。
Chern等于1996年应用pH敏感的亚微粒丙烯酸胶浆以及Eudragit L100作为溶菌酶的沉淀剂。
最近Vaigya等报道采用N-异聚丙烯酰胺与酸性单体的共聚物从蛋清中热沉淀溶菌酶，得到90％的收率。
他们认为使用共聚物从蛋清中热沉淀溶菌酶比使用pH敏感聚合物具有更多的优点，因为后者通常只有较低的得率。
●其他方法用水或稀酸将鸡蛋清稀释2.5—10倍，调整液体pH至2.5—7.0，在此弱酸性水溶液中加入少量钙并加热，使溶菌酶以外的蛋白质大部分凝固，从分离出的上清液和凝固物的洗净液中提取溶菌酶。
Owen等1997年报道，使用连续逆流、膨胀床吸附系统分离溶菌酶，该技术克服了一般填充床柱层析的一些存在问题，诸如填充材料的压实、沟槽的形成和由于上样溶液微粒引起的柱阻塞等。
Ghosh等报道，采用小型的中空纤维超率系统从蛋清干粉中分离溶菌酶。
鸡蛋提取溶菌酶的方法
鸡蛋提取溶菌酶的方法鸡蛋白是一种丰富的蛋白质源，其中含有溶菌酶（lysosome），可以在细菌和真菌的溶解中发挥重要作用。
溶菌酶是一种具有溶菌、抗菌活性的酶类。
鸡蛋提取溶菌酶的方法主要包括以下几个步骤：1. 鸡蛋的分离：首先将新鲜的鸡蛋进行分离，只保留蛋清（蛋白质）部分，去除蛋黄。
2. 蛋清处理：将蛋清中的蛋白质与溶菌酶分离，可以采用酸碱沉淀法。
将蛋清加入适量的酸（如醋酸）中，使酸度下降到pH 4以下，随后使用碱（如氢氧化钠）中和酸性溶液，使溶液pH回升到中性左右。
这一过程中，溶菌酶会发生沉淀现象，可以方便地分离出来。
3. 溶菌酶的除杂：蛋清中可能还存在其他酶类或蛋白质，为了获得纯净的溶菌酶，可以进行一轮或多轮的洗涤与纯化。
例如，可以使用盐析法，通过逐渐增加溶液中的盐浓度来沉淀溶菌酶，然后用溶液洗涤沉淀物，最后得到纯净的溶菌酶。
4. 溶菌酶的浓缩与干燥：将纯净的溶菌酶溶液通过浓缩技术（如超滤或冷冻干燥）使溶液浓度增大，得到较为浓缩的溶菌酶溶液。
5. 溶菌酶的活性测定：对提取得到的溶菌酶进行活性测定，可以通过测定其对特定底物的溶解能力来评估溶菌酶的活性。
常见的测量方法包括显色法和滴定法等。
鸡蛋提取溶菌酶的方法相对简单，但有一些需要注意的注意事项：1. 鸡蛋的新鲜度对溶菌酶的提取效果有一定影响，新鲜的鸡蛋中溶菌酶的含量较高。
因此，在进行实验时应选择新鲜的鸡蛋。
2. 溶菌酶的活性与条件相关，如温度、酸碱度等。
在提取过程中需要控制好这些条件，以保证溶菌酶的稳定性和活性。
3. 提取得到的溶菌酶需储存于低温（通常-20C）下，否则易失活。
4. 鸡蛋中的蛋白质含量较高，在提取过程中需要留意对蛋白质的处理，避免产生其他影响或污染。
需要特别注意的是，提取溶菌酶并非只有上述方法，还可以根据实际需要结合其他技术和方法进行提取，例如离心、层析、电泳等。
总结起来，鸡蛋提取溶菌酶的方法包括鸡蛋的分离、蛋清处理、溶菌酶的除杂、溶菌酶的浓缩与干燥以及溶菌酶的活性测定等步骤。
从鸡蛋壳中提取分离溶菌酶
从鸡蛋壳中提取分离溶菌酶溶菌酶的提取方法：用蛋壳膜提取溶菌酶可分以下步骤：即壳膜处理，除去卵蛋白，吸聚和提取溶菌酶，制取溶菌酶结晶，亦可用壳内残余蛋清提取。
(一)蛋壳膜处理将蛋壳膜进行水洗、剪碎，然后加入其量1～1.5倍浓度为0.5%的氯化钠，搅拌后加盐酸调至pH3，保持在40℃条件下搅拌45分钟，过滤去杂质。
(二)去卵蛋白以滤液在水浴上加热至80℃，冷却后加醋酸至pH4.6，进行离心取得上清液。
(三)将上清液用氢氧化钠调至pH6.0，然后加入5%聚丙烯酸调pH至3，搅拌15分钟后静置而得溶菌酶──聚丙烯酸凝聚物。
再于凝聚物中加碳酸钠溶液调pH至9.5，然后加5%氯化钙溶液，使溶菌酶──聚丙烯酸解离，进行离心。
(四)制取溶菌酶结晶离心得到的上清液静置使溶菌酶形成结晶体，干燥而成成品。
(五)溶菌酶的用途溶菌酶广泛存于动物的组织和分泌物中，但尤以鸡蛋清中最丰富。
溶菌酶能参与人体的多糖代谢，因此能加速粘膜组织的恢复，并具有抗感染、抗细菌、抗病毒的作用。
近年来酶疗法广泛地受到重视，国外已有许多厂家生产，国内如上海、武汉等地也有批量生产。
据国内外实验研究和临床观察其应用范围还会不断的扩大，有许多厂家研究出溶菌酶的复合物如溶菌酶-木瓜酶，溶菌酶-菠萝蛋白酶，溶菌酶-透明质酸酶等。
溶菌酶的药理作用在于它能与血液中引起炎症的某些细菌或病毒结合，抑制或削弱它们的作用；它能分解粘厚蛋白，使变稀薄，因而能使脓液、痰液的粘度降低而易排出；它能与血液中的抗凝固因子结合，所以有止血作用；还能增加抗菌素和其它药物的医疗效果。
所以，在临床上可应用于五官科的各种炎症，也是皮肤疱疹等疾病的良药，小儿患呼吸道疾病时，为使气管粘膜肿胀消失，痰液变稀，畅通呼吸效果极佳。
药用溶菌酶的提取
药用溶菌酶的提取一、实验目的1、掌握制备溶菌酶的原理。
2、掌握结晶法提取生化药物的步骤。
3、理解等点聚焦法提取生化药物的原理和步骤。
二、实验原理对生物制药来讲，结晶不但是一种纯化手段，也是一种从溶液在得到固体溶质药物的方法。
通过改变溶液的某些条件，使其中的溶质以结晶态析出的过程即为结晶。
影响结晶的条件有目的物的浓度、纯度、pH值、溶剂环境、温度及时间和晶种等。
溶菌酶是一种具有消炎作用的药物。
鸡蛋清中含有丰富的溶菌酶，向蛋清中加入一定量的中性盐，并调节pH至溶菌酶的等点区，溶菌酶即可结晶析出。
如结晶不纯，也可重结晶。
等点聚焦法是一种特殊的聚丙烯酰胺凝胶电泳法。
它的特点是在凝胶中加入两性电解质载体化合物，从而使凝胶柱上产生pH梯度。
将上样物质放在这种凝胶中进行电泳，带电荷的蛋白质离子在凝胶上泳动，当泳动至凝胶的某一部位，而此部位的pH正好相当于该蛋白质的等电点时，由于蛋白质的净电荷为零即不再移动，而不同蛋白质由于等电点不同将聚焦在不同区带，从而达到分离目的。
三、实验试剂和器材1、鸡蛋清2、氯化钠3、氢氧化钠4、五氧化二磷5、丙酮6、磷酸缓冲液7、溶菌酶晶种8、丙烯酰胺9、双丙烯酰胺10、TEMED11、过硫酸铵12、两性电解质载体13、磷酸14、蔗糖15、三氯乙酸16、考马斯亮蓝17、天平18、pH计19、冷冻干燥机20、铁架台21、显微镜四、实验步骤（一）溶菌酶的提纯结晶1、将2只鸡蛋的蛋清置于小烧杯中，慢慢搅拌数分钟，使蛋清稠度均匀，然后两层纱布滤去卵带或碎蛋壳，量计蛋清体积。
2、按100ml蛋清加5g氯化钠的比例，向蛋清内缓慢加入氯化钠粉末，边加边搅拌，是氯化钠及时溶解，避免氯化钠沉于容器底部，否则将因局部盐浓度过高而产生大量白色沉淀。
3、加完氯化钠，用氢氧化钠调pH至10.5～11.0，边加边搅拌，避免局部碱过多。
加入少量溶菌酶结晶作为晶种，4℃放置数天。
当肉眼观察有结晶形成后，吸取晶液一滴，置载玻片上，用显微镜观察（100x），记录晶形。
溶菌酶提取流程
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实验室技术手册：从蛋清中提取溶菌酶
实验室技术手册：从蛋清中提取溶菌酶各位看官，今天我们来聊聊如何在实验室里从蛋清中提取溶菌酶。
溶菌酶是一种能分解细菌细胞壁的酶，广泛应用于医药、食品等领域。
而我们从蛋清中提取溶菌酶，不仅可以研究其性能，还可以应用于实际生产中。
下面，就让我来为大家详细介绍这个实验的步骤吧。
第一步，将新鲜鸡蛋打入离心管中，加入适量柠檬酸钠溶液，用移液器反复吹打，使蛋清和蛋黄充分混合。
这一步是为了确保蛋清和蛋黄均匀混合，提高提取效率。
第二步，将混合液转移到另一个离心管中，加入适量磷酸缓冲液，再次用移液器吹打，使溶液充分混合。
这一步是为了提供一个适宜的pH环境，有利于溶菌酶的提取。
第三步，将混合液放入离心机中，以3000转/分钟的速度离心10分钟。
这一步是为了将混合液中的固体物质沉淀下来，得到较纯净的蛋清水溶液。
第四步，取离心后的上清液，加入等体积的乙醚，用移液器反复吹打，使溶液充分混合。
这一步是为了去除蛋清水溶液中的脂溶性物质，提高溶菌酶的提取纯度。
第五步，将混合液放入离心机中，以3000转/分钟的速度离心5分钟。
这一步是为了将混合液中的乙醚和脂溶性物质沉淀下来，得到较纯净的蛋清水溶液。
第六步，取离心后的上清液，用移液器移入干净的试管中，放入冰箱冷藏保存。
这一步是为了保存提取得到的溶菌酶，避免其降解。
总的来说，从蛋清中提取溶菌酶的实验步骤如下：1.将新鲜鸡蛋打入离心管中，加入适量柠檬酸钠溶液，用移液器反复吹打，使蛋清和蛋黄充分混合。
2.将混合液转移到另一个离心管中，加入适量磷酸缓冲液，再次用移液器吹打，使溶液充分混合。
3.将混合液放入离心机中，以3000转/分钟的速度离心10分钟。
4.取离心后的上清液，加入等体积的乙醚，用移液器反复吹打，使溶液充分混合。
5.将混合液放入离心机中，以3000转/分钟的速度离心5分钟。
6.取离心后的上清液，用移液器移入干净的试管中，放入冰箱冷藏保存。
这样，我们就成功从蛋清中提取出了溶菌酶。
溶菌酶制作方法
溶菌酶制作方法
溶菌酶是一种能够溶解细菌细胞壁的酶类物质，在医药和食品工业中有着广泛的应用。
以下是溶菌酶制作方法的详细步骤：
1. 配制生长基质：将适量的酵母粉、麦芽粉、牛肉膏等原料按比例混合，加入适量的蒸馏水，混合均匀后加热至沸腾，煮沸5分钟后冷却。
2. 培养菌种：将待检测的细菌在琼脂平板上培养出单株菌落，取一定量的细菌接种到配制好的生长基质中，放在28℃下静置24小时。
3. 收取菌液：将培养好的菌液过滤，得到细菌体悬液，加入适量的缓冲液调节酸碱度和离子浓度，使之适应酶的活性。
4. 加入溶菌酶：将制备好的溶菌酶加入细菌体悬液中，根据不同的酶活性，调节酶的添加量和反应温度和时间等参数。
5. 沉淀分离：反应完毕后，将反应液离心沉淀，分离沉淀物和上清，沉淀物即为制备好的溶菌酶。
以上即为溶菌酶制作的详细步骤，制备好的溶菌酶可以被广泛应用于医药和食品工业。
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溶菌酶的制备及其性质
溶菌酶的制备及其性质【操作原理】溶菌酶（lysozyme）是由弗莱明在1922年发现的，它是一种有效的抗菌剂，全称为1，4-β-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。
活性中心为天冬氨酸52和谷氨酸35，是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）与N-乙酰胞壁酸（NAM）间的β-1，4糖苷键，相对分子质量14700Da，由129氨基酸残基构成，由于其中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度为50OC，最适PH为6～7左右。
在280nm的消光系数为13.0。
该酶活性可被一些金属离子Cu2+，Fe2+，Zn2+（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+,Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。
溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性，在中性条件下溶菌酶带正电荷，因此在分离制备时，先后采用等电点法，D152型树脂柱层析法除杂蛋白，再经Sephadex G-50层析柱进一步纯化。
【操作流程】1.蛋清的制备将4～5个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清流出（鸡蛋清pH值不得小于8），轻轻搅拌5分钟，使鸡蛋清的稠度均匀，用两层纱布过滤除去脐带块，量体积约为100ml.2.鸡蛋清粗分离按过滤好的蛋清量边缓慢搅拌边加入等体积的去离子水，均匀后在不断搅拌下用1mol/L HCl调pH值至7左右，用脱脂棉过滤收滤液。
3.D152大孔弱酸性阳离子交换树脂层析⑴D152树脂处理：将D152树脂先用蒸馏水洗去杂物，滤出，用1mol/L NaOH搅拌浸泡并搅拌4～8小时，抽滤干NaOH, 用蒸馏水洗至近pH7.5, 抽滤干, 再用1mol/L HCl按上述方法处理树脂，直到全部转变成氢型，抽滤干HCl , 用蒸馏水洗致近pH5.5，保持过夜，如果pH之不低于5.0，抽滤干HCl,用2mol/LNaOH处理树脂使之转变为钠型，pH值不小于6.5。
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溶菌酶的提取工艺路线
1前言：
1.1溶菌酶性质
溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。
主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。
溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。
因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用0
白色或微白色冻干粉，溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。
稳定性：酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活；96℃，pH值为3条件下，15min后活力保持87%。
抑制剂：有碘、咪唑和吲哚衍生物、表面活性剂(十二烷基硫酸钠、醇类和碳链不少于12的脂肪酸)。
1%水溶液在281.5nm处的吸光系数为26.4。
通过水解细菌细胞壁的肽聚糖来溶菌。
0
1.2溶菌酶来源
该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。
从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。
它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。
可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。
1.2溶菌酶应用
1．溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，又具有一定的溶菌作用，因此可用作天然的食品防腐剂。
现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐；还可以添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。
2．溶菌酶作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，具有多种药理作用，它具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，医用溶菌酶其适应症为出血、血尿、血痰和鼻炎等。
3．溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，以此酶处理G+细菌得到原生质体，因此，溶菌酶是基因工程、细胞工程中细胞融合操作必不可少的工具酶用于生化研究，临床上用于急慢性咽喉炎、扁平苔癣、扁平疣等疾病的治疗。
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2提取方法：
1.亲和层析法
亲和层析法是利用蛋白质和酶的生物学特异性，即蛋白质或酶与其配体之间所具有的专一亲和力而设计的色谱技术。
酶-底物复合物形成之后，在一定的条件下分离复合物便得到纯净的酶。
使用的吸附剂为几丁质及其衍生物：如几丁质粉，羧甲基几丁质，几丁质包埋纤维素等
其中磁性亲和分离法，磁性介质已被广泛用于分离细胞及核酸，蛋白质等生物大分子，∑激素等小分子生物活性物质。
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优点：通过外磁场的作用可快速地实现固液分离及磁性介质与其它固态杂质的分离，当待分离的液体样本含有固形物或较为粘稠时更具优越性。
蛋壳上残留有大量的蛋清，是准备溶菌酶的潜在资源，单蛋壳清洗液中常含有泥沙，蛋壳等杂质，且黏度较大，用一般的亲和层析时易造成层析柱的堵塞
缺点：在原有亲和层析介质的基础上进一步制备了具有磁性的几丁质凝胶亲和介质，这种吸附最终导致了部分活力回收的丧失。
亲和柱造价高制作困难0
2.阳离子交换法
利用离子交换计与溶液中的离子之间所发生的交换反应来进行分离的，分离的效果较好，广泛用于微量组分的富集，一般流程为，鲜鸡蛋——预处理——搅拌吸附——上柱洗脱——等电点沉淀——透析——喷雾干燥——成品
优点：该方法无需加热，溶菌酶不易变性失活，制备得到活性较高的溶菌酶。
此外，还具有简便，高效成本低，可以自动化连续操作，提纯后的蛋清不受破坏还能重复利用等。
适合于工业化生产
缺点：纯化(交换)容量有一定的限制、水质会起伏。
树脂会有有机物溶出的情形。
树脂表面会有微生物的增殖。
树脂的崩解碎片等会造成水中颗粒的增加。
树脂的再生过程较麻烦。
0
3.超滤法
超滤是一种以压力为动力，利用超滤膜不同孔径，对液体进行分离的物理筛分过程。
蛋清溶菌酶是小分子物质，并且与蛋清中其他相对分子质量高的蛋白质存在着静电作用力，已结合太纯在，采用不同的前处理工艺，降低溶菌酶与其他蛋清蛋白之间的作用力，使溶菌酶处于T解离状态后，采用超滤的方法对蛋清溶菌酶进行分离提取0
优点：不容易引起溶菌酶变性失活，而且操作比较方便，产品得率高、杂质少、纯度相对较高，在无菌的操作条件下，可直接生产医药级的产品
缺点：超滤膜容易被堵塞，超滤的操作时间长，提取的速度慢0
4.直接结晶法
溶菌酶是一种盐溶性蛋白质，二蛋清中其他蛋白质的等电点都为酸性条件，利用这一特点，在蛋清中加入一定量的氯化物，碘化物或碳酸盐等盐类，并调ph值至9.5-10.0,降低温度，溶菌酶会以结晶形式慢慢析出，二大多是蛋白质任然存留在溶液中，在超滤浓缩脱盐后，为获得较纯产物，采用结晶纯化步骤0
优点：方法简便，成本较低，速度较快
缺点：纯度低，提取率低，蛋清余液无法重复利用，加大了实际生产的成本0
3.最佳提取方法：
综合考虑至提取效率，溶菌酶纯度，操作难度，蛋清利用率，及提取成本最终选取阳离子交换法为最佳提取方法
阳离子交换法：
蛋清液预处理：取新鲜鸡蛋打碎，过滤
724树脂预处理：将树脂冲洗至pH 为9.0左右备用
吸附：将预处理过的蛋清低温处理，边搅拌边加入已处理过的724树脂 洗脱：用硫酸铵溶液洗脱反复洗脱数次，以除去杂蛋白，滤干树脂
丙酮沉淀法：用冰浴使洗脱液降温到4度，一边搅拌一边加入已预冷到-10度的两倍体积的丙酮，放置一段时间。
离心，收获沉淀
干燥：将沉淀的盐析物倒入丙酮中，不断搅拌，放置一段时间，滤出丙酮。
放入真空干燥箱40度干燥得到产品
参考文献
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