溶菌酶的提取工艺路线

溶菌酶的提取工艺路线

1前言：

1.1溶菌酶性质

溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramide glycanohydrlase），是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用0

白色或微白色冻干粉，溶于水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。

稳定性：酸性介质中可稳定存在，碱性介质中易失活；96℃，pH值为3条件下，15min后活力保持87%。

抑制剂：有碘、咪唑和吲哚衍生物、表面活性剂(十二烷基硫酸钠、醇类和碳链不少于12的脂肪酸)。1%水溶液在281.5nm处的吸光系数为26.4。通过水解细菌细胞壁的肽聚糖来溶菌。0

1.2溶菌酶来源

该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以蛋清含量最为丰富。从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨基酸残基构成的单一肽链。它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。可分解溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。

1.2溶菌酶应用

1．溶菌酶是一种无毒、无副作用的蛋白质，又具有一定的溶菌作用，因此可用作天然的食品防腐剂。现已广泛应用于水产品、肉食品、蛋糕、清酒、料酒及饮料中的防腐；还可以添入乳粉中，使牛乳人乳化，以抑制肠道中腐败微生物的生存，同时直接或间接地促进肠道中双歧杆菌的增殖。

2．溶菌酶作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，具有多种药理作用，它具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，医用溶菌酶其适应症为出血、血尿、血痰和鼻炎等。

3．溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，以此酶处理G+细菌得到原生质体，因此，溶菌酶是基因工程、细胞工程中细胞融合操作必不可少的工具酶用于生化研究，临床上用于急慢性咽喉炎、扁平苔癣、扁平疣等疾病的治疗。0

2提取方法：

1.亲和层析法

亲和层析法是利用蛋白质和酶的生物学特异性，即蛋白质或酶与其配体之间所具有的专一亲和力而设计的色谱技术。酶-底物复合物形成之后，在一定的条件下分离复合物便得到纯净的酶。使用的吸附剂为几丁质及其衍生物：如几丁质粉，羧甲基几丁质，几丁质包埋纤维素等

其中磁性亲和分离法，磁性介质已被广泛用于分离细胞及核酸，蛋白质等生物大分子，∑激素等小分子生物活性物质。0

优点：通过外磁场的作用可快速地实现固液分离及磁性介质与其它固态杂质的分离，当待分离的液体样本含有固形物或较为粘稠时更具优越性。蛋壳上残留有大量的蛋清，是准备溶菌酶的潜在资源，单蛋壳清洗液中常含有泥沙，蛋壳等杂质，且黏度较大，用一般的亲和层析时易造成层析柱的堵塞

缺点：在原有亲和层析介质的基础上进一步制备了具有磁性的几丁质凝胶亲和介质，这种吸附最终导致了部分活力回收的丧失。亲和柱造价高制作困难0

2.阳离子交换法

利用离子交换计与溶液中的离子之间所发生的交换反应来进行分离的，分离的效果较好，广泛用于微量组分的富集，一般流程为，鲜鸡蛋——预处理——搅拌吸附——上柱洗脱——等电点沉淀——透析——喷雾干燥——成品

优点：该方法无需加热，溶菌酶不易变性失活，制备得到活性较高的溶菌酶。此外，还具有简便，高效成本低，可以自动化连续操作，提纯后的蛋清不受破坏还能重复利用等。适合于工业化生产

缺点：纯化(交换)容量有一定的限制、水质会起伏。树脂会有有机物溶出的情形。树脂表面会有微生物的增殖。树脂的崩解碎片等会造成水中颗粒的增加。树脂的再生过程较麻烦。0

3.超滤法

超滤是一种以压力为动力，利用超滤膜不同孔径，对液体进行分离的物理筛分过程。蛋清溶菌酶是小分子物质，并且与蛋清中其他相对分子质量高的蛋白质存在着静电作用力，已结合太纯在，采用不同的前处理工艺，降低溶菌酶与其他蛋清蛋白之间的作用力，使溶菌酶处于T解离状态后，采用超滤的方法对蛋清溶菌酶进行分离提取0

优点：不容易引起溶菌酶变性失活，而且操作比较方便，产品得率高、杂质少、纯度相对较高，在无菌的操作条件下，可直接生产医药级的产品

缺点：超滤膜容易被堵塞，超滤的操作时间长，提取的速度慢0

4.直接结晶法

溶菌酶是一种盐溶性蛋白质，二蛋清中其他蛋白质的等电点都为酸性条件，利用这一特点，在蛋清中加入一定量的氯化物，碘化物或碳酸盐等盐类，并调ph值至9.5-10.0,降低温度，溶菌酶会以结晶形式慢慢析出，二大多是蛋白质任然存留在溶液中，在超滤浓缩脱盐后，为获得较纯产物，采用结晶纯化步骤0

优点：方法简便，成本较低，速度较快

缺点：纯度低，提取率低，蛋清余液无法重复利用，加大了实际生产的成本0

3.最佳提取方法：

综合考虑至提取效率，溶菌酶纯度，操作难度，蛋清利用率，及提取成本最终选取阳离子交换法为最佳提取方法

阳离子交换法：

蛋清液预处理：取新鲜鸡蛋打碎，过滤

724树脂预处理：将树脂冲洗至pH 为9.0左右备用

吸附：将预处理过的蛋清低温处理，边搅拌边加入已处理过的724树脂 洗脱：用硫酸铵溶液洗脱反复洗脱数次，以除去杂蛋白，滤干树脂

丙酮沉淀法：用冰浴使洗脱液降温到4度，一边搅拌一边加入已预冷到-10度的两倍体积的丙酮，放置一段时间。离心，收获沉淀

干燥：将沉淀的盐析物倒入丙酮中，不断搅拌，放置一段时间，滤出丙酮。放入真空干燥箱40度干燥得到产品

参考文献

0沈芃,溶菌酶抗菌作用及其在防控医院感染中的应用[J ].《中国消毒学杂志》, 2014, 31(10):1089-1091

0田洪源，刘明启,蛋清、重组溶菌酶酶学性质及其对小鼠肠道菌群和血清生化指标的影响[J ].《中国食品学报》, 2012, 12(10):16-23

0姜馗. 蛋清溶菌酶提取技术的研究[J ].《中国农业大学》, 2005,(1) :58 - 59.

0余海芬. 蛋清中溶菌酶的高效提取及其定量测定方法研究[J ].《华中农业大学》, 2010

0张晓旭. 蛋壳的开发与利用. [J ].《广东饲料》, 2009, 18(6):36-38

0张航航，黄小波. 蛋清溶菌酶提取的研究进展[J ].《轻工科技》, 2007,

23(9):29-30

0史小利，李宗谦，蛋清溶菌酶提取工艺研究[J ].《现代农业科技》,

2008(6):166-166

0吴旭亚，游庆红，蛋清溶菌酶的提取分离与酶活研究[J ].《广州化工》, 2012, 40(19):51-53

0傅冰，季秀玲，鸡蛋清中溶菌酶的分离提取[J ].《浙江农业学报》,

2013(6):1364-1367