Southern blotting实验方法
Southern blotting实验
• 将膜置于另一个托盘中，加150mlblocking solution，封闭，40min. （１０×blocking solution１：１０用 Maleic acid buffer马来酸稀释)
• 将膜置于另一个托盘中，加５０ｍｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ solution（ ５０ｍ ｌblocking solution＋５μｌ Ａｂ ） 室温下３０ｍｉｎ.（如有数张膜，则每 １０ｍｉｎ将杂交膜上下交换一下） • 再用Washing buffer洗２次，每次１５ ｍｉｎ.
7.杂交
• 预杂交，膜置于杂交袋中，只加杂交液，要赶 走气泡，杂交液数量依据膜的大小定（3.5 ml/100 cm2 membrane)，预杂交温度根据探针 和DNA结合区域的退火温度而定，一般２－ ３ｈ。 • 正式杂交，加探针(100℃，5min)，补一些杂 交液，同样要赶气泡，置于杂交炉一定的杂交 温度(42℃）过夜。
• （7）、压片、显影、洗片。
3.将DNA转移到固定相支持物上的方法
•
• （1）、毛细管转移，本法由Southern发明，故又称为 Southern转移，该法的优点是简单，不需要其他仪器， 确定是转移时长，转移后杂交信号弱； • （2）、电泳转移，将DNA变性后，可电泳转移到硝酸纤 维素滤膜或尼龙膜上，该法不需要脱嘌呤，可直接转移 较大片段的DNA，不过需要电流量 较大，温度难以控制； • （3）、真空转移，有多种真空转移的商品化仪器，他们 一般是将硝酸纤维素滤膜或尼龙膜放在真空室上的多空 屏上，再将凝胶置于滤膜上，缓冲液从上面的贮液槽中 留下，洗脱凝胶中的DNA，使其沉积在滤膜上。该法快 速，缺点是如不小心，凝胶易碎，并且洗膜不严格时， 显影背景会比较深。
5.DNA的转移与固定
酶切好的基因组电泳 • 0.25M HCl至溴酚兰变黄
SOUTHERNBLOTTING实验操作流程
SOUTHERN BLOTTING实验操作流程A.小麦基因组DNA的提取1)采集5g鲜嫩的小麦幼苗，将其剪成2cm左右的片段，用液氮冷冻后在研钵中将其研成粉末（研磨15min左右）。
2)将研磨好的样品转移到预冷的50ml离心管中，加入20ml预热的S buffer，颠倒混匀。
S Buffer成分100mM Tris.Cl pH8.5100mM NaCl50mM EDTA pH8.02％SDS3)于65℃水浴锅中温育1-2h，并不时轻柔混匀。
4)加入20ml（等体积的）酚/氯仿，轻柔地颠倒混匀，直至呈乳状（注意：保证混匀。
为有效除去蛋白，此步可以重复）。
5)用水平转子离心机以2000rpm的转速离心20-30min。
6)加入等体积的氯仿，轻柔地颠倒混匀，2000rpm离心20min。
7)转移上清到1个灭菌的50ml离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置一段时间，用玻璃勾将DNA钩出。
8)用70％的乙醇清洗DNA 2-3次后，将其挑在玻璃钩上晾干，然后溶解在5ml 1×TE中。
9)待DNA完全溶解后接入10μl RNase，于37℃恒温箱中温育1h。
10)加入等体积的酚/氯仿，轻柔颠倒混匀，以2000rpm的转速离心15min。
11)转移上清至1个灭菌的离心管中，加入等体积的氯仿，混匀，以2000rpm的转速离心15min。
12)转移上清至1个灭菌的离心管中，加入1/10 体积3M pH 5.0的乙酸钠（终浓度为0.3M），混匀后再加入2倍体积95％的乙醇，混匀。
13)用玻璃勾将DNA钩出，然后用70％的乙醇清洗2-3次，晾干后加入1.8-2ml 1×TE溶解。
14)待DNA完全溶解后，取1μL DNA电泳，检测DNA的浓度和完整性。
15)DNA样品可以放在4℃保存备用。
B.小麦基因组DNA的酶切1）通常情况下采用下列酶进行谷类作物DNA分析。
识别6碱基序列的酶识别4碱基序列的酶Apa I Hind III Bam HI Alu I Mbo I Hha ISal I Bgl I Sst I Dde I Msp I Taq IDra I Pvu II Eco RV Hae III Rsa I Hinf IEco RI Xba I2）如果一次酶切DNA的量在10μg左右，一般采用30μL反应体系。
southern bloting的操作步骤和要点
southern bloting的操作步骤和要点Southern blotting是一种常用的分子生物学技术，用于检测和分离DNA序列。
它是通过将DNA样本进行电泳分离，然后转移到固体载体上，并通过与DNA 探针的特异性杂交来检测特定的DNA序列。
在这篇文章中，我们将一步一步解释Southern blotting的操作步骤和要点。
第一部分：准备工作在进行Southern blotting之前，需要进行一些准备工作。
首先，准备DNA样本。
可以从细胞中提取总DNA或特定的DNA片断。
其次，准备电泳和转移材料，例如琼脂糖凝胶、缓冲液和膜。
第二部分：DNA电泳1. 准备琼脂糖凝胶：制备琼脂糖溶液，将其煮沸溶解，然后冷却至50-60摄氏度。
将DNA样本混合物加入琼脂糖凝胶孔中。
2. 电泳操作：将琼脂糖凝胶平放在电泳槽中，然后将电泳缓冲液倒入槽中，直到液面完全覆盖凝胶。
添加DNA分子量标准在凝胶的一侧，以便测量目标DNA 片断的尺寸。
3. 进行电泳：将电泳槽接入电源，将电流设定为适当的电压和时间，使DNA 片断按照大小进行分离。
一般情况下，较小的片断迁移得更远。
第三部分：DNA转移1. 准备转移堆栈：准备一个转移堆栈，它由棉花垫、滤纸和膜组成。
在膜上放置一层滤纸。
2. 加盖堆栈：在琼脂糖凝胶上方放置转移堆栈，然后加上配重来确保平坦和稳定。
3. 转移：连接电泳槽和堆栈，并将电流通过凝胶和膜，使DNA转移到膜上。
这个过程可以持续几个小时甚至一夜。
第四部分：DNA固定和探针杂交1. 固定DNA：将转移后的膜浸泡在碱性溶液中，如NaOH，以使DNA固定在膜上。
2. 探针制备：制备与目标DNA序列互补的DNA探针。
探针可以由放射性同位素标记（如32P）或非放射性标记（如生物素或荧光标记）。
3. 探针杂交：将探针与膜一起孵育，使其与目标DNA序列特异性结合。
探针将与膜上的相应DNA序列形成互补配对。
第五部分：探针探测和可视化1. 探针探测：根据探针标记的类型，选择适当的方法来探测已杂交的探针。
southern blotting实验步骤及试剂配制 southern blotting protocol
or
Total volume 25 l
-Buffer, BSA, and enzyme can be combined in a master mix, and 4.3 ul pipetted into genomic DNA for large sample sets. -Digest 4 hours at 37C in thermocycler -Deactivate with appropriate heat and time in thermocycler and hold at 12 ˚C. Gel Electrophoresis Separation: -Run Digests on a 1% agarose, 1X TAE gel at 50V for 4hrs or 20V overnight. DO NOT use EtBr in the gel. -Add 5ul of EZ vision loading buffer (Amresco) to total reaction volume and load total reaction on gel. -Can load up to 44 samples (24-well combs) or 36 samples (20-well combs) per 12X14 gel*. -Markers**: 1l DIG-labelled Marker II and/or III (Roche), 1:50 dilution in TE buffer. 6ul EZ vision loading buffer (Amresco)
SOUTHERN BLOT PROTOCOL (continued) Preparation of Non-radioactive DIG-labelled probe: 1. Creating the Probe: a. PCR-amplify the (1) probe, (2) non-labeled control fragment, and (3) H2O neg. control using the primers, template, PCR Master Mix recipe, and thermal-cycling parameters that have been optimized for the target with the following exception for the PROBE REACTION ONLY: i. Change the dNTPs to DIG-labelled dNTPs (5 ul/50 ul rxn) and make the appropriate reduction in H2O in the reaction recipe. ii. When PCR is complete, DO NOT add loading dye to entire rxn! b. Take 5 ul samples of each reaction, add loading dye and run on a 1.5% agarose gel with 100bp ladder. (Try to run longer than usual to see the size shift in the DIG-labelled product). c. Take a picture and save in notebook. d. If you have a non-specifically amplified product, it can be removed by running the entire DIG-labelled reaction on a gel, excising the desired product and purifying from the gel using the kit described in the next step. 2. Clean up the probe with the NucleoSpin PCR Clean Up Kit according to the manufacturer’s instructions. (Input 40ul of DIG-labelled PCR product, and elute with 30ul of NE buffer) Non-radioactive DIG Hybridization: 1. Pre-Hybridize a. Pour DIG Easy Hyb into the hybridization tubes (7 mL for Short tubes, 15 mL for Long tubes) with the membrane you want to probe. Cap tightly and balance tubes as necessary in the oven and set temperature to 43 C. Rotate on speed 7 for at least 1 hour. 2. Hybridization: (For one Hyb tube, double as needed) a. Thaw 20 mg/ml of sheared salmon sperm, kept in -20 OC. b. For short tubes: Add 0.5 l salmon sperm and 0.5 l probe to 50 l of sterile water per blot and heat shock in TC (100ºC for 5m, then 4ºC for 5m). The volume of probe added is variable: if using a new probe, use between 0.5-2 ul, based on band intensity on gel and length of probe. c. For long tubes: Add 1 l salmon sperm and 1l probe to 50 l of sterile water per blot and heat shock in TC (100ºC for 5m, then 4ºC for 5m). See above note on probe volume. d. Spin down probe mixture and add to 7mL/15 mL of DIG Easy Hyb (for one membrane) at room temperature. Vortex to mix. e. Pour off pre-hybridization solution, and add hybridization solution with probe and salmon sperm to hybridization tube. Cap tightly and rotate on speed 7 at 43C overnight. Try not to probe more than 18 hours.
生物化学实验southwestern blotting实验步骤 -回复
生物化学实验southwestern blotting实验步骤-回复生物化学实验：southwestern blotting实验步骤南方杂交（southwestern blotting）是一种用于检测DNA结合蛋白的实验技术。
在这项实验中，我们可以确定哪些蛋白与DNA结合，进而揭示它们在基因调控和细胞功能方面的作用。
下面将详细介绍southwestern blotting实验的步骤。
步骤一：制备RNA和DNA探针在进行southernwestern blotting实验之前，首先需要制备两个探针：一个用于检测特定DNA序列的DNA探针，另一个用于检测DNA结合蛋白的RNA探针。
DNA探针可以通过PCR扩增特定的DNA片段，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。
RNA探针则需要用逆转录酶将RNA反转录成cDNA，然后用荧光标记的核苷酸或放射性同位素标记的核苷酸标记。
步骤二：制备细胞核提取物1. 收集细胞：收集含有目标蛋白的细胞样品。
可以根据需要使用贴壁培养的细胞或悬浮培养的细胞。
2. 细胞裂解：将细胞悬液离心后，将细胞沉淀洗涤一次，然后用细胞裂解液裂解。
细胞裂解液可以根据实验要求自制，也可以购买商业提供的细胞裂解液。
3. 离心：将细胞裂解液离心，将上清转移至新离心管中。
4. 蛋白浓度检测：使用BCA或其他蛋白浓度检测试剂盒对离心上清中的蛋白质进行定量。
步骤三：SDS-PAGE凝胶电泳分离1. 准备SDS-PAGE凝胶：根据需要制备聚丙烯酰胺凝胶。
根据样品量的不同，选择不同的均聚丙烯酰胺百分比凝胶。
2. 添加样品和分子量标记物：向凝胶槽中加载约10-50微克的蛋白样品，并加入适当的分子量标记物。
3. 开始电泳：将凝胶槽放入电泳槽中，并加入足够的电泳缓冲液。
启动电泳仪，并根据需要调整电压和电流。
4. 疏水处理：电泳结束后，将凝胶浸入缓冲液中，使凝胶疏水。
步骤四：转移蛋白到NC膜1. 混合转移缓冲液：根据实验需要制备转移缓冲液。
Southern Blot原理及实验方法
Southern Blot原理及实验方法原理：将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
试剂和器材一、试剂变性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。
中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.0)，1.5mol/L NaCl。
20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 柠檬酸钠。
以上溶液均在100Kpa灭菌20分钟。
2×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加无菌水45mL。
6×SSC：用无菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加无菌水75mL。
二、器材22cm×15cm瓷盘操作方法1. 在琼脂糖凝胶上电泳分离DNA。
取出凝胶，切去边缘多于部分，EB染色，在紫外灯下照相（放一标尺，可从像片中读出DNA迁移的距离）。
2. 将凝胶置于200mL变性液中，浸泡45分钟，并温和地不断振荡，使凝胶上的ds-DNA转变为ss-DNA，然后用重蒸水冲洗凝胶几次。
3. 用中和液浸泡凝胶并不断地振荡45分钟，将凝胶中和至中性。
防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维膜。
4. 取一个瓷盘，在底部放一块玻璃板（或一块海绵）使盛器内的20倍SSC转移滤液低于玻板表面，在玻板表面盖一张3mm的二号滤纸，滤纸两边浸没于20倍SSC溶液中，在玻璃和滤纸之间，赶掉所有的气泡。
5. 把凝胶底面朝上放在滤纸上，赶走两层之间出现的气泡。
6. 裁剪一张硝酸纤维膜，其长与宽大于凝胶1—2mm，并在角上作记号，以确定滤膜方位。
southern blot原理
southern blot原理
Southern Blotting 原理
Southern blotting 技术是由 Edwin M. Southern 在 1976 以
一种简单而有效的方法提出的，用于支持DNA含量的分析。
它最常被用于鉴定由多种DNA碱基构成的特定序列，以及鉴定和检测特定DNA 序列的存在、比较、分析及其分布。
它通过将DNA模板分离出来，再将DNA模板用聚合酶链反应(PCR)扩增以获得足够多的DNA模板，最后将经过扩增的DNA模板遇到一种特殊的处理，以使它与一张特殊的膜片或者膜片上的特定序列结合。
Southern blotting 包括以下几个步骤：1). 将DNA样本用双链酶将双链DNA分割成小的片段；2). 将分离出来的小DNA片段用一种特殊的方法分子印迹(molecular blotting)到一张特殊的膜片上；3). 将特定的标记物(比如特定的核酸或抗体)与经过分子印迹的DNA片
段结合；4). 将结合物暴露在感光材料上，从而将其结果显示出来。
Southern blotting 技术可以用于检测DNA片段的量、品种、分布、多样性及数量。
这种技术具有准确性高、特异性好、操作简单、检测效率高的优势。
Southern blotting 技术可以用于：1). 鉴定特定的DNA序列；
2). 鉴定DNA片段的长度；3). 检测突变；4). 检测某种重组；5). 筛选特定基因序列；6). 检测融合基因；7). 研究基因组学；8). 检测特定的核酸，如RNA、miRNA、siRNA等。
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southern bloting
Southern blot实验方法与步骤用于检测重组DNA，也可分析DNA样品中是否有与探针序列同源的DNA片段。
用于基因诊断，也可验证检测片段的分子量大小。
将基因组DNA经限制性内切酶酶切，进行琼脂糖电泳，把分离后定位在凝胶上的不同分子量的DNA经碱变性处理，将凝胶中变性的DNA 转移至一固相支持滤膜。
利用标记的某一DNA、RNA或寡核苷酸与固着于滤膜上的DNA 发生同源性杂交，利用放射自显影（化学发光法或显色法）检测。
（一）器材：台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪，水平电泳槽，杂交炉，杂交袋，尼龙膜或硝酸纤维素膜，转印迹装置，滤纸，吸水纸，紫外交联仪或80℃烤箱，摇床，X线胶片。
（二）试剂：限制性内切酶，DNA加样缓冲液，DNA Ladder Marker，0.25M HCl，变性液（0.5M NaOH，1.5M NaCl），中和液（0.5M Tris- HCl PH7.5，3M NaCl）, 转印迹液20╳SSC（3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，PH7.0），标记探针，2╳SSC，预杂交液和杂交液，2×洗液（2×SSC,0.1%SDS）,0.5×洗液(0.5×SSC,0.1%SDS),1×缓冲洗液（0.1M马来酸，0.15M NaCl ,PH7.5,0.3%Tween20）,1×封阻液[1％(W/V)封阻剂溶于1×马来酸溶液（0.1M 马来酸，0.15M NaCl ,PH7.5）]，1×检测液（0.1M Tris- HCl,0.1M NaCl,PH7.5），抗－地高辛－碱性磷酸酶。
（三）步骤：1、酶切（以单一酶为例）设置反应体系（反应体系30μl）ddH2O 5μl 基因组DNA（0.5μg/μl）2μl短暂离心，消除离心管内气泡，于37℃消化过夜注意：若基因组DNA过低，要以较大体积进行限制酶消化，消化完毕后，可以通过乙醇沉淀、浓缩DNA片段，加少量DNA加样缓冲液点样。
southern blotting 确定拷贝数原理
southern blotting确定拷贝数原理
Southern blotting是一种分子生物学技术，主要用于检测DNA中特定序列的存在以及确定DNA拷贝数。
以下是Southern blotting确定拷贝数的基本原理：
1.DNA片段分离：首先，将待检测的DNA样本通过酶切等方法进行分离，生成一系列DNA片段。
这些片段的长度和序列将取决于所使用的酶。
2.凝胶电泳：将DNA片段加载到琼脂糖凝胶中，并通过电泳使其在凝胶中移动。
由于DNA片段的不同大小，它们在电场中会按照大小被分离开来，形成一个DNA带谱。
3.转移到膜上：将DNA凝胶上的分离片段转移到一块膜上，通常是硝酸纤维素或硝酸纸。
4.固定DNA到膜上：通过紫外线照射或烘烤等方法，将DNA片段固定在膜上。
5.杂交：将标记有放射性或荧光标记的DNA探针加到膜上。
这个探针是与待检测DNA 特定序列相互匹配的DNA片段。
6.探针与目标DNA杂交：探针与膜上DNA片段中与之互补的序列发生杂交。
这样，可以通过检测探针的位置来确定待检测DNA中特定序列的存在。
7.确定拷贝数：通过观察带谱的强度和数量，可以推断出待检测DNA中特定序列的拷贝数。
如果一个序列在DNA中存在多个拷贝，相应的带谱会更强烈。
总体而言，Southern blotting提供了一种分子水平上检测DNA片段的方法，并且可以用来确定目标序列在基因组中的拷贝数。
sourthern印迹法
sourthern印迹法摘要：一、Southern印迹法的原理二、Southern印迹法的实验步骤三、Southern印迹法的应用领域四、Southern印迹法的优缺点五、我国在Southern印迹法的研究与发展正文：一、Southern印迹法的原理Southern印迹法（Southern blotting）是一种分子生物学技术，主要用于检测DNA分子中的特定序列。
该技术的核心原理是将DNA从凝胶转移到膜上，然后通过与标记的探针进行杂交，从而检测目标DNA序列。
二、Southern印迹法的实验步骤1.制备样品：提取生物组织中的DNA，并进行纯化和定量。
2.电泳分离：将DNA样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，根据分子量分离出不同的DNA片段。
3.转移：将凝胶中的DNA转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。
4.杂交：将膜放入含有标记探针的杂交液中，让探针与目标DNA序列结合。
5.洗涤：去除未结合的探针，洗涤膜以消除非特异性信号。
6.检测：使用放射性自显影或化学发光法检测杂交信号，分析结果。
三、Southern印迹法的应用领域Southern印迹法广泛应用于基因mapping、基因突变检测、基因表达分析和病原体检测等领域。
在基因研究中，它可以确定基因的位置、大小和数量；在医学领域，可用于检测肿瘤基因、病原体基因等。
四、Southern印迹法的优缺点优点：具有较高的灵敏度和特异性，可以检测到微量的目标DNA序列。
缺点：实验操作复杂，耗时较长，对实验环境要求较高，且存在放射性污染风险。
五、我国在Southern印迹法的研究与发展我国科研人员在Southern印迹法的研究方面取得了丰硕的成果，不仅在基础研究中有广泛应用，还将其应用于农业、医学等领域。
为降低放射性污染，我国科研人员还研发了非放射性Southern印迹法，如化学发光法等。
在未来，我国将继续加大对Southern印迹法的研究力度，推动分子生物学技术的发展。
【结束语】通过本文的介绍，我们对Southern印迹法有了更深入的了解。
southern blotting原理和步骤
southern blotting原理和步骤嘿，咱今儿个就来唠唠 southern blotting 这档子事儿哈！你说 southern blotting 呀，那就像是一场分子世界里的奇妙探险！想象一下，我们就像一群好奇的探险家，要在那茫茫的分子海洋里找到我们想要的宝贝。
它的原理呢，其实挺有意思的。
简单来说，就是利用核酸分子杂交的特性，来检测特定的 DNA 片段。
就好像我们有一把专门的钥匙，能打开特定的那扇门。
这钥匙就是我们设计的探针，而那扇门就是我们要找的目标 DNA 呀！接下来讲讲步骤，这可真是个精细活儿！首先得把我们要研究的DNA 从细胞里提取出来，这就好比从一个大宝藏里把宝贝给挖出来。
然后呢，用限制性内切酶把这 DNA 切成一段段的，哎呀，这就像把一个大拼图给拆开了。
再之后，把这些切好的 DNA 片段通过电泳的方式，让它们在凝胶里排好队，这就像是让一群小朋友按高矮个站好一样。
接着，把这些排好队的 DNA 从凝胶里转移到膜上，这一步可关键啦，就像把宝贝从一个地方小心翼翼地搬到另一个地方。
然后呢，就是让我们的探针上场啦！这探针就像个机灵的小侦探，专门去寻找它的目标。
把膜和探针放在一起，让它们相互作用，就像两个好朋友见面聊天一样。
最后呀，通过一些检测手段，我们就能知道探针有没有找到它的目标啦！如果找到了，那就大功告成啦！你说这 southern blotting 是不是很神奇？它就像是在分子世界里搭建了一座桥，让我们能从茫茫的分子中找到我们想要的那一部分。
你想想，要是没有 southern blotting，我们怎么能这么准确地找到特定的 DNA 呢？它可是为我们打开了一扇了解基因的大门啊！所以说呀， southern blotting 虽然步骤有点多，有点复杂，但它的用处可大着呢！它就像一把神奇的钥匙，能帮我们解开很多基因的秘密。
咱可得好好记住 southern blotting 的原理和步骤，说不定啥时候就能派上大用场呢！是不是很有意思呀？哈哈！。
Southern_blot实验方法与步骤
实验名称： Southern blot一、实验目的1．学习核酸杂交的基本过程和操作。
二、实验原理将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。
如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。
用途：检测样品中的DNA及其含量，了解基因的状态, 如是否有点突变、扩增重排等。
三、试剂与仪器（一）器材：糖瓷盘，台式离心机，恒温水浴锅，电泳仪，水平电泳槽，杂交炉，杂交袋，尼龙膜或硝酸纤维素膜，转印迹装置，滤纸，吸水纸，紫外交联仪，摇床，X线胶片。
（二）试剂：限制性内切酶，DNA加样缓冲液，DNA Ladder Marker，0.25M HCl变性液（0.5M NaOH，1.5M NaCl）中和液（0.5M Tris- HCl PH7.5，3M NaCl）,转印迹液SSC（3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，PH7.0）标记探针，20×SSC，预杂交液和杂交液，2×洗液（2×SSC,0.1%SDS）2×洗液(0.5×SSC,0.1%SDS)1×缓冲洗液（0.1M马来酸0.15M NaCl ,PH7.5,0.3%Tween20）1×封阻液[1％(W/V)封阻剂溶于]1×马来酸溶液（0.1M马来酸，0.15M NaCl ,PH7.51×检测液（0.1M Tris- HCl,0.1M NaCl,PH7.5）抗－地高辛－碱性磷酸酶。
四、实验步骤1、制备DNA分子（PCR）2.琼脂糖凝胶电泳分离DNA3电泳结束后，将胶小心从电泳槽中取出，用手术刀将胶中没有DNA样品的四周部分略做修剪，然后将胶放入0.25 N HCl中脱嘌呤，当胶中的溴酚蓝变为黄色取出4将胶从HCl溶液中取出，用ddH2O涮洗两次，然后放入碱变性液（0.5 M NaOH）中处理45 min，使胶中的ds-DNA变为SS-DNA。
Southern-Blotting
Southern Blotting方案8 Southern印迹：毛细管法将DNA转移到膜上DNA的消化及电泳：1. 用一种或几种限制性内切核酸酶消化适当数量的DNA2. 如果需要，消化结束后用乙醇沉淀浓缩DNA片段。
将DNA溶解于约25 ul TE（pH8.0）中。
(加样于凝胶前，需确信DNA溶液中的乙醇已被完全出去。
通常在一个开口的管子里将溶解有DNA的溶液加热至70℃可以充分除去残余的乙醇。
这种处理也破坏了限制性片段的黏性末端直接的碱基对。
)3. 定量DNA浓度。
将适量的消化产物转移到新的微量离心管中。
先取5ul样品，用加有EB的0.7%的胶检测消化程度，如果消化完全，则给样品中加入0.15被体积的蔗糖上样缓冲液，通过琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段（对于大部分基因组DNA，可以使用1×TAE或0.5×TBE配置的0.7的凝胶，不含EB。
）对凝胶加一较低的电压（约小于1V/ cm），使DNA以较慢的速率迁移。
（如果消化后的DNA保存于4℃，在加样前需要加热至56℃2～3min。
这种加热处理可以破坏突出的黏性末端可能形成的任何碱基对。
有时，由于DNA溶液不能沉降到加样孔的底部也会引起问题。
为了减少这种问题，首先要确信DNA分散均匀，然后再将样品缓缓加入点样孔。
加样后，静置凝胶数分钟，以便DNA 在加样孔中充分扩散。
）4. 电泳充分后，进行照相。
在凝胶一侧放置一把透明荧光吃以便从照片上直接读出每一DNA条带迁移的距离。
（如果需要，在进行DNA变性以及转移到膜上之前，凝胶可以在这种状态下保存。
用Saran膜将凝胶包好，平放储存于4℃。
由于在保存过程中DNA条带会扩散，因此在进行下一步实验之前，不要将凝胶放置超过一天。
）5. DNA变性，使用下列方法之一将DNA从凝胶上转移到NC膜或者中性或带电荷的尼龙膜上。
准备用于转移的凝胶：6. 电泳分离DNA之后，将凝胶转移到玻璃烤盘中。
用剃须刀片修去凝胶边缘无用的部分，包括加样孔上方的凝胶。
southern印迹杂交实验报告
southern印迹杂交实验报告Southern 印迹杂交实验报告一、实验目的Southern 印迹杂交（Southern blotting）是进行基因组 DNA 特定序列定位的通用方法。
本次实验的主要目的是通过 Southern 印迹杂交技术检测特定基因在基因组中的存在和拷贝数，掌握该技术的基本原理和操作流程。
二、实验原理Southern 印迹杂交是将电泳分离的 DNA 片段从凝胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，然后与标记的探针进行杂交，通过检测杂交信号来确定与探针互补的 DNA 片段的位置和大小。
其基本原理包括：DNA 的变性与复性、分子杂交以及检测技术。
DNA 变性是指在加热或碱性条件下，双链 DNA 解链成为单链。
电泳分离后的 DNA 片段在转移前需要进行变性处理，使其成为单链，以便更好地与探针结合。
分子杂交是指具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下按碱基配对原则形成双链的过程。
标记的探针与膜上的 DNA 单链进行杂交，形成杂交体。
检测技术通常使用放射性同位素或非放射性标记物（如地高辛、荧光素等）标记探针，通过放射自显影、化学发光或荧光检测等方法显示杂交信号。
三、实验材料与仪器1、材料基因组 DNA 样品限制性内切酶琼脂糖电泳缓冲液硝酸纤维素膜或尼龙膜标记的探针杂交液2、仪器电泳仪水平电泳槽紫外透射仪真空转移装置或毛细管转移装置杂交炉放射性检测仪或化学发光检测仪四、实验步骤1、 DNA 提取与定量使用适当的方法从细胞或组织中提取基因组 DNA，并通过分光光度计或琼脂糖凝胶电泳对其进行定量和质量检测。
2、限制性内切酶消化将一定量的基因组 DNA 与适量的限制性内切酶在适宜的反应条件下进行消化，使 DNA 片段化。
3、琼脂糖凝胶电泳制备琼脂糖凝胶，将消化后的 DNA 样品进行电泳分离。
电泳结束后，在紫外灯下观察并拍照记录电泳结果。
4、 DNA 变性与转移将凝胶浸泡在变性液中使 DNA 变性。
采用真空转移或毛细管转移等方法将 DNA 从凝胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。
Southern blotting 杂交秘籍
杂交膜的选择
1. NC 膜 2. 尼龙膜 注意PH范围来自CTAB 法提取DNA
（1）取材料，加液氮研磨成粉末状，迅速移入1.5 ml Eppendorf管中； 注意：植物样品取大约5 g左右，动物样品0.5 g左右，真菌样品1 g左右。 （2）加入4ml 的CTAB提取缓冲液（注意：样品与CTAB比例为1 g：4 ml），混匀（CTAB在65℃水浴预热），每5min轻轻震荡几次， 20min后, 12000 r/min，离心15 min； （3）小心吸取上清液，加入等体积的酚：氯仿（各400μl）溶液，混匀， 4℃，12000 r/min，离心10 min； （4）小心吸取上清液，加入等体积的氯仿，混匀，4℃，12000 r/min，离心10 min。 （5）重复步骤（4）1-2次，以蛋白层不出现为止； （6）取上清，-20℃沉淀1h，4℃，12000 r/min，离心10 min； （7）弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次； （8）室温下干燥后（一般干燥5-15 min），溶于30-50 μl DEPC去 离子水中，于-20℃或者-70℃下保存备用。
转膜
转膜需要注意： 膜在正极，胶在负极（且胶的底面朝上，原因DNA在电泳时是沉在底 部）。注意：在膜上做标记。凝胶需要用 2 M NaOH缓冲液进行变形处 理（50 rpm 20 min）。 50 mA（稳流）6-8 h
杂交
前处理：将膜置于中和缓冲液中50 rpm，15 min， 然后2XSSC 50 rpm，5 min。 杂交：用10 ml杂交液预热杂交管 30 min，杂交温度（48-53℃ 或 43-46℃ 注意：温度低杂交条带单一且条带细）。然后加入尼龙膜和探 针进行杂交 6-8 h。 探针处理参考说明书或参考视频讲解。
生物化学实验southwestern blotting实验步骤
生物化学实验southwestern blotting
实验步骤
Southwestern blotting 是一种用于检测蛋白质与 DNA 相互作用的技术，以下是该实验的基本步骤：
1. 制备 DNA 探针：选择你感兴趣的 DNA 片段，并使用放射性同位素（通常是 32P）或荧光标记对其进行标记。
2. 制备蛋白质样品：将待检测的蛋白质样品进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，并通过电转移将蛋白质转移到硝酸纤维素膜或 PVDF 膜上。
3. 膜的预处理：将转移后的膜在Blocking buffer 中孵育，以封闭非特异性结合位点。
4. 杂交：将标记的 DNA 探针与膜上的蛋白质进行杂交。
可以在杂交缓冲液中进行，通常在 42°C 下孵育过夜。
5. 洗膜：在杂交后，用 washing buffer 洗涤膜，以去除未结合的 DNA 探针。
6. 检测：使用放射性自显影或荧光检测方法，检测膜上结合的 DNA 探针。
7. 结果分析：通过观察膜上的杂交信号，确定哪些蛋白质与标记的 DNA 探针发生了相互作用。
需要注意的是，Southwestern blotting 实验步骤可能因具体的实验条件和目的而有所不同。
在进行实验之前，建议仔细阅读相关的实验手册和文献，并根据实际情况进行适当的调整和优化。
Southern-Blot-实验流程(包括原理细节)
Southern Blot 实验流程（包括原理/细节）一、DNA 的提取人和哺乳动物细胞基因组DNA的分离通常是在有EDTA、Sarkosye等一类去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚、氯仿抽提，经RNase 处理和纯化来提取DNA。
(1)取单层细胞，经无钙、镁PBS洗一次，用0.25%胰蛋白酶消化，细胞悬液经PBS洗2次,弃上清，取细胞沉淀。
(2)加入2ml细胞裂解液(10mM Tris HCL，pH8.0，0.1mol/L EDTA，10mmol/L NaCL，1% SDS)充分混匀，加入蛋白酶K 至终浓度为0.5～1g/L、Sarkosye终浓度为0.5%，混匀裂解蛋白呈糊状。
(3)50℃水浴2h，转入37℃水浴过夜，次日加入等体积饱和酚，轻轻颠倒混匀，以防止DN A断裂，约3min。
12000r/min 离心15分钟（室温）(4)取水相，再加入等体积酚/氯仿(1:1),同样颠倒混匀，去除蛋白质12000 r/min 离心15分钟（室温）(5)再重复步骤(4)，再用等体积酚/氯仿(1:1)抽提一次(6)取水相，再加入等体积氯仿，去除酚及蛋白质，颠倒混匀12000 r/min 离心15分钟（室温）(7)取水相，加入2倍体积的预冷无水乙醇，沉淀DNA，混匀-20℃放置1小时12000 r/min 离心15分钟（室温）(8)用70%乙醇洗涤一次，按上法离心将沉淀真空干燥10分钟。
(9)加入RNase A至终浓度100mg/L，37℃水浴消化1小时，消化污染的RNA。
(10)加入蛋白酶K 至终浓度0.4g/L、Sarkosye至终浓度0.5%，混匀，50℃水浴2小时，加入NaAC至终浓度10mmol/L。
(11)用等体积饱和酚各抽提一次，步骤同前。
(12)吸上清，加入氯仿/异戊醇(24:1)，按上法再抽一次。
(13)取水相，加入2倍体积预冷无水乙醇，-20℃1小时。
(14)取沉淀用70%乙醇洗一次，真空干燥10分钟后溶于少量TE中，4℃贮存。
Southernblotting实验方法
Southernblotting实验⽅法Southern 杂交的实验⽅法Southern 杂交是分⼦⽣物学的经典实验⽅法。
其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进⾏杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显⽰出杂交信号。
通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的⽚段以及该⽚段的长度。
该项技术⼴泛被应⽤在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。
但由于该技术的操作⽐较烦琐、费时，所以现在有⼀些其他的⽅法可以代替Southern 杂交。
但该技术也有它的独特之处，是⽬前其他⽅法所不能替代的，如限制性酶切⽚段的多态性(RFLP)的检测等。
⼀、基因组DNA的制备（前述）⼆、基因组DNA的限制酶切根据实验⽬的决定酶切DNA的量。
⼀般Southern杂交每⼀个电泳通道需要10-30µg的DNA。
购买的限制性内切酶都附有相对应的10倍浓度缓冲液，并可从该公司的产品⽬录上查到最佳消化温度。
为保证消化完全，⼀般⽤2-4U的酶消化1µg 的DNA。
消化的DNA浓度不宜太⾼，以0.5µg /µl 为好。
由于内切酶是保存在50%⽢油内的，⽽酶只有在⽢油浓度<5%的条件下才能发挥正常作⽤，所以加⼊反应体系的酶体积不能超过1/10。
具体操作如下：在1.5ml离⼼管中依次加⼊DNA（1µg /µl） 20 µg10×酶切buffer 4.0 µl限制性内切酶（10U/µl） 5.0 µl加ddH2O ⾄ 500 µl在最适温度下消化1-3hr。
消化结束时可取5µl电泳检测消化效果。
如果消化效果不好，可以延长消化时间，但超过6hr已没有必要。
或者放⼤反应体积，或者补充酶再消化。
如仍不能奏效，可能的原因是DNA样品中有太多的杂质，或酶的活⼒下降。
southernblotting步骤概括
Southern blotting是一种分子生物学技术，用于检测特定DNA序列在样本中的存在和数量。
下面是Southern blotting的步骤概括：
1. DNA提取：从样本中提取DNA，通常使用酚/氯仿/异戊醇法或柱层析法等方法。
2. DNA纯化：将提取的DNA进行纯化，去除杂质和其他分子。
3. DNA片段化：将纯化的DNA片段化成一定大小的片段，通常使用限制性内切酶(如EcoRI、BamHI等)进行切割。
4. DNA电泳：将片段化的DNA进行电泳分离，使其按照大小排列在凝胶中。
5. 凝胶转移：将凝胶中的DNA转移到膜上，通常使用半干式转移法或湿式转移法等方法。
6. 探针标记：将特异性探针与膜上的DNA结合，通常使用放射性同位素或荧光标记等方法。
7. 杂交：将标记好的探针与膜上的DNA进行杂交，使其形成双链结构。
8. 洗涤：去除未结合的探针和其他杂质。
9. 检测：使用放射自显影或荧光显微镜等方法检测杂交信号，确定目标DNA的存在和数量。
生物化学实验southwestern blotting实验步骤 -回复
生物化学实验southwestern blotting实验步骤-回复Southwestern blotting是一种生物化学实验技术，用于检测和确定在特定生物样品中的DNA结合蛋白质。
这项技术结合了Southern blotting 和Western blotting两种方法，在实验中使用了蛋白质和DNA结合的特性。
下面将逐步介绍这个实验的步骤。
第一步：制备样品和试剂首先，需要准备需要检测的生物样品，可以是细胞培养物、组织样本或纯化的蛋白质。
同时，还需要准备一系列试剂，包括缓冲液、酶、特异性探针和适当的抗体。
第二步：制备DNA探针DNA探针是用于检测特定的DNA序列的一种标记化DNA片段。
制备DNA探针的第一步是通过PCR扩增目标DNA序列。
在PCR反应中，选择特异性引物，使其与目标DNA序列互补。
然后，在PCR反应中加入dNTPs（脱氧核苷酸三磷酸盐）、DNA聚合酶和缓冲液，进行多次的循环反应，以扩增目标DNA序列。
最后，通过各种纯化技术（如凝胶电泳和柱层析）从PCR反应混合物中纯化出DNA探针。
第三步：制备核酸和蛋白质混合物接下来，在准备样品中加入适当数量的DNA探针和蛋白质提取剂。
该提取剂将从样品中提取出核酸和蛋白质，以备后续的电泳和转印。
第四步：电泳分离和转移将核酸和蛋白质混合物分别加载到不同的凝胶槽中。
然后，进行电泳分离，将核酸分离到一个凝胶中，将蛋白质分离到另一个凝胶中。
经过一段时间的电泳分离后，核酸和蛋白质在凝胶中形成明确的带状和斑点。
接下来的步骤是将核酸和蛋白质从凝胶转移到固定膜上。
这个步骤被称为电转印。
它通常使用半湿式电转印系统，其中凝胶和固定膜在电场中进行转移。
经过一段时间后，核酸和蛋白质都会迁移到固定膜上。
第五步：固定和杂交将固定在膜上的核酸和蛋白质用适当的试剂进行固定，通常使用甲醛或紫外线进行固定。
然后，用特异性探针与固定膜上的核酸进行杂交。
探针是标记有放射性荧光或酶的DNA片段，在杂交过程中与目标DNA结合。
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Southern 杂交的实验方法
Southern 杂交是分子生物学的经典实验方法。
其基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。
通过Southern杂交可以判断被检测的DNA样品中是否有与探针同源的片段以及该片段的长度。
该项技术广泛被应用在遗传病检测、DNA指纹分析和PCR产物判断等研究中。
但由于该技术的操作比较烦琐、费时，所以现在有一些其他的方法可以代替Southern 杂交。
但该技术也有它的独特之处，是目前其他方法所不能替代的，如限制性酶切片段的多态性(RFLP)的检测等。
一、基因组DNA的制备（前述）
二、基因组DNA的限制酶切
根据实验目的决定酶切DNA的量。
一般Southern杂交每一个电泳通道需要10-30μg的DNA。
购买的限制性内切酶都附有相对应的10倍浓度缓冲液，并可从该公司的产品目录上查到最佳消化温度。
为保证消化完全，一般用2-4U的酶消化1μg 的DNA。
消化的DNA浓度不宜太高，以0.5μg /μl 为好。
由于内切酶是保存在50%甘油内的，而酶只有在甘油浓度<5%的条件下才能发挥正常作用，所以加入反应体系的酶体积不能超过1/10。
具体操作如下：在1.5ml离心管中依次加入
DNA（1μg /μl） 20 μg
10×酶切buffer 4.0 μl
限制性内切酶（10U/μl） 5.0 μl
加ddH2O 至 500 μl
在最适温度下消化1-3hr。
消化结束时可取5μl电泳检测消化效果。
如果消化效果不好，可以延长消化时间，但超过6hr已没有必要。
或者放大反应体积，或者补充酶再消化。
如仍不能奏效，可能的原因是DNA样品中有太多的杂质，或酶的活力下降。
消化后的DNA加入1/10 体积的0.5M EDTA，以终止消化。
然后用等体积酚抽提、等体积氯仿抽提，2.5倍体积乙醇沉淀，少量TE溶解（参见DNA提取方法，但离心转速要提高到12000g，以防止小片段DNA的丢失）。
如果需要两种酶消化DNA，而两种酶的反应条件可以一致，则两种酶可同时进行消化；如果反应条件不一致，则先用需要低离子强度的酶消化，然后补加盐类等物质调高反应体系的离子强度，再加第二种酶进行消化。
三、基因组DNA消化产物的琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖凝胶电泳是目前分离核酸片段最常用的方法，制备简单，分离范围广（200bp-50kb），实验成本低。
下表列举了不同浓度琼脂糖凝胶能分离的DNA片段范围。
表：不同浓度琼脂糖凝胶分离DNA片段的范围
1. 制备0.8%凝胶：一般用于Southern杂交的电泳胶取0.8%。
2.电泳：电泳样品中加入6×Loading 缓冲液，混匀后上样，留一或两泳道加DNA Marker。
1-2V/cm，DNA从负极泳向正极。
电泳至溴酚蓝指示剂接近凝胶另一端时，停止电泳。
取出凝胶，紫外灯下观察电泳效果。
在胶的一边放置一把刻度尺，拍摄照片。
正常电泳图谱呈现一连续的涂抹带，照片摄入刻度尺是为了以后判断信号带的位置，以确定被杂交的DNA长度。
四、DNA从琼脂糖凝胶转移到固相支持物
转移就是将琼脂糖凝胶中的DNA 转移到硝酸纤维膜（NC膜）或尼龙膜上，形成固相DNA。
转移的目的是使固相DNA与液相的探针进行杂交。
常用的转移方法有盐桥法、真空法和电转移法。
这里介绍经典的盐桥法（又称为毛细管法）。
（一）试剂准备
１．变性液：0.5M NaOH；1.5 M NaCl。
２．中和液：1M Tris-HCl(pH 7.4)；1.5M NaCl;
３．转移液（20×SSC）： NaCl 175.3g; 柠檬酸三钠82.2g，NaOH 调pH 至7.0，加ddH2O至1000ml。
（二）操作步骤
1.碱变性:室温下将凝胶浸入数倍体积的变性液中30min。
2.中和:将凝胶转移到中和液15min。
3．转移按凝胶的大小剪裁NC膜或尼龙膜并剪去一角作为标记，水浸湿后，浸入转移液中5min。
剪一张比膜稍宽的长条Whatman 3mm
滤纸作为盐桥，再按凝胶的尺寸剪3-5张滤纸和大量的纸巾备用。
按下图所示进行转移。
（转移过程一般需要8-24hr，每隔数hr换掉已经湿掉的纸巾。
转移液用20×SSC。
注意在膜与胶之间不能有气泡。
整个操作过程中要防止膜上沾染其他污物。
）
4. 转移结束后取出NC膜，浸入6×SSC溶液数min，洗去膜上沾染的凝胶颗粒，置于两张滤纸之间，80 C烘2hr，然后将NC膜夹在两层滤纸间，保存于干燥处。
五、探针标记
进行Southern 杂交的探针一般用放射性物质标记或用地高辛标记。
放射性标记灵敏度高，效果好；地高辛标记没有半衰期，安全性好。
这里介绍放射性标记。
探针的标记方法有随机引物法、切口平移法和末端标记法，有一
些试剂盒可供选择，操作也很简单。
以下为Promega公司随机引物试剂盒提供的标记步骤：
1．取25-50ng模板DNA于0.5ml离心管中，100℃变性5min，立即置冰浴。
2．在另一个0.5ml离心管中加入：
Labeling 5×buffer 10μl
（含有随机引物）
dNTPmix 2μl
(含 dCTP、dGTP、dTTP 各 0.5mM)
BSA（小牛血清白蛋白） 2μl
[α-32P]dATP 3μl
Klenow酶 5U
3．将变性模板DNA加入到上管中，加ddH2O至50μl，混匀。
室温或37℃ 1hr。
4．加50μl 终止缓冲液终止反应。
标记后的探针可以直接使用或过柱纯化后使用。
由于α-32P的半衰期只有14天，所以标记好的探针应尽快使用。
探针的比活性最好大于109计数/分/μl。
六、杂交
Southern 杂交一般采取的是液-固杂交方式，即探针为液相，被杂交DNA为固相。
杂交发生于一定条件的溶液（杂交液）中并需要一定的温度，可以用杂交瓶或杂交袋并使液体不断的在膜上流动。
杂交
液可以自制或从公司购买，不同的杂交液配方相差较大，杂交温度也不同。
下面给出的为一杂交液配方：
PEG 6000 10%；SDS 0.5%；6×SSC；50%甲酰胺。
该杂交液的杂交温度为42℃。
1．预杂交
NC膜浸入2×SSC中5min，在杂交瓶中加入杂交液（8cm×8 cm的膜加5ml即可），将膜的背面贴紧杂交瓶壁，正面朝向杂交液。
放入42℃杂交炉中，使杂交体系升到42℃。
取经超声粉碎的鲑鱼精DNA （已溶解在水或TE中）100℃加热变性5min，迅速加到杂交瓶中，使其浓度达到100μg/ml。
继续杂交4hr。
鲑鱼精DNA的作用是封闭NC膜上没有DNA转移的位点，降低杂交背景、提高杂交特异性。
2．杂交
倒出预杂交的杂交液，换入等量新的已升温至42℃的杂交液，同样加入变性的鲑鱼精DNA。
将探针100℃加热5min，使其变性，迅速加到杂交瓶中。
42℃杂交过夜。
七、洗膜与检测
取出NC膜，在2×SSC溶液中漂洗5min，然后按照下列条件洗膜： 2×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
1×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
0.5×SSC/0.1% SDS，42℃，10min；
0.2×SSC/0.1% SDS，56℃，10min；
0.1×SSC/0.1% SDS，56℃，10min。
在洗膜的过程中，不断振摇，不断用放射性检测仪探测膜上的放射强度。
实践证明，当放射强度指示数值较环境背景高1-2倍时，是洗膜的终止点。
上述洗膜过程无论在哪一步达到终点，都必须停止洗膜。
洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用滤纸吸干膜表面的水份，并用保鲜膜包裹，注意保鲜膜与NC膜之间不能有气泡。
将膜正面向上，放入暗盒中（加双侧增感屏），在暗室的红光下，贴覆两张X光片，每一片都用透明胶带固定，合上暗盒，置-70℃低温冰箱中曝光。
根据信号强弱决定曝光时间，一般在1-3天时间。
洗片时，先洗一张X光片，若感光偏弱，则再多加两天曝光时间，再洗第二张片子。
影响Southern杂交实验的因素很多，主要有：DNA纯度、酶切效率、电泳分离效果、转移效率、探针比活性和洗膜终止点等。
七、注意事项
1.要取得好的转移和杂交效果，应根据DNA 分子的大小，适当调整变性时间。
对于分子量较大的DNA片段（大于15kb），可在变性前用0.2M HCl预处理10min使其脱嘌呤。
2.转移用的NC膜要预先在双蒸水中浸泡使其湿透，否则会影响转膜效果；不可用手触摸NC膜，否则影响DNA的转移及与膜的结合。
3.转移时，凝胶的四周用Parafilm蜡膜封严，防止在转移过程中产生短路，影响转移效率，同时注意NC膜与凝胶及滤纸间不能留有气泡，以免影响转移。
4.注意同位素的安全使用。