限制性内切酶第二章1Jun

限制酶裂解DNA 双链的磷酸二酯 键
酶切得到5`-P和 3`-OH
第一节 限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割
一、限制性内切酶的发现 二、限制性内切酶的定义 三、限制性内切酶的命名 四、限制性内切酶的分类 五、II型限制内切酶的基本特性 六、影响酶活性的因素 七、限制内切酶的用途
三、限制性核酸内切酶的命名
切割频率理论上为 1/4n（n为识别序列长度），实际上 与序列有关。
MboI NGATCN；AvaII GG(A/T)CC BamHI GGATCC：PpuMI PuGG(A/T)CCPy Not I GCGGCCGC； SfiI GGCC N N N N N GGCC
CCGGN’N’N’N’N’CCGG Fok I 5’-ＧＧＡＴＧ(Ｎ)9-3’
b)但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。 c)一些酶识别连续的序列(如EcoRI识别GAATTC) d)而另一些识别不连续的序列(如BglI识别GCCNNNNNGGC)
B. IIS型酶
• 另一种比较常见的酶是所谓的IIS型酶，比如 FokI和AlwI，它们在识别位点之外切开DNA。 这些酶的大小居中，约为400-650个氨基酸左 右；它们识别连续的非对称序列，有一个结 合识别位点的域和一个专门切割DNA的功能 域。一般认为这些酶主要以单体的形式结合 到DNA上，但与临近的酶结合成二聚体，协 同切开DNA链。因此一些IIS型的酶在切割有 多个识别位点的DNA分子时，活性可能更高。
（2）平末端（Blunt end） 在回文对称轴上同时切割 DNA 的两条链，则
产生平末端。
如 Hae Ⅲ（GG↓CC）和 EcoR V（GAT↓ATC）
粘性末端的意义
连接方便 不同的DNA双链：只要粘性末端碱基互补
就可以连接。这比连接两个平齐末端容 易的多。 同一个DNA分子内连接：通过两个相同的 粘性末端可以连接成环形分子。
a. 识别位点与酶切位点高度一 致，具有高度特异性
b. 极为稳定 c. 辅酶: Mg 2+
五、II型限制性核酸内切酶的基本特性
3、识别序列 （1）限制酶识别序列的长度
限制性内切酶在双链DNA上能够识别的特殊核苷酸序列 被称为识别序列。识别序列的长度一般为 4～8 个碱基，最 常见的为 6 个碱基。
四、限制性核酸内切酶的分类及主要特征
性质
酶Ⅰ
酶Ⅱ
酶Ⅲ
结构与功能 三亚基多功能酶
单一功能的酶
同型二聚体
限制与修饰 酶蛋白同时具有甲 酶蛋白不具有甲基
基化作用
化作用
限制作用的 ATP,Mg2+,SAM
Mg2+
辅助因子 （S-腺苷甲硫氨酸）
寄主特异性 位点序列
特异性, 非对称序列
特异性, 旋转对称序列
切割位点 在距寄主特异性位 位于寄主特异性位
（5）限制酶切后产生两个末端，末 端结构是５’-Ｐ和３’-ＯＨ
五、II型限制性核酸内切酶的基本特性 4．末端种类(切割方式)
（1）5’-黏性末端和3’-黏性末端（cohesive end） 识别位点为回文对称结构的序列经限制酶切
割后，产生的末端为黏性末端，这样形成的两个 末端是相同的，也是互补的。
3’-ＣＣＴＡＣ(Ｎ)13-5’ 外侧，产生５’-端突起
（2）富含GC （3）限制酶识别序列的结构
►限制酶识别序列大多具有回文对称结构
EcoRI 5’-G A A T T C-3’
3’-C T T A A G-5’
►有些限制酶的识别序列不对称
AccBSⅠ C C G ↓ C T C
GGC↑GAG
Ⅱ型酶识别回文序列
细菌自身的DNA可被甲基化酶修饰，从而防止限制性内切酶的识 别和水解。
3. 限制性核酸 内切酶的发现
• Werner Arber于1962-1968年发现限制与修饰体系， 1968年分离得到I型限制酶 EcoB.
• 1970 年，H. Smith 首次从流感嗜血杆菌 （H. influenzae）中发现并分离到II型限制酶 HindⅡ. • 1971年，D. Nathans用HindII绘制了猿猴病毒SV40
在已纯化分类的3000种限制性内切酶中， 已发现了超过250种的特异识别序列。
五、II型限制性核酸内切酶的基本特性 1、根据酶作用特点进行的分类
•根据酶的作用特点，II型限制性内切酶分为3类： A.最普遍的是HhaI、HindIII和NotI这样在识别序列中进行切
割的酶。有以下4种情况：
a)大部分这类酶都以同源二聚体的形式结合到DNA上，因而 识别的是对称序列；
Eco RI：Escherichia coli R
⑤若从一种细菌中分离出几种不同的酶，则根据发现顺序用罗马 数字表示。
Sac I (II)：Streptomyces achromagenes I(Ⅱ)
第一节 限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割
一、限制性内切酶的发现 二、限制性内切酶的定义 三、限制性内切酶的命名 四、限制性内切酶的分类 五、II型限制内切酶的基本特性 六、影响酶活性的因素 七、限制内切酶的用途
五、II型限制性核酸内切酶的基本特性 5.识别位点与切割方式之间的关系
(1).识别不同，切割不同
eg: BamHI
EcoRI
-G GATC C-
- A GATCT-
-C CTAG G-
- T CTAG A-
(2).识别不同，切割产生末端相同(同尾酶)
eg: BamHI
Bg1Ⅱ
- A GATC T
第二章 基因工程中常用的工具酶
基因工程的 基本流程
TOOLS FOR GENE CLONING
SCISSORS: RESTRICTION ENZYMES GLUE: DNA LIGASE
VEHICLE: PLASMID OR VIRAL VECTORS
第二章 基因工程中常用的工具酶
第一节
限制性核酸内切酶与DNA分子的 体外切割
点至少1kb的地方
点或其附近
切割方式
随机切割
特异切割
二亚基双功能的酶
酶蛋白同时具有甲 基化作用
ATP,Mg2+,SAM
特异性, 非对称序列 在距寄主特异性位 点3´端24~26bp处
特异切割
甲基化作用 位点
在DNA克隆中 的用途
寄主特异性的位点 无
寄主特异性的位点 十分有用
寄主特异性的位点 有用
第一节 限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割
侵入细菌体内的外源DNA（非甲基化），能被限制性内切酶识别和 降解，细菌通过这种方式进行自我保护。
2. 细菌的限制—修饰理论
细菌自身的DNA可被甲基化酶修饰， ① Dam甲基化酶 -- 在GATC序列的腺嘌呤N6位引入甲基。 ② Dcm甲基化酶 -- 在CCAGG序列的第2个胞嘧啶C5位引入甲基。
• 这些酶的氨基酸序列各不相同，但其结构组成是一致 的。他们在N端由一个负责切开DNA的功能域，这个 域又与DNA修饰域连接；此外还有一到两个识别特 异序列的功能域构成C端，或以独立的亚基形式存在。 当这些酶与底物结合时，它们或行使限制性内切酶的 功能切开底物，或作为修饰酶将其甲基化。
五、II型限制性核酸内切酶的基本特性 2、II型限制性内切酶的特点
第二节 DNA连接酶和DNA分子的体外连接
第三节 其他工具酶
第一节 限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割
一、限制性内切酶的发现 二、限制性内切酶的定义 三、限制性内切酶的命名 四、限制性内切酶的分类 五、II型限制内切酶的基本特性 六、影响酶活性的因素 七、限制内切酶的用途
一、限制性内切酶的发现和 细菌的限制—修饰作用
►有些限制酶可识别多种序列
AccⅠ G T M K A C
CAKMTG
M = A、C K = G、T
►有些限制酶识别的序列呈间断对称， 对称序列之间含有若干个任意碱基。
AlwNⅠ C A G N N N C T G
GTCNNNGAC
（4）限制酶切割的位置
限制酶对 DNA 的切割位置大 多数在识别序列内部，但也有在 外部的。
E. coli-λ噬菌体的
限制修饰模式
• 噬菌体在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。 • 仍有少量λ(K)可在 E.coli B中生存，是因 E.coli B对λ(K)进行了修饰。
2. 细菌的限制—修饰理论的提出
1959年，瑞士塞尔生物研究中心Arber提出限制一修饰理论： 核酸内切酶降解细菌外源DNA, 修饰酶保护自身DNA
的限制酶谱。 Arber, Smith和Nathans 获得了1978 年Nobel生理学和医学奖。
3. 限制性核酸内切酶的发现
• 到1986 年下半年，发现 615 种限制酶和 98 种甲基化酶。 • 到 2006 年2 月，共发现 4583 种限制酶 和甲基化酶，其中限制酶有 3773 种，Ⅰ型、 Ⅱ型和Ⅲ型限制酶各有 68 、3692 、10 种。
（3）非互补黏性末端(不对称末端)
当识别序列为非对称序列时，切割的 DNA 产物的末端是不同的。
BbvCⅠ C C T C A G C
GGAGTCG
CC GGAGT
TCAGC CG
Leabharlann Baidu
能识别简并顺序的，如：AvaI
AvaI 5’-CPyCGPuG-3’ CCCGGG; CTCGGG; CCCGAG; CTCGAG
第一节 限制性核酸内切酶与DNA分子的体外切割
一、限制性内切酶的发现 二、限制性内切酶的定义 三、限制性内切酶的命名 四、限制性内切酶的分类 五、II型限制内切酶的基本特性 六、影响酶活性的因素 七、限制内切酶的用途
二、限制性核酸内切酶的定义
•限制性内切酶 是一组可以特异性地识别DNA上的某一特 定序列，并将之水解的核酸酶。
一、限制性内切酶的发现 二、限制性内切酶的定义 三、限制性内切酶的命名 四、限制性内切酶的分类 五、II型限制内切酶的基本特性 六、影响酶活性的因素 七、限制内切酶的用途
五、II型限制性核酸内切酶的基本特性
• 是用途最广、最简单的一种限制性内切酶。 • II型限制性内切酶的形式多样，从大小上
来说，它们可以小到如PvuII (157个氨基 酸)，也可以比1250个氨基酸的CjeI更大。
-G GATC C
- T CTAG A
-C CTAG G
(3).识别相同，切割不同
eg: SmaI
XmaI
-CCC GGG-
-C CCGG
-GGG CCC-
-G GGCC C-
(4)．识别相同，切割相同──同工酶 同裂酶
• 限制性内切酶系统中有两个部分组成： 1.核酸酶 2.甲基化酶
•来源：细菌染色体、噬菌体/病毒 •限制性内切酶不仅受病毒感染的影响，还可随DNA的连接、
转导或转染而传给其他个体
限制性核酸内切 酶，是一类能够识 别双链DNA分子中的 某种特定核苷酸序 列，并由此切割DNA 双链结构的核酸内 切酶。
C.第三种II型限制性内切酶
• 第三种II型限制性内切酶(有时也被称为IV型限制性 内切酶)是一类较大的、集限制和修饰功能于一体的 酶，通常由850-1250个碱基组成，在同一条多肽链上 同时具有限制和修饰酶活性。有些酶识别连续序列， 并在识别位点的一端切开DNA链；而另一些酶识别 不连续的序列(如BcgI：CGANNNNNNTGC)，并在 识别位点的两端切开DNA链，产生一小段含识别序 列的片段。
1、细菌的限制和修饰系统的发现
• 1950年代初期，两组科学家几乎同时发现了限制修饰现 象，当时称为宿主专一性: 1952年，Luria, Humann等：T偶数噬菌体, 1953年，Bertani, Weigle等：λ和P2噬菌体。
• 大量的研究结果证实λ噬菌体所表现的宿主限制和修饰现 象更具普遍性和代表性。
粘性末端的意义
5’末端标记 凸出的5’末端可用DNA多核苷酸激酶进行32P
标记。 3’末端标记 凸出的3’端可以通过末端转移酶添加几个多
聚核苷酸的尾巴（如AAA或TTT等）造成人工 粘性末端。 补平成平齐末端 粘性末端可以用DNA聚合酶补平成平齐末端。
部 分 常 用 的 限 制 性 内 切 酶
①第1个字母大写，表示来源物种属名的第一个字母。 ②第2、3个字母小写，表示来源物种种名的前二个字母。 ③如果细菌有不同的血清型，则有第四个字母，小写，且与前3个
字母紧紧排在一起。
Hind Ⅲ：Haemophilus influensae d
④当控制宿主的限制、修饰系统的遗传因子位于病毒和质粒上时， 需要在名称中标出遗传成分。