第三章转基因动物技术与药物生产[可修改版ppt]
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《转基因动物制药》课件
转基因动物制药的未来发展方向
创新药物研发
01
利用转基因动物模型，开发针对罕见病、遗传性疾病等创新药
物。精准医疗Fra bibliotek02通过转基因技术实现个性化治疗，根据个体基因组差异，定制
化药物和治疗方案。
生物制药生产
03
利用转基因动物生产高纯度、高质量的药物，降低生产成本，
提高药物可及性。
转基因动物制药的未来技术革新
生物能源领域
在生物能源领域，转基因动物制药技术的应用主要集中在生物燃料的生产和转化方面。
通过转基因技术，可以培育出具有高效转化能力的动物细胞或微生物，用于生产生物燃料，如乙醇、生物柴油等，这些燃料 具有可再生、环保、高效等优点，是未来能源发展的重要方向。
CHAPTER 04
转基因动物制药的未来展望
转基因动物可能对生态环境造成 不可预测的影响，如基因污染、 生态失衡等。
食品安全问题
转基因动物可能对食品链产生影 响，如基因转移至农作物等，引 发食品安全问题。
法规与监管问题
法规缺失
目前对于转基因动物制药的法规尚不完善，存在监管空白，导致相关活动缺乏规范和约 束。
监管不力
现有监管体系对于转基因动物制药的监管力度不够，可能导致一些潜在风险无法得到及 时发现和应对。
在转基因动物制药中，基因敲除技术可以用来研究特定基因 的表达对药物生产的影响，或者消除某些不良基因的表达产 物，提高药物生产的效率和安全性。
基因编辑技术
基因编辑技术是指通过特定的手段对 生物体的基因组进行精确的编辑和修 改，从而实现对生物性状的精准调控 和改造。
VS
在转基因动物制药中，基因编辑技术 可以用来精确地修改动物的基因组， 从而生产出更加高效和安全的蛋白质 药物。
动物转基因技术 ppt课件
电击穿孔法
将外源基因通过电场作用，导入动物目标组织或器官。由于这种方法能 有效导入外源基因，可在多种组织器官上应用,并且效率较高。活体电穿 孔法的原理很简单,在直流电场作用的瞬间,细胞膜表面产生疏水或亲水的 微小通道105～115μm ,这种通道能维持几毫秒到几秒,然后自行恢复。 在此期间生物大分子如DNA 可通过这种微小的通道进入细胞。 电穿孔的法的特点： 1理论上任何组织和器官都可以作为活体电穿孔的靶器官 2对导入的外源基因片段的大小没有限制 3电穿孔法操作简单快速,电穿孔的时间只有几秒钟,而且DNA片段不需要 特殊的纯化操作 缺点： 首先,外源基因表达持续的时间很短,虽然外源基因导入后最快可在215 小 时有表达,但大多1～2 月后表达量降至很低。外源基因表达的时间主要 由于所构建的表达载体和基因导入的靶细胞组织器官不同而存在巨大差 异。
医学研究
心血管疾病的研究 各种调节心血管功能的因子如转脂蛋白、转纤维蛋白溶酶原等都可通过转基因动物来了解 其生理功能及作用，建立如动脉粥样硬化、突发性高血压、静脉闭塞等转基因动物模型。 肿瘤学研究 肿瘤基因的发现是近10年来肿瘤学研究的重大突破，现已发现乳腺癌基因等100多个肿瘤 基因。实验证明，各种脊椎动物都携带肿瘤基因，在通常情况下并不引起细胞癌变，只有 在某些条件下才能被激活使癌细胞增生而导致癌变。建立带有肿瘤基因的转基因动物可了 解哪些组织对肿瘤基因转化活性敏感、肿瘤形成与其基因的关系、肿瘤基因生长分化影响 等等。 遗传病研究 通常是将功能正常的外源基因导入动物体的靶细胞内，用来弥补缺陷的基因，改变患病细 胞的遗传物质，进行基因治疗。相反的将显性疾病基因或一个、甚至多个外源基因人为地 导入动物体内，就可制备遗传性疾病的转基因动物模型，研究和治疗人类遗传性疾病。 免疫学研究 巴宾耐特(Babinet)发现虽然转基因小鼠产生HBsAg，但在6个月内没有任何病理变化，表 现为一种持续的带病毒状态。这些结果表明：乙型肝炎患者的肝细胞损伤不是由HBV的 HBsAg表达直接引起，而是通过对肝细胞膜上的病毒抗原发生免疫反应造成的。因此，可 以用转基因小鼠模型来研究免疫耐受与肝细胞损伤的关系以探讨发病机制。此外，转基因 小鼠还为研究第l和第Ⅱ类主要组织相容性抗原的功能提供了新手段。
[课件]动物转基因技术PPT
![[课件]动物转基因技术PPT](https://img.taocdn.com/s3/m/aba2a62df12d2af90242e685.png)
生命现象的基础理论研究 发育生物学的研究 转基因动物可用于观察目的基因在胚胎不同发育阶段的特异 性表达、关闭及调控机制，了解调控顺序(如增强子、启动 子)在组织特异性表达中的作用，此外，转基因动物还可用 于识别动物发育过程中的基因(包括内源基因)及其活动，也 可测出与动物发育相关的未知基因的表达特性。 遗传学研究 利用自然突变或人为修饰的基因作为外源基因，构建转基 因动物，研究导人的异常基因的表型效应，可以了解基因站 构和功能的盖系，还可用于基因组印迹分析、遗传缺陷的矫 正等
表达载体的构 建
基因导入
受体细胞的获 得
受体动物选择 转基因胚胎移 植
转基因整合表 达的检测
遗传性能研究 以及性能选育
转基因表达产 物的分离与纯 化
组建转基因动 物新类群等
外源基因导入到细胞的方法
物理方法
点击穿孔法
化学方法
DEAE葡聚糖 法 磷酸钙DNA 共沉淀法 脂质体载体 包埋法
生物学方法
病毒转染法 胚胎干细胞 介导法 精子载体法
1970年，从流感嗜血杆菌中分离到一种限制性酶 1972年美国斯坦福大学P.Berg等构建了第一个重组子 1973年，S.N.Cohen构建了第一个可以在细胞中表达的重组子 1980年 科学家首次培育出世界第一个转基因动物转基因小鼠
1983年 科学家首次培育出世界第一个转基因植物转基因烟草
1988年 K.Mullis发明了PCR技术加速了基因工程的发展具有里程碑意义
动物基因工程
1980年，Gordon首次报道用 DNA显微注射法获得了转基 因小鼠；1982年，美国科学 家Palmiter首次将大鼠生长激 素基因导入小鼠受精卵的雄性 原核中，获得了转基因小鼠， 其个体比对照鼠增大一倍，称 之为“超级鼠”。转基因动物自 1980年代诞生以来，一直是 生命科学研究和讨论的热点， 随着研究的不断深入和实验技 术的不断完善，转基因技术得 到了更广泛的应用，几乎每年 都有令人瞩目的研究成果报道， 有些转基因成果已经进入实用 化和商业化的开发阶段。
转基因技术——动植物转基因方法ppt(共22张PPT)
【DAWN_ZX】
•优点:不依赖组织培养人工再生植株，技术简单，
不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握
。
转基因
技术
【DAWN_ZX】
动物转基因方法
原核显微注射法 胚胎干细胞介导法
逆转录病毒载体法 精子介导的基因转移
核移植转基因法
体细胞核移植法
线粒体介导法
转基因
技术
【DAWN_ZX】
动物转基因方法
原核显微注射法（最常用）
【启动子】是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因
转录出mRNA，最终获得所需的蛋白质。 【终止子】也是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端。
【DAWN_ZX】
转基因技术的步骤
STEP3：将目的基因导入受体细胞
（1）导入植物细胞一般用农杆菌转化法，也可 用基因枪法或花粉管通道法。 （2）导入动物细胞一般用显微注射法。 （3）导入微生物细胞一般用感受态细胞吸收DNA 分子的方法。
转基因
技术
【DAWN_ZX】
转基因技术的步骤
STEP4：目的基因的检测和表达
1.检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因
。
方法：采用DNA分子杂交技术。 2.检测目的基因是否转录出了mRNA。
方法：采用用标记的目的基因作探针与 mRNA杂交。 3.最后检测目的基因是否翻译成蛋白质。
方法：从转基因生物中提取蛋白质，用相应的抗体进行 抗原－抗体杂交。 4. 进行个体生物学水平的鉴定。
•根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有 一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入 到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目 的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因 向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转 基因植株。 •近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中得到了广 泛应用。
转基因动物制药PPT课件
编辑课件
3
• 以下是科学家“制造” 出的最神奇、最古怪 的10种转基因动物。
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4
1、荧光鼠
• 2007年末，荧光鼠脑细胞的图片 传遍世界各地，从“福利客”超 市的宣传海报到“自然”杂志的 封面。这些五彩斑斓的脑细胞是 单个的神经元，鲜艳的色彩帮助 科学家将它们区分开来。英国哈 佛大学的杰夫-里奇曼为首的科 研小组在实验鼠的基因组中导入 水母的绿色荧光蛋白基因，使其 在紫色光线的照射下呈现出绿色 荧光。这种绿色荧光基因对小鼠 无害，只起到标记作用。
•
研究者将高度活跃的磷酸烯醇丙酮酸羧激酶
(PEPCK-C)基因注入老鼠胚胎。基因转化的老鼠在运
动时有效利用身体脂肪产生能量，同时避免产生大量
乳酸。乳酸可导致肌肉痉挛，即使耐力最强的运动员
也会发生肌肉痉挛。
•
科学家汉森教授说，超级老鼠主要利用脂肪转化
能量，体内只产生非常微量的乳酸，它们不吃不喝也
能跑4到5个小时。这种老鼠最多能以每分钟20米的速
被疟原虫感染不会杀死普通蚊子，但是会降低其繁殖率。
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13
7、超级老鼠
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14
• 一种超级老鼠可以不知疲倦地奔跑数小时、寿命更长、 拥有更强繁殖能力、吃得更多而不增加体重……美国 科学家培育出的这种转基因老鼠震撼了世界，引起人 们的遐想：培育超级老鼠的技术手段能否应用于人类，
改善人类的能力？第一只超级老鼠诞生于大约4年前。 如今，科学家已经培育出500只超级老鼠。
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12
6. 转基因蚊子
• 伦敦帝国学院的科研小组培育了一种转基因蚊子，其中的雄性具 有荧光睾丸，很容易被识别，然后令其不育。研究者称，可以将 大量这样的转基因蚊子放到野外与普通的雌蚊交配，减少疟蚊的 产卵量，从而慢慢减少疟蚊的数目。这种转基因蚊子没有生育能 力，所以不会将基因遗传给野生蚊子。
转基因技术及应用PPT课件
✓2001年5月23日，中国国务院第304号令颁布了《农业转基因生物 安全管理条例》。该条例共分8章，分别是总则、研究与试验、生 产与加工、经营、进口与出口、监督检查、罚则、附则等。
第20页/共100页
转基因生物的潜在生态风险
•
转基因生物的“基因污染”造成生态问题，引起杂草化。
1998年，加拿大Alberta省发现一种Canola油菜，它由于基因污染而含 有抗草甘膦、抗固沙草、抗咪唑啉类除草剂等三掌转基因堆积而成的 “光谱抗除草剂基因”（HT基因）。这种多抗性怪异油菜的种子爆荚、 休眠期长、种子很小、圆而光滑，可随风传播到相当远的距离，更易造 成基因污染和扩散，而一般除草剂对它无可奈何，成为多抗性的“超级 杂草”。 另一个有名的例子是：J. E. Losey 1996年在《Nature》杂志发表的一 篇报导：他们用转Bt基因玉米花粉的马利筋叶片来饲喂大斑蝴蝶幼虫， 对照组是加普通玉米花粉的马利筋叶片及不加玉米花粉的马利筋叶片， 结果转基因玉米花粉的叶片饲喂幼虫后，第二天死亡10％以上，4天后 死亡44％。而对照组全部存活。这就表明，Bt转基因玉米花粉可能威胁 大斑蝴蝶的生存,引起生态种群的破坏。
第22页/共100页
•
转基因生物对自然生态系统的潜在风险
侵入到新的栖息地。通过昆虫、鸟类、风力等媒介使转基因花粉四处扩散，造成基 因污染，威胁生物多样性安全。
丧失生物多样性。转基因生物通过生存竞争、环境胁迫或其他不确定性因素增加的 影响（基因、种群或物种），使生物多样性受损害或者丧失。
对非目标本土物种的伤害。由于改变互惠共生关系导致。 营养循环和环境生物地球化学过程的改变。生物与非生物环境的相互作用关系改变
重组质粒
合
农杆菌筛选标记
转
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转基因生物的潜在生态风险
•
转基因生物的“基因污染”造成生态问题，引起杂草化。
1998年，加拿大Alberta省发现一种Canola油菜，它由于基因污染而含 有抗草甘膦、抗固沙草、抗咪唑啉类除草剂等三掌转基因堆积而成的 “光谱抗除草剂基因”（HT基因）。这种多抗性怪异油菜的种子爆荚、 休眠期长、种子很小、圆而光滑，可随风传播到相当远的距离，更易造 成基因污染和扩散，而一般除草剂对它无可奈何，成为多抗性的“超级 杂草”。 另一个有名的例子是：J. E. Losey 1996年在《Nature》杂志发表的一 篇报导：他们用转Bt基因玉米花粉的马利筋叶片来饲喂大斑蝴蝶幼虫， 对照组是加普通玉米花粉的马利筋叶片及不加玉米花粉的马利筋叶片， 结果转基因玉米花粉的叶片饲喂幼虫后，第二天死亡10％以上，4天后 死亡44％。而对照组全部存活。这就表明，Bt转基因玉米花粉可能威胁 大斑蝴蝶的生存,引起生态种群的破坏。
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转基因生物对自然生态系统的潜在风险
侵入到新的栖息地。通过昆虫、鸟类、风力等媒介使转基因花粉四处扩散，造成基 因污染，威胁生物多样性安全。
丧失生物多样性。转基因生物通过生存竞争、环境胁迫或其他不确定性因素增加的 影响（基因、种群或物种），使生物多样性受损害或者丧失。
对非目标本土物种的伤害。由于改变互惠共生关系导致。 营养循环和环境生物地球化学过程的改变。生物与非生物环境的相互作用关系改变
重组质粒
合
农杆菌筛选标记
转
转基因动物的生产 PPT课件
16
转基因动物所面临的问题
1.技术性问题
（一）转基因动物的效率
目前转基因动物研究领域尚存在制备效率低的问题，转基因小鼠有效率只有4%。 注 射 外 源 基 因 后 的 存 活 率 为 86% ， 移 植 到 母 体 子 宫 后 存 活 率 25% ， 母 鼠 怀 孕 率 为 80%，基因在染色体上的整合率24%。
据不完全统计，制备一只转基因小鼠，需40个注射过的受精卵，而绵羊、山羊、 猪、牛分别为110，90，110个和1,600个，而转基因个体的后代中只有50%表达基 因，不能表达或表达混乱，不能遗传给后代等问题。随着这一技术的成熟，许多问 题有望得到逐步解决。
（二）转基因的整合造成宿主细胞基因的突变 （三）转基因的表达问题
杂交、筛选
嵌合小鼠
纯合转基因小鼠
6
2．逆转录病毒载体技术
原理：据逆转录病毒cDNA能整合到宿主染色体内这一特 性，克隆、构建重组逆转录病毒载体，通过转染，实现 生殖细胞的基因转移。
缺点： 逆转录病毒具有潜在致癌性； 载体构建复杂，容纳外源基因的大小有限（<10Kb)； 嵌合体比例大； 病毒载体序列可能干扰目的基因的表达。
2
转基因技术的概念
转基因技术就是用实验室的 方法将所需的目的基因导入 动物的受精卵，使外源基因 与动物本身的基因整合在一 起，在动物发育过程中表达， 并能稳定遗传给后代的技术。 这种在基因组中稳定地整合 有人工的外源基因的动物称 为转基因动物。
含有荧光水母基因的小猪
3
转基因动物技术
转基因动物技术的核心，是把遗 传的功能单位──基因转移到动 物体内，使它成为动物体内的一 部分。被转移的基因可以来自同 种或异种动物，也可以来自植物 或微生物。这样一来，就打破了 物种之间的界线。
转基因动物所面临的问题
1.技术性问题
（一）转基因动物的效率
目前转基因动物研究领域尚存在制备效率低的问题，转基因小鼠有效率只有4%。 注 射 外 源 基 因 后 的 存 活 率 为 86% ， 移 植 到 母 体 子 宫 后 存 活 率 25% ， 母 鼠 怀 孕 率 为 80%，基因在染色体上的整合率24%。
据不完全统计，制备一只转基因小鼠，需40个注射过的受精卵，而绵羊、山羊、 猪、牛分别为110，90，110个和1,600个，而转基因个体的后代中只有50%表达基 因，不能表达或表达混乱，不能遗传给后代等问题。随着这一技术的成熟，许多问 题有望得到逐步解决。
（二）转基因的整合造成宿主细胞基因的突变 （三）转基因的表达问题
杂交、筛选
嵌合小鼠
纯合转基因小鼠
6
2．逆转录病毒载体技术
原理：据逆转录病毒cDNA能整合到宿主染色体内这一特 性，克隆、构建重组逆转录病毒载体，通过转染，实现 生殖细胞的基因转移。
缺点： 逆转录病毒具有潜在致癌性； 载体构建复杂，容纳外源基因的大小有限（<10Kb)； 嵌合体比例大； 病毒载体序列可能干扰目的基因的表达。
2
转基因技术的概念
转基因技术就是用实验室的 方法将所需的目的基因导入 动物的受精卵，使外源基因 与动物本身的基因整合在一 起，在动物发育过程中表达， 并能稳定遗传给后代的技术。 这种在基因组中稳定地整合 有人工的外源基因的动物称 为转基因动物。
含有荧光水母基因的小猪
3
转基因动物技术
转基因动物技术的核心，是把遗 传的功能单位──基因转移到动 物体内，使它成为动物体内的一 部分。被转移的基因可以来自同 种或异种动物，也可以来自植物 或微生物。这样一来，就打破了 物种之间的界线。
《转基因动物技术》幻灯片PPT
卡那霉素抗性基因编码的是新霉素磷 酸转移酶II，基因记做neo，能通过降解 G418、新霉素和卡那霉素来实现真核和 原核细胞的相应抗性。
一般应用于原核生物就是卡那霉素抗 性基因,应用于真核生物就是G418抗性。
外源基因导入ES细胞的方法有: 1.电穿孔法 2.逆转录病毒载体法 3.脂质体包装法 4.磷酸钙沉淀法
Loxp位点：[ locus of crossing-over (x) in P1 ] site:
Cre-LoxP系统的特性
• Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、
可逆的过程，可以分成三种情况：
•
1、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方
向一样，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序
Oliver Smithies Martin J. Evans Mario R. Capecchi
Evans’s work: The ES cells
embryonic stem cell，ES • Stem cell
somatic stem cell
• Martin talks about his work
• mouse, rabbit, rat, sheep, pig, caw etc.
• The 2007 Nobel Prize in physiology or medicine is awarded for their discoveries of principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells.
转基因小鼠构建过程
• 构建打靶载体 • ES细胞打靶和筛选 • 囊胚注射 • 动物杂交筛选
一般应用于原核生物就是卡那霉素抗 性基因,应用于真核生物就是G418抗性。
外源基因导入ES细胞的方法有: 1.电穿孔法 2.逆转录病毒载体法 3.脂质体包装法 4.磷酸钙沉淀法
Loxp位点：[ locus of crossing-over (x) in P1 ] site:
Cre-LoxP系统的特性
• Cre重组酶介导两个LoxP位点间的重组是一个动态、
可逆的过程，可以分成三种情况：
•
1、如果两个LoxP位点位于一条DNA链上，且方
向一样，Cre重组酶能有效切除两个LoxP位点间的序
Oliver Smithies Martin J. Evans Mario R. Capecchi
Evans’s work: The ES cells
embryonic stem cell，ES • Stem cell
somatic stem cell
• Martin talks about his work
• mouse, rabbit, rat, sheep, pig, caw etc.
• The 2007 Nobel Prize in physiology or medicine is awarded for their discoveries of principles for introducing specific gene modifications in mice by the use of embryonic stem cells.
转基因小鼠构建过程
• 构建打靶载体 • ES细胞打靶和筛选 • 囊胚注射 • 动物杂交筛选
转基因.动物技术ppt
四 转基因动物技术的应用现状
目前，转基因动物技术主要应用于以 下个方面：
（一）促进动物生长、提高产量、改善品质 （二）生产药用蛋白 （三）生产移植动物器官 （四）提高抗病性 （五）动物育种 （六）建立诊断和治疗人类疾病的动物模型
五 转基因动物技术研究中出现的 问题
（一）制作转基因动物效率低 （二）外源基因在宿主基因组中的行为难以控 制 （三）转基因表达水平低 （四）一些环境和社会安全问题 （五）转基因动物死亡率高
1.优点：
物种适用面广 无需经过嵌合体育种就可直接获得纯合 个体 实验周期短 2. 缺点： 实验的成功率较低。
（五）精子栽体法
一种直接利用 精子作为外源DNA 载体的基因转移方 法。其方法是利用 精子可以俘获外源 DNA的特点，将成 熟的精子直接与外 源DNA混合培养， 外源DNA可以直接 进入精子的头部， 再经受精后，并使 外源DNA整合于受 精卵中,再将受精卵 发育成转基因动物。
1.步骤：
逆转录病毒载体的构建 选择和培养包装细胞系 重组病毒DNA导入包装 细胞 收集重组病毒颗粒 感染胚细胞，使细胞转 化 此法是目前制备转基因 鸡最有效和最成功的方 法。
2. 优点：
操作简单 外源基因的整合率较高 动物病毒所具有的启动子既可引发一些选择标记 基因的表达，还能引发所导人的外源基因的表达
（三）逆转录病毒法（Retrovirus mediated gene transfer）
主要是利用逆转录病毒DNA的长末端重复顺 序（LTR）区域具有转录启动子活性这一特点 ， 将外源基因连接到LTR下部进行重组后，包装成 高滴度病毒颗粒，去直接感染受精卵，或微注入 囊胚腔中，携带外源基因的逆转录病毒DNA可以 整合到宿主染色体。在各种基因转移方法中,通过 反转录病毒载体把基因整合到受体细胞核基因组 中是最有效的;1 0 kb ) 并且外源基因难以植人生殖系统，成功率较低。 携带外源基因的病毒载体在导入受体细胞基因组 过程中有可能激活细胞DNA序列上的原癌基因或 其他有害基因。
转基因动物PPT.
本章目录
6.1 动物转基因技术 显微注射法 逆转录病毒法 胚胎干细胞法 精子载体法 体细胞核移植法
6.2 提高转基因效率的策略 6.3 转基因动物的应用 转基因动物在生命科学基础研究中的应用 转基因技术在动物育种中的应用 转基因动物在医药科学研究中的应用
6.4 转基因动物研究存在的问题及展望
毒。
受体 吞噬 脱外壳 逆转录 核蛋白复合
体
有丝分裂 复合体进入
核
病毒DNA－蛋白复合体中含有由一个病毒DNA的pol基因
所编码的内切酶，在此酶的作用下，宿主染色体被切开，
而病毒的染色体得以嵌入。此过程发生在细胞有丝分裂
的S期。 不吃腐烂变质的食物
主要面试者应严格控制面试的进程，为了在有限的时间内详细了解应聘者及其知识背景，一定要禁止任何人游离面试主题。（主要面试者的问题围绕简 历展开，技术方面的专家主要询问相关经验，人事经理对细节进行核实。） 与客户建立互信关系 a冬眠期间的蛇、青蛙等突然出洞。 b白天，猫头鹰、黄鼠狼会频繁活动。 客户不希望什么
一. 显微注射法
在显微镜下将体外构建的外源目的基因，用注射针注射到动物受 精卵中，使之与动物基因组整合，从而得到转基因动物的方法。
1、目的DNA的准备
构建目的基因的表达载体：目的基因应包含完整的ORF,顺式调控
序列，加尾信号。
线性DNA分子的准备
DNA浓度：1-3μg/ml .
2、小鼠的准备和要求
标记性状
标记性状鉴 定转基因果 蝇
显微注射法的效率
每天可注射几百个卵，但大约只有66%能存活；移入 子宫后，大约25%的受精卵能发育成幼鼠；其中又有 大约25%左右的幼鼠是转基因鼠。
理想情况下，30－50/1000 一般情况下， 1/1000
6.1 动物转基因技术 显微注射法 逆转录病毒法 胚胎干细胞法 精子载体法 体细胞核移植法
6.2 提高转基因效率的策略 6.3 转基因动物的应用 转基因动物在生命科学基础研究中的应用 转基因技术在动物育种中的应用 转基因动物在医药科学研究中的应用
6.4 转基因动物研究存在的问题及展望
毒。
受体 吞噬 脱外壳 逆转录 核蛋白复合
体
有丝分裂 复合体进入
核
病毒DNA－蛋白复合体中含有由一个病毒DNA的pol基因
所编码的内切酶，在此酶的作用下，宿主染色体被切开，
而病毒的染色体得以嵌入。此过程发生在细胞有丝分裂
的S期。 不吃腐烂变质的食物
主要面试者应严格控制面试的进程，为了在有限的时间内详细了解应聘者及其知识背景，一定要禁止任何人游离面试主题。（主要面试者的问题围绕简 历展开，技术方面的专家主要询问相关经验，人事经理对细节进行核实。） 与客户建立互信关系 a冬眠期间的蛇、青蛙等突然出洞。 b白天，猫头鹰、黄鼠狼会频繁活动。 客户不希望什么
一. 显微注射法
在显微镜下将体外构建的外源目的基因，用注射针注射到动物受 精卵中，使之与动物基因组整合，从而得到转基因动物的方法。
1、目的DNA的准备
构建目的基因的表达载体：目的基因应包含完整的ORF,顺式调控
序列，加尾信号。
线性DNA分子的准备
DNA浓度：1-3μg/ml .
2、小鼠的准备和要求
标记性状
标记性状鉴 定转基因果 蝇
显微注射法的效率
每天可注射几百个卵，但大约只有66%能存活；移入 子宫后，大约25%的受精卵能发育成幼鼠；其中又有 大约25%左右的幼鼠是转基因鼠。
理想情况下，30－50/1000 一般情况下， 1/1000
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细胞或胚胎干细胞； 2.选择获得携有目的基因的细胞，选择合适的体外培养
系统和宿主动物； 3.转基因细胞胚胎发育及鉴定； 4.筛选所得的转基因动物品系。
6.2 转基因技术
转基因技术 目的基因的制备和来源 目的基因的克隆 细胞转染外源基因的方法 转染细胞的鉴定
6.2 转基因技术
目的基因的制备和来源 1．采用限制性内切酶，获取目的基因 2．通过mRNA合成cDNA 3．人工体外合成DNA片断 4．聚合酶链式反应(PCR)扩增特定基因片段
6.2 转基因技术
优点： A. 保证大片段DNA的完整性 B. 提高较长外源片段在动物转基因时的整合率 C. 保证目的基因上下游的侧翼序列的完整性
因而可以消除或减弱基因整合后的位置效应。 YAC介导法制备转基因动物具有广阔的应用前景。
6.2 转基因技术
人工酵母染色体（YAC）的制备
6.2 转基因技术
6.2 转基因技术
病毒类载体（λ噬菌体载体等）
λ噬菌体是一种双链DNA噬菌体，基因组约有50kb，在λ噬菌 体颗粒中分离出来的DNA为线性双链分子，在分子两端各有12 个碱基的互补单链顺序，是天然的粘性末端。λ噬菌体功能 相关基因成簇排列在基因组上，中间部分(约占30％)为非裂 解生长所必须，根据这一特性，可用其他外源DNA片段插入或 取代该区域，而对噬菌体的感染和生长不会造成严重影响。 这是λ噬菌体成为重要的、有价值的基因克隆载体的基础所 在。构建的重组λ噬菌体分子，其总长不得超过野生型DNA的 105％，不能短于75％。
sequence, ARS) 着丝粒DNA序列(centromere DNA sequence,CEN) 端粒DNA序列(telomere DNA sequence,TEL)
6.2 转基因技术
人工酵母染色体法 YAC能克隆百万对碱基的大片段DNA
技术途径：
A. 阳性ES细胞在YAC转染及体外筛选,囊胚腔注射 B. YAC的原核微注射。
第三章转基因动物 技术与药物生产
基因工程技术 按照人们的意志,通过人工操作的方式将外源基因整合 到生物体基因组内,使该转基因生物能稳定地将此基因 遗传给后代的实验技术。
特点:
• 基因体外重组 • 不受生物种类的限制 • 精确细致地控制
6.1 转基因动物的原理和方法
关键技术包括： 1.外源目的基因的制备，外源目的基因有效地导入生殖
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
6.2 转基因技术
6.2 转基因技术
细胞接受外源的方式
6.2 转基因技术
细胞转染外源基因的方法： 物理方法 化学方法 生物学方法
6.2 转基因技术
物理方法 1. 电穿孔法 2. 微注射法 3. 裸露DNA直接注射法
6.2 转基因技术
电穿孔法
6.2 转基因技术
电 穿 孔 法 示 意 图
6.2 转基因技术
6.2 转基因技术
人工染色体
人工酵母染色体(Yeast Artificial Chromosome,YAC) 人工细菌染色体(Bacterial Artificial Chromosome,BAC)
6.2 转基因技术
染色体DNA的三种功能元件（functional elements） 自主复制DNA序列(autonomously replicating DNA
6.2 转基因技术
生物学方法 基因转移的生物学方法主要是病毒介导的基因转移。根 据受体细胞类型不同可选择不同宿主范围和不同感染途 径的病毒基因组作为载体。目前常用的病毒载体包括DNA 病毒载体（腺病毒载体、牛痘病毒载体等）、反转录病 毒载体等。
6.2 转基因技术
腺病毒载体
运载DNA片段较大 安全性好 宿主范围广 对受体细胞分裂周期要求不严 外源基因表达高效
微注射法
6.2 转基因技术
微 注 射 法 示 意 图
6.2 转基因技术
6.2 转基因技术
裸露DNA直接注射法 将裸露DNA直接注射到组织中, DNA有可能被细胞摄入 这是最简单的基因转移方法,但是转移效率很低
6.2 转基因技术
化学方法 主要原理是通过改变细胞膜的通透性或者增加DNA与细胞 的吸附而实现基因的转移
6.2 转基因技术
磷酸钙-DNA共沉淀法 是受二价金属离子能促进细菌吸收外源DNA而来. 当核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式存在时,细胞摄取 DNA的能力显著增加。
6.2 转基因技术
磷 酸 钙 共 沉 淀 法 图 示
-DNA
6.2 转基因技术
脂质体载体包埋法
6.2 转基因技术
脂 质 体 载 体 包 埋 法 图 示
6.2 转基因技术
• DEAE-葡聚糖法 • 磷酸钙-DNA共沉淀法 • 脂质体载体包埋法
6.2 转基因技术
DEAE-葡聚糖法 • 最早的动物细胞转染方法。 • 将外源DNA片段与DEAE——葡聚糖等高分子碳水化合
物混合，DNA链上带负电的磷酸骨架便被吸附于DEAE 的正电荷基团上，从而形成DNA大颗粒。后者黏附于 受体细胞表面，并通过胞饮作用进入细胞内。 • 该方法的转化率较低。
6.2 转基因技术
粘粒载体
粘粒(cosmid)是由质粒和噬菌体的粘性末端构建而成，由于 λ噬菌体载体容量仍然受到一定限制，最大插入片段不能超 过23kb。1978年勘Collis和比Hohn发展了这类质粒与噬菌体 联合的新载体——粘粒，其基因组一般由以下几部分组成： 质粒复制起始位点，1个或多个限制性内切酶位点，抗药性 标记和带有粘性末端的DNA片段。粘粒载体大小为4—6kb， 而插入片段为29—45kb。
6.2 转基因技术
反转录病毒载体
可获得稳定有效的转染 可用于不易转化的细胞 但有免疫反应,转染能力有限
6.2 转基因技术
反 转 录 病 毒 载 体 图 示
6.2 转基因技术
目的基因的克隆 基因克隆的载体
（1）质粒载体 （2）病毒类载体（λ噬菌体载体等） （3）粘粒载体 （4）人工染色体
6.2 转基因技术
质粒载体
质粒是细菌染色体外小型双链环状DNA复制子，对 细菌的某些代谢活动和抗药性表型有一定作用。质粒 DNA不但能在细菌中复制，并且在添加真核复制信号 和启动子后，可以构建出能在原核或真核细胞中均可 复制的穿梭质粒，因此以质粒为载体的基因克隆方法 被广泛使用。
系统和宿主动物； 3.转基因细胞胚胎发育及鉴定； 4.筛选所得的转基因动物品系。
6.2 转基因技术
转基因技术 目的基因的制备和来源 目的基因的克隆 细胞转染外源基因的方法 转染细胞的鉴定
6.2 转基因技术
目的基因的制备和来源 1．采用限制性内切酶，获取目的基因 2．通过mRNA合成cDNA 3．人工体外合成DNA片断 4．聚合酶链式反应(PCR)扩增特定基因片段
6.2 转基因技术
优点： A. 保证大片段DNA的完整性 B. 提高较长外源片段在动物转基因时的整合率 C. 保证目的基因上下游的侧翼序列的完整性
因而可以消除或减弱基因整合后的位置效应。 YAC介导法制备转基因动物具有广阔的应用前景。
6.2 转基因技术
人工酵母染色体（YAC）的制备
6.2 转基因技术
6.2 转基因技术
病毒类载体（λ噬菌体载体等）
λ噬菌体是一种双链DNA噬菌体，基因组约有50kb，在λ噬菌 体颗粒中分离出来的DNA为线性双链分子，在分子两端各有12 个碱基的互补单链顺序，是天然的粘性末端。λ噬菌体功能 相关基因成簇排列在基因组上，中间部分(约占30％)为非裂 解生长所必须，根据这一特性，可用其他外源DNA片段插入或 取代该区域，而对噬菌体的感染和生长不会造成严重影响。 这是λ噬菌体成为重要的、有价值的基因克隆载体的基础所 在。构建的重组λ噬菌体分子，其总长不得超过野生型DNA的 105％，不能短于75％。
sequence, ARS) 着丝粒DNA序列(centromere DNA sequence,CEN) 端粒DNA序列(telomere DNA sequence,TEL)
6.2 转基因技术
人工酵母染色体法 YAC能克隆百万对碱基的大片段DNA
技术途径：
A. 阳性ES细胞在YAC转染及体外筛选,囊胚腔注射 B. YAC的原核微注射。
第三章转基因动物 技术与药物生产
基因工程技术 按照人们的意志,通过人工操作的方式将外源基因整合 到生物体基因组内,使该转基因生物能稳定地将此基因 遗传给后代的实验技术。
特点:
• 基因体外重组 • 不受生物种类的限制 • 精确细致地控制
6.1 转基因动物的原理和方法
关键技术包括： 1.外源目的基因的制备，外源目的基因有效地导入生殖
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
6.2 转基因技术
6.2 转基因技术
细胞接受外源的方式
6.2 转基因技术
细胞转染外源基因的方法： 物理方法 化学方法 生物学方法
6.2 转基因技术
物理方法 1. 电穿孔法 2. 微注射法 3. 裸露DNA直接注射法
6.2 转基因技术
电穿孔法
6.2 转基因技术
电 穿 孔 法 示 意 图
6.2 转基因技术
6.2 转基因技术
人工染色体
人工酵母染色体(Yeast Artificial Chromosome,YAC) 人工细菌染色体(Bacterial Artificial Chromosome,BAC)
6.2 转基因技术
染色体DNA的三种功能元件（functional elements） 自主复制DNA序列(autonomously replicating DNA
6.2 转基因技术
生物学方法 基因转移的生物学方法主要是病毒介导的基因转移。根 据受体细胞类型不同可选择不同宿主范围和不同感染途 径的病毒基因组作为载体。目前常用的病毒载体包括DNA 病毒载体（腺病毒载体、牛痘病毒载体等）、反转录病 毒载体等。
6.2 转基因技术
腺病毒载体
运载DNA片段较大 安全性好 宿主范围广 对受体细胞分裂周期要求不严 外源基因表达高效
微注射法
6.2 转基因技术
微 注 射 法 示 意 图
6.2 转基因技术
6.2 转基因技术
裸露DNA直接注射法 将裸露DNA直接注射到组织中, DNA有可能被细胞摄入 这是最简单的基因转移方法,但是转移效率很低
6.2 转基因技术
化学方法 主要原理是通过改变细胞膜的通透性或者增加DNA与细胞 的吸附而实现基因的转移
6.2 转基因技术
磷酸钙-DNA共沉淀法 是受二价金属离子能促进细菌吸收外源DNA而来. 当核酸以磷酸钙-DNA共沉淀物的形式存在时,细胞摄取 DNA的能力显著增加。
6.2 转基因技术
磷 酸 钙 共 沉 淀 法 图 示
-DNA
6.2 转基因技术
脂质体载体包埋法
6.2 转基因技术
脂 质 体 载 体 包 埋 法 图 示
6.2 转基因技术
• DEAE-葡聚糖法 • 磷酸钙-DNA共沉淀法 • 脂质体载体包埋法
6.2 转基因技术
DEAE-葡聚糖法 • 最早的动物细胞转染方法。 • 将外源DNA片段与DEAE——葡聚糖等高分子碳水化合
物混合，DNA链上带负电的磷酸骨架便被吸附于DEAE 的正电荷基团上，从而形成DNA大颗粒。后者黏附于 受体细胞表面，并通过胞饮作用进入细胞内。 • 该方法的转化率较低。
6.2 转基因技术
粘粒载体
粘粒(cosmid)是由质粒和噬菌体的粘性末端构建而成，由于 λ噬菌体载体容量仍然受到一定限制，最大插入片段不能超 过23kb。1978年勘Collis和比Hohn发展了这类质粒与噬菌体 联合的新载体——粘粒，其基因组一般由以下几部分组成： 质粒复制起始位点，1个或多个限制性内切酶位点，抗药性 标记和带有粘性末端的DNA片段。粘粒载体大小为4—6kb， 而插入片段为29—45kb。
6.2 转基因技术
反转录病毒载体
可获得稳定有效的转染 可用于不易转化的细胞 但有免疫反应,转染能力有限
6.2 转基因技术
反 转 录 病 毒 载 体 图 示
6.2 转基因技术
目的基因的克隆 基因克隆的载体
（1）质粒载体 （2）病毒类载体（λ噬菌体载体等） （3）粘粒载体 （4）人工染色体
6.2 转基因技术
质粒载体
质粒是细菌染色体外小型双链环状DNA复制子，对 细菌的某些代谢活动和抗药性表型有一定作用。质粒 DNA不但能在细菌中复制，并且在添加真核复制信号 和启动子后，可以构建出能在原核或真核细胞中均可 复制的穿梭质粒，因此以质粒为载体的基因克隆方法 被广泛使用。