癫痫动物模型

癫痫的动物模型一、简介癫痫症是最常见的神经系统疾病之一，其患病率在一般人口中每1000人约有5人。

根据世界卫生组织的定义，癫痫症是由先天或后天不同因素所引起的慢性脑疾病，其特征是反复性惊厥发作，伴随不同的临床和脑电图的表现。

因此，癫痫症(epilepsy)是一反复发作的临床症候群，而因一过性异常的一次脑细胞放电所引起的神经系统功能失常称为惊厥(Seizure)，惊厥是临床的行为活动，一次惊厥发作不一定表示有癫痫症。

目前，国内所用的癫痫分类方法是以国际抗癫痫联盟(ILAE)1981年和1985年的分类法。

但为了兼顾临床和实验室研究，本章所讨论的癫痫现象主要根据1981年的分类，此分类法主要以临床表现及EEG为依据将癫痫分为：全身性和部分性癫痫。

迄今研究人类癫痫的发病机理仍主要依靠动物实验，癫痫产生机制的探讨及最新进展亦多直接或间接来于动物模型研究。

目前已有数十种动物模型应用于癫痫研究，选择适宜的实验模型取决于所需解决的问题、所需的癫痫类型，与临床发作的一致性以及是否简单可靠。

因此，选择适当、有价值的癫痫动物模型是有效研究癫痫机制及治疗的捷径。

现已发展并建立了类似临床癫痫类型的多种癫痫模型(表I)，包括整体与离体、脑片与细胞模型，为探讨癫痫形成的机制及观察药物治疗疗效提供了有利的工具。

然而，如何合理、适当地应用这些动物模型是我们进行研究时首先应当考虑的，否则既浪费时间、精力与钱财，又不能得到可靠的结果。

以下分别介绍各种类型癫痫动物模型的利与弊。

表I：癫痫的动物模型1. 急性简单部分性 3. 复杂部分性 6. 脑组织表面致惊剂卡因酸海马脑片青霉素Tetanus toxin 原代分离细胞培养荷包牡丹碱点燃人类神经组织印防已毒 4. 全身强直－阵挛7. 癫痫持续状态士的宁遗传性胆碱能药物光敏狒狒急性电刺激听源性惊厥小鼠去除GABA Totterer 和E1 小鼠新皮层脑片遗传性癫痫易感大鼠2. 慢性简单部分性蒙古沙土鼠皮层埋置金属最大电休克氢氧化铝化学致惊剂钴代谢性derangements钨铁 5. 全身性失神冷冻损伤神经节苷脂抗体注射静脉注射致痫剂二、急性简单部分性癫痫模型这类模型是一组急性皮层损伤所致的惊厥放电。

在临床这样的损伤如颅内脓肿、肿瘤或血肿可引发惊厥，然后发展为慢性隐匿性反复性发作。

而动物模型只出现单次惊厥，不发展为慢性惊厥。

造成这类模型的方法较多，如给予大脑皮层表面致惊剂：青霉素、荷包牡丹碱、印防已毒(为抑制性神经递质GABA拮抗剂)，或直接急性电刺激皮层组织，或消除抑制性神经递质GABA或以化学致惊剂诱发新皮层脑片放电等方法。

其中应用最广泛的是以青霉素涂于动物大脑皮层表面的方法，即以含1.7－3.4mM青霉素棉棒涂于大鼠或猫的脑皮层，数分钟后即可记录到病灶区的发作性、单向反复性、倾向同步化的棘波放电，此模型适合研究惊厥活动的播散和癫痫产生的神经元基础等问题。

研究表明低剂量的青霉素放于培养中的神经元、麻醉动物的大脑皮层或海马脑片中可选择性阻断GABA介导的抑制性突触后电位(IPSPs)，而高剂量的作用则缺乏特异性。

急性模型的缺点是：(1)每种药物有各自特性，而此特性与癫痫产生的关系甚少，如青霉素酶可拮抗青霉素所致的癫痫，但不能拮抗其它类型的癫痫产生，(2)急性模型的建立是依靠强烈的刺激，病灶中许多细胞参与癫痫活动，其参与程度大大超过人类病灶的实际神经元数量，(3)急性模型仅持续数分钟到数小时，而不导致反复性惊厥，并且，模型无临床病人组织中常见的神经元，树突，胶质细胞和局部神经环路形态学的病理改变，(4)建立此模型时，动物需要麻醉，而麻醉可能影响实验。

三、慢性简单部分性癫痫模型此类模型的建立方法包括：在猫或猴的脑皮层植入二价金属离子(氢氧化铝、钴、锌、钨等)、冷冻损伤、注射神经节苷脂抗体、静脉给予致惊剂等，其中最有效的和实际的癫痫模型是在脑内植入二价金属离子产生“自发性”放电状态的简单部分性惊厥，如：在猴子或猫的新脑皮层适当部位注射4％氢氧化铝，在一到二周后可产生自发的反复性惊厥，这种状态可持续数年。

此类癫痫模型的发作行为、发作间发作后EEG、病理改变及抗痫药物效果均近似人类简单部分性癫痫。

如：铝离子损伤可诱发对侧的面部或肢体末端抽搐，偶尔也发展成为全身性强直－阵挛性惊厥，发作期与间歇期的脑电图特征与临床病人类似，神经病理显示胶质细胞增生、神经树突扭曲。

该模型的优点是适于研究从脑病理损伤，癫痫产生，直至发展全过程中的机理。

四、复杂部分性癫痫模型复杂部分性癫痫通常起源于边缘系统，包括杏仁核、海马、颞叶新皮层等结构，目前常用的模型包括卡因酸致惊、破伤风毒素致惊、点燃致惊模型。

由于点燃模型是目前被公认为研究脑细胞兴奋性、可塑性及长时程增强(LTP)、学习与记忆等问题的最实用的动物模型。

以下重点介绍点燃模型的建立方法。

点燃模型点燃是指给予某一脑区重复的亚惊厥强度的刺激(通常是电刺激)造成正常动物强直－阵挛性惊厥的过程。

点燃一旦建立，这种脑细胞及惊厥行为的敏感性可长期维持，及至动物终身。

点燃动物在脑电活动的特征是后放电(afterdischarges)。

除了后放电以外，点燃动物还表现为后放电的阈值降低。

因此，点燃的实质是出现长时程的广泛的脑电图的惊厥(后放电)伴随行为惊厥及后放电阈值降低。

电刺激是诱发后放电最简单方便的方法。

¬电刺激部位大多在边缘系统包括：海马、内嗅皮层、梨状皮层、新脑皮层和基底部结节，而杏仁核是最常用的点燃部位，因其所需的刺激次数少(大约14次)，在杏仁核、海马和新脑皮层通过电刺激诱发的脑电及行为惊厥模型各不相同。

杏仁核诱发出的后放电时程较短(大约10～15秒)，而海马诱发的后放电较长(大约25～60秒)并伴有典型“湿狗样震颤”的行为改变，如果反复给予电刺激最终都可诱发强直－阵挛性惊厥。

由于点燃过程中的一些现象及行为表现与人类复杂部分性癫痫相似，如：皮层内电极记录的EEG表现，相似的惊厥行为表现，并都可诱发全身性惊厥，以及对传统抗癫痫药物如安定、苯巴比妥、苯妥英钠、Valproicacid 都具有的敏感性等，近年的研究发现，点燃能导致海马内神经元脱失，苔藓纤维出芽和突触重建，胶质斑痕形成等，提示该模型与人类复杂部分性惊厥的相似性。

点燃模型的优点：建立该模型较方便，并且一旦建成£，其脑内高度兴奋性神经元可永久存在，并可探讨癫痫研究中的三个核心问题：(1)神经元高度兴奋形成的机制?(2)高度兴奋如何保持？(3)高度兴奋如何发展？对这些问题的解释有利于更有效的治疗、预防癫痫的发生与发展。

最常用的点燃方法是以电刺激杏仁核(在各类动物均可，常用大鼠)，在杏仁核植入双极电板，手术后一周，每天给予电刺激(常规为0.2－1.0mA,60Hz,1－2秒)，大致1～2周内可记录到对电刺激产生的后放电后，放电逐渐趋于延长复杂化，此时，可称为点燃建立，在以后的数周内，动物表现为“自发性”的癫痫性惊厥，即正常的脑细胞传入刺激亦可激发后放电。

Racine根据点燃过程中动物惊厥表现将点燃状态分为V级：I级：面部阵挛，II级：面部阵挛伴节律点头，III级：面部阵挛、点头、单肢阵挛、IV级：III级＋后肢站立，V级：IV级＋跌倒。

¬IV和V级可作为继发性全身性癫痫模型。

(一)、材料1.体重300～325克的雄性SD(Sprague-Dawley)大鼠2.动物立体定位仪3.四导生理记录仪4.生理计数器5.双极电极(镍铬含金、直径254um)，直径、电阻6.恒温冷冻切片机(二)、电极埋置以50mg/kg戊巴比妥，腹腔注射麻醉动物。

将麻醉后动物固定于立体定位仪上，保持前后囟在同一水平面。

于头颅正中纵向切开皮肤，止血，分离颅间肌肉，骨膜以3％H2O2脱脂，务使颅骨表面保持干燥。

右侧杏仁核立体定位座标为：前囟中后0.8mm，中线右侧4.8mm，项端表面垂直进入深度8.5mm。

钻孔、插入电极，再以牙科水泥固定电极。

观察呼吸、循环1小时。

点燃实验于动物恢复一周后进行。

(三)、电刺激与参数电刺激每次1～2次，刺激参数：单机方法、0.1－1.0mA、60Hz，1－2秒。

每次刺激后，立即用同一电极记录脑电、并观察记录动物行为。

动物惊厥达V级时可称为点燃(Kindled)，连续5次V级的惊厥被称完全点燃(FullyKindled)。

(四)、惊厥阈值的测定在1分钟内连续0.1mA的电刺激及递加0.1mA，首次诱发出后放电时的电流量称为后放电阈值(afterdischargesthreshold,ADT)。

慢性点燃是以低于后放电阈值的电流刺激动物某一脑内核团，直到动物被点燃。

全身惊厥阈值(generalizedseizurethreshold,GST)是指在完全点燃动物中，每天给予稳定的刺激强度，连续四天都可造成4或5级惊厥，GST可应用于抗癫痫药物治疗效果的监测。

(五)、组织学检查点燃部位以戊巴比妥钠麻醉后，剪开胸腔，以生理盐水心脏灌流，再以4％多聚甲醛灌流，约30分钟。

剪碎颅骨，完整取出脑组织，液氮内冷冻后，于－20℃恒冷箱切片机内平衡温度，切片(12um)，检查电极尖端位置，肉眼观察或克紫染色在显微镜下观察电极周围神经细胞情况。

（六）传统的点燃方法认为，串间间隔低于20分钟的电刺激不能使动物点燃，但近年来国外文献报道：低于20分钟的串间间隔的电刺激也同样能使动物点燃，并使点燃所需时间明显缩短，点燃动物具有与传统点燃一样的属性，称为快速点燃。

除刺激参数外其余的方法与传统点燃一样。

刺激参数：频率16Hz,波宽1ms,串长10s,串间间隔5min，强度400uA，恒流脉冲刺激。

五、全身性强直－阵挛性惊厥模型这类模型包括遗传性全身性惊厥动物模型、最大电休克模型、化学药物致惊模型。

目前应用较多的是遗传性动物，但迄今尚未发现与人类的发性全身强直－阵挛性癫痫近似的动物模型。

从各种遗传突变种系中所选动物，其诱发癫痫发作所用的刺激，以及它们伴有的非惊厥性异常均与人类不同。

理想的对25次/秒间歇闪光刺激敏感的狒狒癫痫模型，因价格昂贵难于管理而不实用。

目前多用遗传性癫痫易感小鼠及大鼠模型，并已有专门的实验室进行同种近亲繁殖的种系(如美国Jackson实验室)。

Noebels近年已证实在1种伴自发惊厥及5种对感官刺激惊厥易感的小鼠系中，每种均由单基因位点突变引起。

如听源性惊厥(12～16Hz铃声诱发)易感的DBA/2J(audiogenicseizures,AGS),Totterer小鼠系等。

DBA/2J的易感性在生后2～4周最高，按发作行为不同评分，EEG因奔跑跳跃不易记录，近年通过广泛神经生化研究发现可能缺少钙依赖的ATP酶。

Totterer(tg/tg)小鼠表现出癫痫及EEG异常并同时有遗传性共济失调，已证实其海马及蓝斑等区NA的浓度及神经末梢数量增多。