实验7-2 丙二醛含量测定

实验7-2 丙二醛（MDA）含量测定
【实验目的】
1、掌握植物组织中丙二醛含量测定的原理和方法。

2、了解丙二醛含量测定的意义。

【实验原理】
植物器官在衰老或逆境胁迫时，会发生脂质过氧化作用，丙二醛（MDA）是其终产物之一，其含量可以反映脂类过氧化程度和植物遭受逆境伤害的程度。

在高温和酸性条件下，丙二醛与硫代巴比妥酸（TBA）反应，生成红棕色的3，5，5-三甲基恶唑-2，4-二酮（三甲川），在532nm处有最大吸收波长。

植物在胁迫条件下可溶性糖增加，而糖与硫代巴比妥酸的反应产物在532nm也有吸收（最大吸收波长为450nm），因此测定植物组织中丙二醛含量时需排除可溶性糖的干扰。

采用双组分分光光度法可分别求出丙二醛和可溶性糖的含量。

蔗糖与TBA反应产物在450 nm和532nm的摩尔吸收系数分别为85.40和7.40；丙二醛与TBA反应产物在450 nm和532nm的摩尔吸收系数分别为0和155000，根据Lambert-Beer定律，列出二元一次方程：
A450=C1×85.4
A532- A600=C1×7.4+ C2×155000
解此方程得：
C1（mmol/L）=11.71 A450
C2（μmol/L）=6.45（A532- A600）-0.56 A450 （1）其中：C1——可溶性糖的浓度
C2——丙二醛的浓度
A450、 A532、A600分别表示450、532和600nm波长下的吸光值。

【实验器材与试剂】
1、实验材料受逆境胁迫的植物叶片或衰老的植物器官、正常植物叶片或器官
2、实验试剂 10%的三氯乙酸（TCA）（称取10克TCA蒸馏水稀释定容至100mL）、石英砂、0.6%的硫代巴比妥酸（称取0.6克硫代巴比妥酸先用少量1mol/L氢氧化钠溶解，再用10%三氯乙酸定容至100mL）
3、实验仪器分光光度计、离心机、研钵、电炉、试管、量筒、天
平、移液管等
【实验步骤】
1、MDA的提取
称取材料1g，剪碎，先加入2mL10%的三氯乙酸和少量石英砂研磨，再加入8mL10%的三氯乙酸充分研磨后，4000r/min离心10min，上清液即为样品提取液。

2、显色反应及测定
吸取2mL提取液，加入2mL0.6%的硫代巴比妥酸，混匀，于沸水浴中反应15min，迅速冷却后离心。

以2mL蒸馏水代替提取液作为对照。

3、测定
取上清液测定532nm 、450nm和600nm处的OD值。

4、计算
先按公式（1）计算样品提取液中丙二醛的含量，再根据植物组织的鲜重计算丙二醛的含量（μmol/gFW）。

【注意事项】
1、MDA-TBA显色反应的时间最好控制在10-15min之间。

时间太短或
太长均会引起532nm
下的光吸收值下降。

2、一定要充分研磨样品以保证MDA提取完全。

【实验作业】
1、正常植物组织与胁迫条件下植物组织的丙二醛含量相比有什么变化，分析其原因。

2、为什么要测定反应液在600nm下的吸光度？
3、有哪些因素会影响植物组织中丙二醛含量的测定？
【参考文献】
1.张志良等主编.植物生理学实验指导.高等教育出版社,北京,2009.
2.郝再彬等主编. 植物生理学实验.哈尔滨工业大学出版社,哈尔滨,2004.
3.李合生主编. 植物生理生化实验原理和技术. 高等教育出版社,北京,2000.。