第二章 酶工程

第三章酶工程第一节概述酶工程简介生物工程包括四大技术体系：基因工程，细胞工程，酶工程和发酵工程。

基因工程不是一个独立的生产技术，通过基因工程可以改变生物的产酶量和酶系，真正发挥工业效益的还是发酵工程和酶工程。

酶工程是酶学研究发展和工程学相互渗透、结合，发展成一门新的技术科学—酶工程。

酶工程是工业上有目的的设计一定的反应器和反应条件，利用酶的催化功能，在常温常压下催化化学反应，生产人类需要的产品或服务于其他目的的一门应用技术。

酶工程这一术语出现在20世纪60年代末和70年代初，1971年召开了第一次国际酶工程会议：当时研究的范围包括酶的生产（包括微生物酶的发酵提取及从动植物中提取酶的技术、酶的固定化技术、酶的化学修饰、酶动力学研究、酶反应器的设计和应用及酶在医学、工业、农业、食品等方面的应用）近些年又增加了一些新的内容：酶的化学修饰：通过化学修饰（在分子水平上用化学方法对），提高酶的稳定性、改变其作用专一性或者最是反应条件，增加其稳定性，消除其抗原性（指某些酶能在体内诱导产生抗体而失活）。

模拟酶：根据酶的原理，用人工方法合成具有活性中心和催化作用的非蛋白质结构的化合物。

抗体酶：由于抗体和酶均属于蛋白质，两者都有求于互补性物质，具有相似性，前者结合的是直接的，后者的结合是过渡态的。

抗体酶是将类似酶反应中过渡态结合物注入动物体所诱发出来的一种抗体。

核酸酶：具有催化活性的RNA。

有机相酶反应：极端条件下进行得反应，可以改变某些酶的性质，两种方式：1 在水-水不容的有机溶剂双相体系中反应，底物在水和有机溶剂中溶解度大，产物在有机溶剂中溶解度大；2 采用形成反胶束的方式进行，即酶的水溶液都在表面活性剂的作用下在有机相中形成“油包水”的乳浊液，底物要求是能溶于有机相。

酶标免疫反应：酶传感器：生物传感器中的一类，一般包括两部分，1 固定化酶膜，膜允许被测小分子物质进入膜内，而固定在膜内侧的酶则不能泄到膜外；另一部分是基本传感器，酶膜即覆盖在其上。

小分子被测物质作为底物被酶催化产生pH或者O2的变化或形成简单产物，如NH3，H2O2，CO2等。

酶工程（Enzyme engineering）是指通过化学方法、酶学方法和DNA重组技术改善自然酶的形成、结构和性质，提高酶的催化活性、降低成本并在大规模工业化生产中应用。

主要内容：1 酶的制备和酶与细胞的固定化2 酶反应器的设计和放大3反应条件的控制和优化…….酶工程的分类●化学酶工程：通过对酶的化学修饰或固定化处理，改善酶的性质，提高酶的效率和降低成本，甚至通过化学合成法制造人工酶，也称为初级酶工程；●生物酶工程：用基因工程技术生产酶以及对酶基因进行修饰或设计性能稳定、具有新的生物活性及催化效率更高的酶，也称为高级酶工程。

一、酶的定义酶是由生物体内活细胞产生的一种生物催化剂，按化学组成的不同主要分为核酸类酶（R酶）和蛋白质类酶（P酶）。

二、酶的分类与命名法1 习惯命名法底物名称：淀粉酶、蛋白酶催化反应性质：氧化酶、转氨酶底物结合催化反应性质：胆固醇氧化酶、醇脱氢酶来源：心肌黄酶、含铁酶缺点：无系统性，一酶数名或一名数酶。

2 系统命名法与分类国际生化联合会（IUB）酶学委会于1961年规定了酶的统一命名法及分类原则。

系统命名法：酶的名称由底物及反应类型两部分组成。

六大类：氧化-还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶和连接酶。

三、酶的结构和特性1 酶的结构●酶的组成成分单纯酶——仅由蛋白质组成的酶。

结合酶——除蛋白质外，还有非蛋白质的成分。

全酶=酶蛋白+辅因子辅因子有两种：辅酶和辅基辅酶：与酶蛋白结合较松弛的小分子物质。

辅基：与酶蛋白结合较紧密，常常以共价键结合。

●根据酶的聚合状态，酶可以分为三类：单体酶：酶蛋白仅有一条多肽链组成。

寡聚酶：酶蛋白是寡居蛋白质，有几个至几十个亚基组成，以非共价键连接。

多酶复合体：由几个酶聚合而成的复合体。

一般由在系列反应中功能相关的酶组成，有利于系列反应的形成。

●酶的活性中心指酶分子中直接和底物结合，并和酶催化作用直接相关的部位。

组成：由一些氨基酸残基的侧链基团组成。

这些基团在一级结构上可能相聚很远，甚至可能不在一条肽链上，但在蛋白质空间结构上彼此靠近，形成具有一定空间结构的区域。

对于结合酶，辅因子常常是活性中心的组成部分。

酶活性中心的特点：●活性中心在酶分子总体积中只占相当小的部分（1-2%），相当于2-3个氨基酸。

●都是酶分子表面的一个凹穴，有一定的大小和形状，但不是刚性的，而具有一定的柔性。

●活性中心为非极性的微环境，有利于与底物结合。

●底物与酶通过形成较弱键力的次级相互作用并结合到酶的活性中心。

●酶的活性部位并不是和底物的几何图形正好吻合，而是在酶与底物结合的过程中，底物分子或酶分子或它们两者的构想同时发生一定变化后才能相互契合，这时催化基团的位置也正好处于所催化底物的敏感化学键部位。

2 酶的特性①催化效率高②专一性强③反应条件温和④催化活性受到调节和控制四、酶的来源酶作为生物催化剂普遍存在于动物、植物和微生物中，可直接从生物体中分离提纯。

酶的生产方法可分为提取法﹑发酵法以及化学合成法。

–化学法仍在实验室阶段；–提取法是最早采用且沿用至今的方法，如从动植物组织液中提取胰蛋白酶和菠萝蛋白酶；–发酵法是50年代以来酶生产的主要方法，如生成葡萄糖异构酶和枯草芽孢杆菌蛋白酶等。

五、酶促动力学六、酶的分离纯化与酶的活力测定1 酶的分离纯化细胞外酶和细胞内酶在生物细胞内除了目标酶还有很多其他的酶，因此需要分离和纯化的步骤。

基本步骤：●破碎细胞膜●抽提●纯化比活力：纯度的量度，指每毫克质量的蛋白质中所含的某种酶的催化活力，一般用单位/毫克蛋白（U/mg蛋白质表示）。

酶的比活力越高，酶的纯度也就越高。

纯化倍数=每次比活力/第一次比活力产率%=每次总活力/第一次总活力2 酶的活力测定1个酶活力国际单位是指在特定条件下，1min内生成1μmol产物的酶量（或转化1 μmol底物的酶量）。

第二节酶和细胞固定化●随着酶学研究的不断深入和酶工程的发展，工业化生产所需的酶越来越多，在应用中，人们也发现一些问题，●比如酶的稳定性较差，在温度、pH和无机离子等外界因素下，容易变性失活；●酶一般是在水溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍然有很高的活力，也难以回收利用，一次性使用的方式，使成本很高，难以连续化生产；●酶反应后成为杂质和产物混在一起，由于酶的分离纯化比较复杂，分离的酶稳定性显著下降，无疑给进一步纯化带来很大的困难。

酶固定化技术发展史●20世纪60年代，以色列科学家发现酶的固定化现象：细胞里许多的酶不是独立在溶液中，而是包埋在细胞膜里或者其他细胞器里起作用。

于是，他试着把分离得到的酶结合到某种不溶于水的载体上，或者是包埋于天然的或人工合成的膜上，这样就装配成了固定化酶。

对固定化酶的活性进行鉴定，发现许多酶经过固定化后，活性丝毫未减，稳定性反而有了提高。

在反应容器里面，固定化酶可以反复利用。

这也是酶的推广应用的转折点。

●1969年，千畑一郎等将固定化氨基酰化酶应用于生产L-氨基酸，开创了固定化酶应用于工业生产的先例；●1971年召开的第一届国际酶工程会议上，建议采用统一的英文名称ImmobilizedEnzyme；●1973年，固定化大肠杆菌菌体中的天冬氨酸酶连续生产L-天冬氨酸。

●1986年，利用固定化原生质体发酵生产碱性磷酸酶和葡萄糖氧化酶等相继获得成功。

一、固定化酶的制备⒈固定化酶的定义：固定化酶是指限制或固定于特定空间位置的酶，具体来说，是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。

广义的固定化酶包括：固定化辅酶；固定化细胞；固定化细胞器为了减少从微生物或者其他生物体中提取酶的麻烦，有时为了充分利用生物细胞的多酶系统，开发另外一种固定化催化剂的形式，固定化细胞。

⒉固定化酶的特点具有生物催化剂的功能，又有固相催化剂的功能。

①可重复使用，降低成本；②反应后，酶底物产物易分开，产物中无残留酶，易纯化，产品质量高。

③稳定性提高，反复使用多次后，酶的活力无明显下降；④反应条件易于控制，可以自动控制，节约劳动力。

固定化酶的制备原则（1）必须注意维持酶的构象，特别是活性中心的构象。

（2）酶与载体必须有一定的结合程度。

酶的固定化既不影响酶的原有构象，又能使固定化酶能有效回收贮藏，利于反复使用。

（3）固定化应有利于自动化、机械化操作。

这要求用于固定化的载体必须有一定的机械强度，才能使之在制备过程中不易破坏或受损。

（4）固定化酶应有最小的空间位阻。

（5）固定化酶应有最大的稳定性。

在应用过程中，所选载体应不和底物、产物或反应液发生化学反应。

（6）固定化酶的成本适中。

⒊酶和细胞固定化方法酶和细胞固定化方法载体结合法交联法包埋法网格型微囊型物理吸附法离子结合法共价结合法热处理（细胞）酶和细胞固定化模式（ 1 ）吸附法通过载体表面和酶分子表面间的次级键相互作用而达到固定目的的方法，是固定化中最简单的方法。

吸附法又可分为物理吸附法和离子吸附法。

物理吸附法●物理吸附法(physical adsorption)是通过非特异性物理吸附作用将酶直接吸附在水不溶性载体表面上而使酶固定化的方法。

包括范德华力、疏水相互作用、氢键。

●物理吸附法常用的载体：➢有机载体：纤维素、胶原、淀粉及面筋等；➢无机载体：活性炭、氧化铝、皂土、多孔玻璃、硅胶、二氧化钛、羟基磷灰石等。

离子吸附法离子吸附法(ion adsorption)是通过离子键使酶与含有离子交换基团的水不溶性载体相结合的固定化方法。

阴离子交换剂：DEAE-纤维素啊，DEAE-葡萄糖凝胶等阳离子交换剂：羧甲基纤维素等此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、β-淀粉酶、纤维素酶等，在工业上用途较广。

●提高吸附量和酶与载体间吸附力的方法有：●1 控制好吸附与操作的条件：选择吸附量大的载体，酶量与载体的量，将载体进行分散处理，合适的pH、温度等；●2 开发新的载体：N-羟基琼脂糖衍生物吸附能力超强，经受1mol/L NaCl的洗脱，结合借助静电力、疏水键多种力协同发挥作用；●3 根据载体性质对酶进行适当的化学修饰：将胰蛋白酶等限于丙烯酸等物质进行共价欧联，再与DEAE-纤维素等结合后，结合能力大大增强。

吸附法的优点：操作简单，条件温和，吸附剂可再生反复使用。

吸附法的缺点：酶和载体的吸附力比较弱，容易在不适宜的pH、高盐浓度、高底物浓度或高温条件下解析脱落，易导致催化活力的丧失和污染反应产物等后果。

（ 2 ）包埋法包埋法（entrapment）是将酶包埋在高聚物的细微凝胶网格中或高分子半透膜内的固定化方法。

前者又称为凝胶包埋法，酶被包埋成网格型；后者又称为微胶囊包埋法，酶被包埋成微胶囊型。