GST-pull down 方案 方法 流程

GST-pull down 技术
一大量制备GST蛋白
1 活化冻存菌种GST和GST-X：按1：50比例将表达蛋白的冻存菌液加入5ｍｌＬＢ（Ａｍｐ＋），37℃，140~150rpm培养过夜
2 将过夜培养物按1：100比例接入200mlＬＢ（Ａｍｐ＋），220rpm，30℃培养至OD600=0.4-0.6
3 以预实验确定的最佳IPTG浓度、时间和温度诱导表达靶蛋白。

（IPTG 0.5mM，20℃,150rpm 培养10~16小时）
4 诱导适当时间后，4℃，5000g离心10min后弃上清。

（如需要该步沉淀能保存在-80℃）
5 重悬沉淀：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬
6 冰上超声沉淀重悬液：2S 间隔1S 至悬液透明（一般可容性蛋白：10ml菌液沉淀用1ml PBS重悬液超声６～９min可透明）
7 10,000g*10min离心上清转移至新的离心管，加DTT至终浓度1mmol/L
二谷胱甘肽-琼脂糖树脂的处理
1 轻轻颠倒树脂盛装容器，混成匀浆
2 取适量匀浆放入离心管中，4℃，500g离心5min后弃上清（每10ml 细菌培养物可以用50ul匀浆）
3 每1.33mL 初始匀浆加入10 mL 4℃预冷的PBS，颠倒混匀后，4℃，500g离心5min后弃上清（50ul初始匀浆用400ulPBS洗）
4 每1.33mL 初始匀浆加入1 mL 冷的PBS，制成50%匀浆，颠倒混匀置冰上放置待用。

（50ul初始匀浆加入40ulPBS）
三结合GST蛋白
1 上清与适量50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂匀浆混合，4℃轻摇30min（可过夜让其充分结合）。

2 4℃，500g离心5min后弃上清
3 沉淀加入10倍床柱体积PBS（1床柱体积=0.5*50%匀浆体积）(50ul初始匀浆用400ulPBS 洗），颠倒混匀以洗去未与树脂结合的杂蛋白（每次可在混旋仪上混匀５min)
4 4℃，５00g离心5min后弃上清
5 重复步骤3和4两次，共三次
四预清除细胞裂解液
1 将细胞裂解液与50ul的和GST结合的50%谷胱甘肽-琼脂糖树脂悬液在4℃翻转混合孵育2h。

（需要检测相互作用的裂解液的量是高度可变的。

开始用相当于1*106~1*107个细胞的裂解液。

）
2 离心，4℃，13，000rpm *2min
3 将上清转移到新的离心管中
五探测细胞裂解液
1 设定两个等量预清除的细胞裂解液分别加入到结合GST和GST-X蛋白的谷胱甘肽-琼脂糖树脂中，4℃翻转混合孵育2h（时间可适当延长，如过夜以让其充分结合）
2 离心，4℃，13，000rpm *2min
3 用1ml冰冷的细胞裂解液洗涤，4℃，13，000rpm *2min，弃上清，重复洗三次
4 加入50ul的2*Loading Buffer。

轻弹混匀，沸水煮5~10min，离心后收集上清。

SDS-PAGE分离相互作用蛋白
Western-Blot检测靶蛋白。