实验室分子生物学实验基本操作要求规范及注意事项

实验室分子生物学实验基本操作规范及注意事项

一、酶与载体的分装

酶类与载体：T载体(50 ng/μl)用灭菌水稀释4倍（12.5 ng/μl）后分装成10 μl或20 μl；

连接酶（solutionΙ）按5 μl分装；

dNTP（10 mM）分装成50 μl；

无菌水分装成1 ml；

注意：（1）所有分装都必须用已灭菌的管。

（2）所有工具酶和载体的使用过程均在冰浴中进行。

（3）工具酶、载体以及试剂盒等实验室共用物品，用完后必须及时放回原处，以免耽误他人使用。

（4）当你发现你使用的是最后一管（盒）公用物品时，请马上告知负责人购买，以免耽误使用。

（5）感受态，氨苄青霉素和IPTG由研究生轮流负责制备。每人负责六个月。其他试剂则由第一位使用新包装的同学分装。由于分子实验工具酶比较容易失活，必须在冰上进行分装。

二、常见抗生素及IPTG的配置

以氨苄青霉素为例：

1．准备足够量的1.5 ml的EP管、两个100 ml的离心管、0.22 μm水系滤器、注射器、蒸馏水，以上用品均要进行高压灭菌。

2. 洁净工作台紫外灭菌，然后进行以下操作。

3．称取2 g的氨苄青霉素粉末于离心管中，加入灭菌水至总体积为20 ml，轻摇离心管，至氨苄青霉素粉末完全溶解，以免过滤时堵塞滤膜。

4．用注射器吸取配制好的溶液，然后把滤器安在注射器上，缓缓推动注射器活塞，把溶液经滤膜推至100 ml的离心管中。

注意：动作要缓和，使滤出液出口正对着离心管，还要防止染菌。

5．把100 ml离心管中已除菌的氨苄青霉素溶液分装到1.5 ml的EP管中，每管

0.5 ml。在EP管上做好标记，包括名称、浓度、日期等。

6．把做好标记的盛有氨苄青霉素的EP管于-20℃保存。

注意：当你发现你使用的是最后一管抗生素时，请马上告知有关人员及时配制，以免耽误使用。

表1.常见抗生素的储存浓度及工作浓度

名称储存浓度工作浓度

氨苄青霉素（ampicillin）100 mg/ml 50 μg/ml～100 μg/ml

卡那霉素（kanamycin）10 mg/ml 10 μg/ml～50 μg/ml

氯霉素（chloramphenicol）25 mg/ml 12.5 μg/ml～25 μg/ml

链霉素（streptomycin）50 mg/ml 10 μg/ml～50 μg/ml

四环素（tetracyyline）10 mg/ml10 μg/ml～50 μg/ml

IPTG 1 M 0.05-0.6 mM

三、分子生物学实验中各种试剂与溶液的配制

分子生物学实验中各种试剂与溶液的配制参见《分子克隆》。

四、总DNA的提取

具体步骤参考试剂盒说明书。注意：革兰氏阳性菌DNA提取时需要加溶菌酶。

五、基因扩增

1．引物与合成：设计引物序列，发至生工公司进行合成（jinan@）。2．引物配制：合成后的引物先离心至管底，然后按说明书用无菌水稀释至10-50μM，分装至无菌EP管中，做好标记（一定要标记浓度！）后，于-20度保存备用。

3． PCR反应体系配制：将所需各组分在冰浴中化开后，进行PCR反应体系配制。反应体系及反应参数按不同聚合酶的说明书进行，以transgen 的easyTaq酶扩增1kb基因序列为例，100 μl反应体系为：10×buffer 10 µl，dNTP (10 mM) 2 µl,引物各2 µl （10-50μM），模板1 µl（根据浓度

O 82 µl（注意：加入顺序为：水，buffer，加减体积），Taq酶1 µl，ddH

2

dNTP，引物，模板，酶）。涡旋混匀，分装至四-五管，瞬时离心。

注意：若反应时间较长在反应混合液的上层加10-20 µl 的矿物油防止样品在PCR的过程中蒸发。

4．将管放入PCR仪中，在PCR仪上设置好PCR反应参数，例如：94 ℃ 5 min，

94 ℃ 40 sec，Tm 55℃ 1 min， 72 ℃ 2 min，72 ℃ 10 min，16 ℃ 1 h,

一般设30个循环。待温度降至16 ℃后停止PCR仪，尽快取出样品，不允许过夜。

六、琼脂糖核酸电泳

1. 电泳缓冲液的配制：电泳缓冲液一般为TAE（或TBE）,其配制方法参见

表2，先配制50×母液放于4度冰箱中，电泳时稀释100倍使用。

2. 将制胶模具和梳子冲洗干净，架好梳子；

3. 根据欲分离DNA片段大小用凝胶缓冲液配制适宜浓度的琼脂糖凝胶（表

3）：准确称量琼脂糖干粉，加入到配胶用的三角烧瓶内，定量加入电泳缓冲液；

4．放入到微波炉内加热至胶粒全部熔化(一般沸三次即好),冷却片刻，倒入制胶模具中，待其凝固；

a)室温下30-45分钟后凝胶完全凝结，小心拔出梳子，将凝胶安放在

电泳槽内；

b)向电泳槽中倒入电泳缓冲液，其量以没过胶面1 mm为宜，如样品孔

内有气泡，应设法除去；

c)在DNA样品中加入1/5-1/10体积的上样缓冲液（1% SDS, 50%甘油,

0.05%溴酚蓝），混匀后，用枪将样品混合液缓慢加入被浸没的凝胶

加样孔内；

5．接通电源，红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负)。根据胶的长度设定电压，一般5-8 V/cm，电泳20-40 min, 溴酚蓝跑完胶板的3/4左右即可；

6．电泳完毕，关上电源，戴上手套，将胶放入0.5 μg/ml的溴化乙锭(EB)溶液中，室温下染色5-10 min。

7．蒸馏水中漂洗一下，置于紫外灯下或凝胶成像仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准Marker比较被扩增产物的大小。如果要切胶回收，最好在观察台上铺上塑料片观察，防止污染以及紫外灯引起DNA突变。

注意：溴化乙锭（EB）有剧毒，操作时应注意安全，戴手套操作。但是要避免污染染色池和切胶板以外的区域。操作完后手套和胶分别放入垃圾桶和回收桶。

表2. 电泳缓冲液TAE配方