香蕉枯萎病镰刀菌ITS序列的PCR扩增及其分子检测

ＰＣＲ 扩 增 反 应 产 物 于 含 有 ０．３
ｎｇ／ｍＬ ＧｏｌｄＶｉｅｗ （ 北 京 赛 百 盛 基 因 技 术 有 限 公 司 ）
的 １％ 琼脂糖胶上进行电泳 ， 点样量为 ５ μ Ｌ 反应液 和２μ Ｌ Ｌｏａｄｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ， 电 泳 缓 冲 液 为 ＴＢＥ 缓 冲 液 （０．０８９ Ｍ Ｔｒｉｓ－ｂｏｒａｔ， ０．０８９ Ｍ ｂｏｒｉｃａｃｉｄ 和 ０．００２
第 １３ 卷 第 ３ 期
Baidu Nhomakorabea
华 南 热 带 农 业 大 学 学 报
２００７ 年 ９ 月 Ｓｅｐ．２００７
Ｖｏｌ．１３ Ｎｏ．３
ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＳＯＵＴＨ ＣＨＩＮＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＴＲＯＰＩＣＡＬ ＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＥ
香蕉枯萎病镰刀菌 ＩＴＳ 序列的 ＰＣＲ扩增及其分子检测 ＊
王国芬 彭 军 代 鹏 邓国平 黄俊生 ＊＊
５７１７３７） （中国热带农业科学院环境与植物保护研究所
摘要
海南儋州
根 据 香 蕉 枯 萎 病 菌 （Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ． ｓｐ． ｃｕｂｅｎｓｅ） ＩＴＳ 序 列 设 计 合 成 的 三 条 引 物 ： ＦｕｓＦ１ （５′ ＡＡＣＣＣ
ＧＡＧＧＡＡＣＧＣＧＡＡＴＴＡＡＣＧＣＧＡＣ３′ ） 和 ＦｕｓＲ２ （ ５′ ＧＡＣＧＡＴＴＡＣＣＡＧＴＡＧＣＧＡＧＧＧＴ３′ ＣＴＧＴＧＡＡＣＡＴＡＣＣＡＣＴＴＧ３′ ） 、 ＦｕｓＲ１ （５′ ） 构成
［８］ ［５］ ［２］ ［３］ ［４］
１ １．１
材料与方法 供试材料 供试尖饱镰刀菌菌株由分离自不同寄主的不同
专化型组成 ， 其它种属菌株均是分离自香蕉和芒果 等作物致病菌的单菌落纯培养 ， 见表 １ 。
１．２ １．２．１
方法 不同供试菌株取单孢培养菌落的菌丝体提 用 １．０％ ＮＨ４ＮＯ３， ０．５％ Ｋ２ＨＰＯ４，
析技术 ， 华南农业大学的周鸿飞等也做过相关的检 测研究 ， 但至今尚无详细的文献报道。本试验通过 对致病性镰刀菌 ＩＴＳ 序列的克隆分析 ， 设计了两对 引物 ， 对香蕉镰刀菌枯萎病有较高的灵敏性和特异
１．２．２
ＤＮＡ 提 取
取 ２０ ｍｇ 菌 丝 或 组 织 干 粉 于
２．０ ｍＬ 离心管中 ， 加入 ４００ μ Ｌ ６５ ℃ 预热提取缓冲
Fusarium oxysporum f. sp. cubense(race1) Fusarium oxysporum f. sp. cubense(race4) Fusarium oxysporum f. sp. melonis Fusarium oxysporium f.sp. lycopersici Fusarium oxysporum f. sp. dioscorea batata Fusarium oxysporum f. sp. cucumerinum Fusarium oxysporum f. sp.vasinfectum Fusarium moniliforme Fusariumequiseti Colletotrichum musae Botryodiplodia theobromae Aspergillus niger Fus007- Fus010 /012 !
1 4

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ＮａＣｌ； ５０ ｍｍｏｌ Ｌ－１ ＥＤＴＡ； １％ ＰＶＰ） 悬浮干粉 ， 混匀 ， ・
加入终浓度为 ２％ 的 １０％ ＳＤＳ（ 约 ８０ μ Ｌ）， ６５ ℃ 温育
取 全 基 因 组 ＤＮＡ
０．２５％ ＭｇＳＯ４， ３％ 葡萄糖培养基接种菌丝后 ２５ ℃ 振
荡培养 ３ ｄ， 产生的大量菌丝 ， 过滤后于冷冻干燥 机上冻干 ４０ ｈ 。感病植株采自海南省乐东市郊区蕉 园 ， 分别取其根、球茎、假茎和叶片 ０．１ ｇ 提取模 板 ＤＮＡ。病组织及干燥后的菌丝体经液氮研磨成粉 状。
２ ２．１
结果与分析 引物专化性 Ｐ ＣＲ 扩增 图 １ 为两对引物对引起香蕉枯萎病的病原菌
Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ． ｓｐ． ｃｕｂｅｎｓｅ １ 号和 ４ 号生理
小种 ｇＤＮＡ 的 ＰＣＲ 扩增反应结果 ， 图中显示两对引 物对两个生理小种都 分 别 有 长 度 大 约 为 ３００ ｂｐ 和
ｍＭ）。 反 应 总 体 积 为 ２５ μ Ｌ （１８ μ Ｌ ｄｄＨ２Ｏ， ２．５ μ Ｌ ｄＮＴＰ， ２．５ μ Ｌ １０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ， ０．５ μ Ｌ Ｔａｑ ＴＭ， ２０ Ｌ， 模 板 ＤＮＡ 为 ２５ ｎｇ）， ＰＣＲ 反 ｐＭ 的 引 物 各 ０．５ μ
应在 Ｂｉｏｍｅｔｒａ ＴｇｒａｄｉｅｎｔＰＣＲ 仪中进行 ， 扩增体系 为 ９４ ℃ 预变性 ４ ｍｉｎ， ９４ ℃ 变性 ３０ ｓ ， ５８ ℃ 退火
在对感病植株不同组织部位总 ｇＤＮＡ 的检测中 ， 两对引物的敏感性不同 ， 引物 Ａ 只对病体组织中病 根有扩增结果 ， 而引物 Ｂ 则对病根、球茎和假茎低 丰度病菌 ＤＮＡ 都有特异性的扩增片段 ， 两个结果清 晰 ， 且对寄主基因组 ＤＮＡ 无假阳性扩增（ 见图 ４） 。
２．３
引物检测灵敏度测定 图 ３ 为两对引物对 Ｆ１ 模板 ＤＮＡ 稀释不同倍数
３
结论与讨论 应用核糖体 ｒＤＮＡ 的 ＩＴＳ 序列的保守性作为植
后的 ＰＣＲ 反应结果 ， 表明 ， 引物对 Ｂ 模板 ＤＮＡ 浓度 稀释到 １０ 浓度为 １０ ｐｇ 时有明显的扩增片断 ， 引
－５
物病原菌的鉴定检测手段 ， 已经在植物病害的研究 中广泛应用 ， 朱有勇等 ［９］以 ＩＴＳ 序列设计合成的引 物 能 对 引 起 棉 花 黄 萎 病 的 大 丽 轮 枝 菌 （Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ
物 Ａ 在模板浓度为 １００ ｆｇ 时 仍 有 扩 增 产 物 。 试 验 结果表明引物对目的菌株有着较高的灵敏度 ， 能检 测到较低丰度的目的 ＤＮＡ 模板量。
ｄａｈｌｉａｅ ） 进 行 有 效 的 分 子 鉴 定 和 分 子 检 测 ； 易 建
平 ［１０］结合线粒体 ＤＮＡ 和核糖体 ＤＮＡ ＩＴＳ 序列的特异 性引物对小麦腥黑穗病的检测有着较高的检测灵敏 度 。 Ｋａｍｅｌ Ａ ［２］ 根 据 ＩＴＳ 序 列 设 计 合 成 的 引 物
中图分类号
Ｓ４３６．６７
由 尖 镰 孢 古 巴 专 化 型 （Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ．
性。对香蕉枯萎病的快速检测提供了良好的技术方 法 ， 在国内对于香蕉枯萎病菌的分子检测及其感病 植株的早期检测的报道尚属首次。
ｓｐ． ｃｕｂｅｎｓｅ） 引起的枯萎病是制约香蕉生产 的 一 种
毁灭性病害 ， 是一种真菌性土传病害 ， 病菌从根部 危害 ， 引起维管束褐变和系统侵染 ， 造成植株整株 枯死 ， 目前国内以小种 １ 号和 ４ 号危害最为严重［１］。 通常由感病植株的症状变化来鉴定此病 ， 但是产生 典型症状的植株往往已到发病后期 ， 而且可能已经 威胁到其它的植株 ， 因此对该病的早期检测诊断就 显得尤为重要。 利用核糖体 ｒＤＮＡ 序列在物种进化中的保守性 和易变性 ， 及其在系统发育中具有种级以上阶元标 记的特性 ， 设计引物 ， 用于植物病害的早期检测 ， 已经在棉花 、番茄 、西瓜 等 作 物 的 病 害 检 测 中得到了应用。在香蕉枯萎病的研究 中 漆 艳 香 、 谢艺贤 ［６］及 Ｂｅｎｔｌｅｙ Ｓ［７］等 ， 利用 ＲＡＰＤ－ＰＣＲ 方法对 香蕉枯萎病菌 ２ 个生理小种间的亲缘关系进行了研 究 ， 刘景梅等 建立了广 东 香 蕉 枯 萎 病 菌 ＲＡＰＤ 分
３０～４０ ｍｉｎ。 １２ ０００ ｇ ４ ℃ 离心 １０ ｍｉｎ。取上清加
入 １／５ 倍体积 ５×ＣＴＡＢ（５％ ＣＴＡＢ ； １．０ ｍｏｌ Ｌ ＮａＣｌ； ・
－１
５０ ｍｍｏｌ・ Ｌ－１ ＥＤＴＡ， ｐＨ８．０； ２５０ ｍｍｏｌ・ Ｌ－１ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ， ｐＨ８．０）６５ ℃ 继 续 温 育 １０ ｍｉｎ， 冷 却 后 加 苯 酚 ∶ 氯
１．２．４
Ｐ ＣＲ 扩增条件
ＴＭ
ＰＣＲ 扩增反应采用大连宝
生物基因工程有限公司 ＴａｑＤＮＡ 聚合酶产品 ， 包括
４００ ｂｐ 的扩增片段。 ２．２
引物种属特异性扩增 图 ２ 应用两对引物对镰刀菌及其它植物病原菌
ＴａＫａＲａ Ｔａｑ
５ Ｕ／μ Ｌ， １０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋Ｐｌｕｓ），
ｄＮＴＰＭｉｘｔｕｒｅ（ 含 ｄＡＴＰ、 ｄＣＴＰ、 ｄＧＴＰ 和 ｄＴＴＰ 各 ２．５
引 物 对 Ａ（ＦｕｓＦ１／Ｒ１） 和 Ｂ（Ｆｕｓ Ｆ１／Ｒ２） ， 对 尖 廉 孢 菌 古 巴 专 化 型 病 菌 进 行 ＰＣＲ 特 异 扩 增 试 验 ， 结 果 表 明 ， 两 对 引 物对引起香蕉枯萎病 的镰刀菌全基因组 ＤＮＡ 分别有 ３３８ ｂｐ 和 ４０８ ｂｐ 的特异扩增产物 ； 在镰刀菌种以上的阶元有 较好的分辨 力 ； 对目标菌株的检测下限分别是 Ａ（１００ ｆｇ） 、 Ｂ（１０ ｐｇ） ； 而 且 Ｂ 对 香 蕉 感 染 枯 萎 病 的 病 组 织 有 相 应 的扩增产物 ， 表明该引物对可用于香蕉枯萎病的早期鉴定和病原菌的检测。 关键词 香蕉镰刀性枯萎病 香蕉感病组织 特异扩增 分子检测
２．４
感病植株的检测
ＩＴＳ－Ｆｕ－ｆ 和 ＩＴＳ－Ｆｕ－ｒ 在对引起棉花枯萎病的病原
菌 （Ｆ． ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ． ｓｐ． ｖａｓｉｎｆｅｃｔｕ） 检测专化性和灵 敏性做了深入研究。
图１ 引物专化性 Ｐ ＣＲ 扩增
本试验结果和大量报道均表明， 应用核糖体
－ ＣＫ 为超纯水负对照，ａ 为引物 Ａ，ｂ 为引物 Ｂ， １ 和 ２ 分别为菌株 Ｆｕｓ００３ 和 Ｆｕｓ００４
ｍｉｎ。在上清液中加入 ０．６ 倍体积的预冷无水乙醇
沉淀 ＤＮＡ（ 室温放置 ３０ ｍｉｎ）， １２ ０００ ｇ ４ ℃ 离心 １０
ｍｉｎ。 取 沉 淀 ， 加 ７０％ 乙 醇 洗 ２ 遍 ， 干 燥 ， ＴＥ （１０ Ｌ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ， ｐＨ８．０； ０．１ ｍｍｏｌ・ Ｌ ＥＤＴＡ） 溶 ｍｍｏｌ・
第３期
王国芬 等：香蕉枯萎病镰刀菌 ＩＴＳ 序列的 ＰＣＲ 扩增及其分子检测
３
ｇＤＮＡ 的 ＰＣＲ 扩增结果表明 ， 两对引物对镰刀菌属
的尖镰孢菌小种都有特异性的目的扩增片段 ， 对其 它植物致病菌以及镰刀菌的其它小种无明显的扩增 产物。说明两对引物对尖镰刀菌有较高的特异性 ， 但对不同专化型的生理小种的区分能力有限。
－１ －１
Ｍ ＥＤＴＡ） 。 电 泳 结 束 后 ， 于 紫 外 成 像 仪 上 观 察 结 果
并扫描于计算机软件中保存。
解 ＤＮＡ， －２０ ℃保存。
１．２．３
引物设计与合成
根据真菌通用引物 ＩＴＳ１
和 ＩＴＳ４ 扩增的产物克隆测序结果 ， 通过与网上公 布的其他镰刀菌 ＩＴＳ 序列的比对 ， 设计一个正向引 物 ＦｕｓＦ１， 两个反向特异 引 物 ＦｕｓＲ１ 和 ＦｕｓＲ２。 测 序由大连宝生物基因工程有限公司完成 ， 引物由赛 百盛生物工程有限公司合成。
仿∶异戊醇（２５∶２４∶１） 反复颠倒充分混匀 ， １２ ０００
５０ ｓ， ７２ ℃ 延伸 １ ｍｉｎ， ３５ 个循环后 ７２ ℃ 延伸 １０ ｍｉｎ， 最后于 ４ ℃保存。 １．２．５
结果检测
ＴＭ
ｇ ４ ℃ 离 心 １０ ｍｉｎ。 取 上 清 液 ， 再 加 等 体 积 的 氯
仿 ∶ 异 戊 醇 （２４∶１） 抽 提 。 １２ ０００ ｇ ４ ℃ 离 心 １０
液 （５０ ｍｍｏｌ ・ Ｌ－１ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ，
ｐＨ８．０； １．０ ｍｏｌ ・ Ｌ－１
＊ 中国热带农业科学院科技基金项目，编号：Ｒｋｙ０６１６；科技部农业微生物资源平台项目，编号：２００４ＤＫＡ３０５６０－ ８。 ＊＊ 通讯作者。
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华南热带农业大学学报
第 １３ 卷
Fus003 Fus004 Fus005 Fus007 Fus008 Fus009 Fus010 Fus001 Fus002 X009 Mac001 Rhi008 ,-.