标准菌种确认标准操作规程完整

一目的

建立标准菌种确认标准操作规程，以减少菌种污染和生长特性的改变，保证实验结果的可靠性和准确性。

二围

本规程适用于质量控制实验室所用标准储备菌株。

三容

1.1 试验菌株

大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44102]

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC(B)26003]

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]

白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)64941]

黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104]

生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(F)98001]

1.1.1 标准菌株

1.1.1.1 标准菌株应来自认可的国或国外菌种收藏机构。

1.1.1.2 标准菌株经过复活并在适宜的培养基中生长后，即为标准储备菌株。

1.1.1.3 标准储备菌株应进行纯度和特性确认。

1.1.2 工作菌株

1.1.

2.1 标准储备菌株可用于制备每两个月或定期转种的工作菌株。

1.1.

2.2 工作菌株的传代次数应严格控制，不得超过 5 代（从菌种收藏机构获得的标准菌

株为第0代），以防止过度的传代增加表型变化的风险。因此必要时，应对工作菌株的纯度和

特性进行确认。

1.2 菌种确认试验的主要容

1.2.1 菌种的纯度确认

1.2.1.1 纯度检测：是指通过适当的方法检测菌种是否为纯培养物。

1.2.1.2 试验容

①菌落形态：在特定的培养基上，将待检测培养物稀释涂布或平板划线，适宜培养后，同一平板上的单菌落的大小、形状、颜色、质地、光泽等是否相似；对于两种或以上形态的出发菌株，应再分别挑取单菌落划线或稀释涂布培养，检测是否重复出现相同特征。

②镜检特征：对数生长期的培养物革兰氏染色反应应呈现一致性；细胞形状、大小、荚膜、芽孢等特征应相似。

1.2.2 菌种的特性确认

1.2.2.1 生化试验：各种微生物具有各自的独特的酶系统，因而在代过程中所参与的物质分解和合成代的产物也不同，这些代产物又具有不同的生化特征。根据此特征，利用生物化学方法来鉴定不同的微生物的试验即为微生物的生化试验。

1.3 菌种的确定方法

用无菌接种环粘取培养物，在相应的培养基平板上划线分离单个菌落，并在适宜条件下培

养。培养后观察是否具有典型的菌落形态，然后挑取单一纯菌落，进行革兰氏染色、镜检，观察其染色特性及菌形。再做生化试验或使用菌种鉴定系统进一步鉴定菌种。

1.3.1 大肠埃希菌的确认

1.3.1.1 菌落形态

1.3.1.1.1 取大肠埃希菌新鲜培养物至营养肉汤培养基中，经35℃培养18～24h后，形成菌膜，管底有粘液状沉淀，培养物有粪臭味。

1.3.1.1.2 取上述培养物接种于曙红亚甲蓝琼脂(EMB)琼脂平板和麦康凯琼脂平板上，35℃培养18～24h后，观察结果。

①曙红亚甲蓝琼脂(EMB)平板上菌落形态呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色,菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑、湿润，常有金属光泽。

②麦康凯琼脂平板上菌落形态呈鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。

1.3.1.2 革兰染色、镜检

1.3.1.

2.1 革兰染色

①以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上，取菌落形态（①、②）的培养物少许，制成均匀涂片，自然或微温，再通过火焰2～3次干燥使固定。

②滴加结晶紫染液，染色1min，水洗。

③滴加碘液，媒染1min，水洗，以滤纸吸干余水。

④滴加95﹪乙醇，脱色20～30s，至流出液无色，水洗。

⑤滴加沙黄染液，复染1min，待干后，镜检。

1.3.1.

2.2 染色结果应是：革兰阳性菌呈蓝紫色：革兰阴性菌呈红色。

1.3.1.

2.3 镜检结果应是：两端钝圆的短小直杆菌，单个或成对，革兰阴性，无芽孢，多有鞭毛，以周身鞭毛运动或不运动，许多菌株有荚膜和微荚膜。

1.3.1.3 生化试验

1.3.1.3.1 靛基质试验（I）：取菌落形态（①、②）的培养物接种于蛋白胨水培养基中，培养24-48h，沿管壁加入靛基质试液数滴，轻轻摇动试管，液面呈玫瑰红色为阳性，呈试剂本色为阴性。

1.3.1.3.2 甲基红试验（M）：取菌落形态（①、②）的培养物接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2h，于培养液中加入甲基红指示液2～3滴（约1ml培养液加指示液1滴），轻微摇动，立即观察，呈鲜红色或橘红色为阳性，呈黄色为阴性。

1.3.1.3.3 乙酰甲基甲醇生成试验（V-P）：取菌落形态（①、②）的培养物接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中，培养48±2h，，于2ml培养液中加入α-萘酚乙醇试液1ml，混匀，再加40%氢氧化钾试液0.4ml，充分振摇，在4h（通常在30min）出现红色应判为阳性，无红色反应为阴性。

1.3.1.3.4 枸橼酸盐利用试验（C）：取菌落形态（①、②）的培养物接种于枸橼酸盐培养基斜面上，培养2-4天，培养基斜面有菌苔生成，培养基由绿色变为蓝色时为阳性，培养基颜色无改变、无菌苔生长为阴性。

1.3.1.3.5 乳糖发酵试验：取菌落形态（①、②）的培养物接种于乳糖发酵管，培养24-48h，观察产酸（指示剂为酸性品红者为红色：指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色），产气（小倒管有气泡，气泡无论大小都是产气）。

1.3.2 金黄色葡萄球菌的确认

1.3.

2.1 菌落形态