基因功能分析的基本策略
基因网络的结构与功能分析
基因网络的结构与功能分析基因网络是指由多个基因及其相互作用所构成的复杂系统，是研究基因调控和生物进化的重要手段之一。
随着生物信息学技术的迅速发展，对基因网络的研究已经成为了生命科学研究的热点之一。
本文将介绍基因网络的结构与功能分析方法。
一、基因网络结构分析基因网络结构分析是研究基因网络的建模、构建和分析方法，通常包括以下步骤：1. 数据收集：基因网络的结构分析需要收集大量的基因表达数据和生物信息数据，可以使用DNA芯片、RNA测序、质谱等技术。
2. 基因网络构建：基因网络构建是基于基因表达数据和生物信息数据建立基因网络的过程。
目前常用的方法有互作蛋白质网络、共表达网络、调控网络等。
3. 基因网络可视化：基因网络的可视化能够使人们更加直观地理解基因网络的结构和特点，目前较常用的可视化软件有Cytoscape等。
4. 基因网络富集分析：基因网络富集分析可以对基因网络中某一特定功能模块的特征进行分析，例如对基因调控的功能模块分析可以揭示基因调控的关键基因和调控因子。
5. 基因网络结构分析：基因网络结构分析可以对网络的连通性、度分布、聚集系数等结构特征进行研究，分析网络中存在的小世界效应、无标度网络等特征。
二、基因网络功能分析基因网络的功能分析是根据基因网络结构研究其生物功能和生物学过程的过程。
目前较常用的基因网络功能分析方法有以下几种：1. 基因调控路径分析：基于基因网络分析调控途径，可以识别出调控因子和调控基因的关联关系，进而研究基因调控的生物过程。
2. 基因共表达网络分析：根据基因表达谱构建基因共表达网络，可以分析基因之间的相互关系，推断基因的相互作用和生物过程。
3. 基因集富集分析：基于基因网络对基因上下家路径、生物通路等进行分析和富集分析，可以揭示基因网络中存在的生物过程和功能模块。
4. 生物网络拓扑分析：分析不同生物网络的拓扑学特征，例如小世界、无标度、随机网络等，可以揭示生物网络的特殊性质和生物过程的特性。
基因功能研究的整体解决方案
BamHI
Sal I
Bgl II
XhoI
Sal I
2
BamHI
Bgl II
XhoI
Sal I BamHI
1
2
Bgl II XhoI
A）miRNA的串联
B ）miRNA串联试验结果
13
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Life Technologies Proprietary & Confidential
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miRNA载体特点-组织特异性表达miRNA
9
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Life Technologies Proprietary & Confidential
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BLOCK-iT™ miR RNAi Select
1. BLOCK-iT™ miR RNAi Select ：在Invitrogen网站的数据库里边 有已经设计好了的针对不同基因的oligo DNA（4对/一套）； Oligo DNA可以用来插入到BLOCK-iT™ Pol II miR RNAi Expression载体里边，进行RNAi研究。
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RNAi Vector + RNA合成
standard siRNA
(21-mer overhangs)
Stealth™ RNAi
(25-mer blunt)
shRNA expression
miRNA expression
5
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Life Technologies Proprietary & Confidential
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体外合成RNAi vs. RNAi载体
体外合成RNAi 长效稳定沉默 RNAi载体
可调控的沉默
导入到难转染的细胞 沉默效果快速而强力 最高特异性 容易操作
多基因遗传病基因研究的策略和方法
多基因遗传病基因研究的策略和方法多基因遗传病是由多个基因的遗传变异所致的疾病，其研究策略和方法主要包括以下几个方面：1.基因组关联分析（GWAS）GWAS是一种广泛应用于多基因遗传病研究的方法，它通过对大量样本进行基因组分析，寻找与疾病相关的基因位点。
GWAS可以发现与疾病相关的单核苷酸多态性（SNP），从而确定疾病的遗传风险因子。
GWAS的优点是可以发现新的遗传变异，但其缺点是只能发现单个基因的影响，而无法考虑基因之间的相互作用。
2.基因组学数据整合分析基因组学数据整合分析是将不同来源的基因组学数据整合起来，以发现与疾病相关的基因和通路。
这种方法可以将GWAS、转录组、蛋白质组等多种数据整合起来，从而更全面地了解疾病的遗传机制。
3.基因组学功能研究基因组学功能研究是通过对基因的功能进行研究，以了解其在疾病发生和发展中的作用。
这种方法包括基因敲除、基因表达调控、蛋白质相互作用等实验手段，可以揭示基因在疾病中的作用机制。
4.系统生物学分析系统生物学分析是将基因组学数据与生物学网络相结合，以了解基因之间的相互作用和通路。
这种方法可以揭示疾病的复杂性和多样性，从而为疾病的预防和治疗提供新的思路。
总之，多基因遗传病的研究需要综合运用多种方法和技术，以全面了解疾病的遗传机制和发展规律。
基因功能分析的基本策略课件(共 71张PPT)
RNAi 是真核生物中广泛存在的现象
植物：干扰因素自叶脉向外扩散，绿色荧光蛋白 线虫：左侧为 转基因线虫；右侧线虫则经 (GFP) GFP dsRNA 基因 Hela 细胞：经GFP ORC6 siRNA 作用后，细胞出现多核现象。 果蝇：右侧果蝇为野生型，左侧为 shRNA 造成的色素缺乏的 被抑制，显露出红色。 处理。部分细胞 RNAi 相关蛋白表达较低，仍有绿色荧光。 绿色为 tubulin， 缺陷型。 红色为 DNA。ORC6 细胞分裂调控蛋白。
检测的提示重组体存在的基因。GFP、 LacZ、AP、 LUC。
融合基因 (fusion gene): 将特定的目的基因与报告
基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完 整的转录单位。
动物转基因常用的载体
腺病毒载体 逆转录病毒载体 非病毒类载体：如质粒等。
2. 中游—基因转移、胚胎移植与建系
基本原理
转基因动物
基本过程
上游—基因改造和载体构建
中游—基因转移、胚胎移植与建系 下游—基因整合、表达的检测与细胞筛选
1. 上游—基因改造和载体构建
外源基因: 完整的转录单位, 由顺式作用元件、结构
基因和转录终止信号组成。
报告基因 (reporter gene) : 在表达载体中引入易于
第十二章
基因功能分析的基本策略
转基因模型是研究基因功能的主要手段
转基因生物： 外源基因导入生物体表达。 基因打靶： 外源基因替换内源基因。 基因敲除。 基因敲入。 基因沉默： 导入特定基因，抑制内源性基因表达。
第一节 转基因技术
转基因技术(transgenic technology)：将外源 基因导入细胞，随机整合到受体基因组内， 并随细胞分裂而遗传给后代。 细胞模型。 转基因动物。 转基因植物。
研究基因功能的实验方案
基因功能研究一般先用生物信息学分析对基因的结构和功能做预测，然后就要对我们的推测进行验证，如何验证一个基因的功能，目前最常用的基因功能研究策略为功能获得与功能失活。
1、功能获得策略是指将基因直接导入某一细胞或个体中，通过该基因在机体内的表达，观察细胞生物学行为或个体表型遗传性状的变化，从而鉴定基因的功能。
常用的功能获得的具体方法有基因过表达技术以及CRISPR-SAM技术等。
2、基因的过表达技术：基因过表达技术是指将目的基因构建到组成型启动子或组织特异性启动子的下游，通过载体转入某一特定细胞中，实现基因的表达量增加的目的，可以使用的载体类型有慢病毒载体，腺病毒载体，腺相关病毒载体等多种类型。
当基因表达产物超过正常水平时，观察该细胞的生物学行为变化，从而了解该基因的功能。
基因过表达技术可用于在体外研究目的基因在DNA、RNA和蛋白质水平上的变化以及对细胞增殖、细胞凋亡等生物学过程的影响。
可使用产品：过表达慢病毒、cDNA克隆（可用作ORF克隆）CRISPR-SAM技术：CRISPR-SAM系统由三部分组成：第一个部分是dCas9与VP64融合蛋白；第二个部分是含2个MS2 RNA adapter的sgRNA；第三个是MS2-P65-HSF1激活辅助蛋白。
CRISPR-SAM系统借助dCas9-sgRNA的识别能力，通过MS2与MS2 adapter的结合作用，将P65/HSF1/VP64等转录激活因子拉拢到目的基因的启动子区域，成为一种强效的选择性基因活化剂，从而达到增强基因表达的作用。
可使用产品：全基因Cas9 SAM-慢病毒文库2、功能获得两种方法的比较：基因的过表达技术与CRISPR-SAM技术都能达到基因表达的上调，但是由于基因的过表达技术使用的载体容量的限制，导致基因的过表达技术只能用于研究一定长度内的基因。
而CRISPR-SAM技术是通过增强目的基因启动子的转录而实现基因的过表达，可以不受基因大小的限制。
植物基因定位和基因功能分析的方法研究
植物基因定位和基因功能分析的方法研究随着现代生物学和遗传学的发展，人们对植物基因定位和基因功能分析的方法进行了深入研究，这不仅可以帮助人们更好地理解植物发育和生长的机理，还能为植物育种和生产提供有用的信息和工具。
本文将重点介绍当前主要的植物基因定位和基因功能分析方法。
一、植物基因定位方法1.遗传连锁图谱遗传连锁图谱是一种利用遗传标记来分析不同基因之间遗传联系的方法。
通过对多个遗传标记在植物基因组中的位置进行测定和分析，可以建立起一张遗传图谱，用于揭示不同基因之间的距离和相对位置。
这种方法通常使用分子标记进行，如限制性片段长度多态性（RFLP）、简单重复序列（SSR）、随机扩增多态性（RAPD）等等。
2.基因组关联分析基因组关联分析是一种利用大规模基因组数据来解析复杂性状遗传基础的方法。
这种方法可以在典型生境群体中寻找有影响的变异位点，并确定它们与复杂性状之间的关系。
这种方法使用的主要技术是基因芯片和全基因组二代测序等高通量技术。
3.定位克隆定位克隆是一种在表型、遗传连锁图谱和基因组关联分析的基础上，利用分子遗传学的技术从候选区域中精确定位基因的方法。
这种方法最初是通过描述多态性突变体的表型特征并与别的单基因遗传性神经病的解决方案进行议会比较，通过遗传性状继承模式的推断、基因组DNA库筛选和分子标记标示等技术逐渐细化到定位至遗传连锁图谱中的一个小区域或物理图谱上的一小段碎片。
目前随着技术不断升级，整个过程已经极度自动化，能够对基因进行深准碎片定位和氨基酸序列注释，进一步明确植物基因的功能和作用机制。
二、基因功能分析方法1.反相留出反向遗传（反相留出）是一种采用RNA干扰技术降低或抑制嘌呤和非嘌呤物种基因表达的途径。
这种技术利用RNAi的调控机制，特异性破坏mRNA分子，并通过RNA的剪切或配对等方式，实现对靶基因的抑制。
这种技术能够有效地研究基因在发育、生长、代谢等过程中的功能，并探究不同基因之间的互相作用。
新基因功能研究的策略和方法
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利用转基因技术，则可将外源基因引入动物体 内，建立携带而且能够遗传给子代旳转基因动物 模型，经过对转基因动物旳表型分析研究外源基 因旳功能，目前已经利用转基因技术建立了数千 种转基因动物，而且还能够经过在携带外源基因 旳载体上加上组织特异性开启子等手段，从而控 制外源基因在特定旳时间或特定旳组织器官体现。 利用转基因动物来研究基因功能旳优势在于它是 一种在活体水平上旳多维旳研究体系，能够从分 子到个体水平进行多层次、多方位旳研究。
同步，因为人类全基因组测序已经完毕，所以与其完全同源基因组DNA
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序列及其染色体定位信息，而无需进行荧光原位 杂交等基因染色体定位技术，进而还可经过分析 其内含子、外显子序列及其调整位点，推测其可 能旳基因体现调控方式。即经过此法拟定了富含 亮氨酸反复序列蛋白新基因旳基因组DNA序列及 其染色体定位。
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此类技术中最常用旳主要为反义寡核苷酸 （ASON）、核酶和RNA干扰（RNAi）技术。
然而，涉及这3种技术在内旳该类技术均具有 诱导干扰素和其他细胞因子体现等非特异性效应， 另外，它们也会因为作用与和靶分子序列相近旳分 子而产生脱靶效应，其中，ASON因使用剂量大，其 非特异性效应最大；而RNAi旳这两种副效应最小。
用expay软件分析氨基酸序列同源性
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主要是经过联网或数据库行蛋白质是基因功 能旳体现者和施行者，而蛋白质旳构造则是蛋白质 执行生物学功能旳基础，所以对新基因所编码蛋白 质旳功能域分析将对推测新基因功能提供极其有价 值旳信息。目前，已经有大量被发觉旳蕴藏于蛋白 质构造中旳与特定生物学活性有关旳所谓保守模体。
基因表达及功能分析基本策略
目录
Western blot基本程序
1. 蛋白质样品的制备 2. SDS-PAGE分离 3. 蛋白质转膜 4. 特异抗体（即第一抗体）与膜上的蛋白质（抗原）印
迹杂交 5. 再经偶联了可检测标记信号的第二抗体（即抗抗体，
商品试剂盒中多采用偶联辣根过氧化物酶的Ig） 6. 最后经与酶的底物反应而显影、成像，经扫描后获取
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目录
根据蛋白质芯片制作方法和用途不同，可将其分为 1. 蛋白质检测芯片 2. 蛋白质功能芯片两大类
蛋白质检测芯片包括: 1. 抗体芯片 2. 抗原芯片 3. 配体芯片 4. 碳水化合物芯片等
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目录ห้องสมุดไป่ตู้
2．双向电泳结合质谱普遍用于蛋白质表达 谱的分析和鉴定
目前比较和鉴定蛋白质表达谱更多采用双向聚丙烯酰 胺凝胶电泳结合质谱技术。双向聚丙烯酰胺凝胶电泳技术 又称二维电泳（two-dimensional electrophoresis, 简称2-D电 泳）。
➢虽然原位杂交在功能性方面提供的信息较少，但是该 技术还是被广泛用于组织中的基因表达分析，这是因 为其较高的稳定性、较广泛的靶点和组织适用性。
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目录
（二）两种变换的聚合酶链式反应是常用的 mRNA检测方法
1．反转录PCR
➢ 可用于mRNA的半定量分析
➢ 反转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR） 是 一种简单、快捷地对RNA进行定性、定量分析的方法。 它是以mRNA为模板，体外扩增cDNA，再以cDNA为模 板进行特定基因转录产物的PCR扩增。RT-PCR技术一般 用于RNA的定性分析；如果设置阳性参照，则可对待测 RNA样品进行半定量分析。
➢ 运用双重着色或多重着色程序同时对多个感兴趣的靶分子 进行检测，是一种揭示更多有关细胞群的功能和它们之间 相互作用信息的有效方法。
植物基因功能研究的主要方法_3215
植物基因功能研究的主要方法随着植物基因组计划的实施和完成，大量的基因组数据库和EST数据库得以建立和完成，因此产生的问题是成千上万新基因的功能有待分子生物学家鉴定。
研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学和反向遗传学策略。
正向遗传学是传统的方法，策略是通过筛选天然或人工产生的突变体进而克隆相关目标基因，即从功能（表型）－突变体－基因，最后得到具有相关功能（如对干旱敏感或耐旱）的基因，常用手段是图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）。
反向遗传学的策略是从已知的基因序列入手鉴定其功能，研究手段包括基因的互补实验、超表达、反义抑制、基因敲除、基因激活等。
采用反向遗传学鉴定基因功能是基因组计划由结构基因组学过渡到功能基因组学的必然要求。
目前，植物抗逆性功能基因的研究策略主要集中在利用差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析、cDNA微阵列（或基因芯片）等技术筛选与逆境胁迫相关的表达序列标签（EST）或转录因子，然后利用反向遗传学等技术对转录因子的功能进行研究。
正向遗传学手段主要集中在抗逆性状的遗传分析和QTL定位方面，然而目前尚无抗逆性状QTL基因克隆的报道；通过突变体抗逆筛选的途径主要是在模式植物拟南芥中，特别是克隆了一大批与ABA合成或ABA 敏感性有关的基因，例如ABA不敏感的abi8突变体(Brocard-Gifford et al., 2004)。
近年来许多国家（特别是我国）的水稻突变体数量剧增，为通过抗逆筛选克隆基因奠定了基础。
综合利用这些研究手段可以全面地了解植物对胁迫响应的复杂机制和相互作用以及相应的信号传导途径，从而为更加高效地利用基因工程技术来提高植物的抗逆性奠定基础。
下面就几种常见的研究抗逆基因功能的策略作简要介绍。
1. 超量表达（Over-expression）超量表达是指将目的基因全长序列与高活性的组成型或组织特异型启动子融合，通过转化获得该基因产物大量积累的植株，从而扩大该基因在生理生化过程中的效应，这部分扩大的效应带来的与正常植株在各种表型上的差异有助于帮助理解基因功能。
基因组的结构和功能分析
基因组的结构和功能分析基因组是生命的基础，它承载着生物体内生命活动的所有信息。
基因组研究是生命科学领域中的重要分支，基因组的结构和功能分析也是这个领域中最基本的研究内容之一。
在这篇文章中，我们将从基因组结构和功能分析的角度来介绍基因组研究的现状和未来。
一、基因组的结构分析1. 基因组的大小和形态基因组的大小和形态是衡量一个生物体基因组特征的重要指标之一。
不同生物体的基因组大小和形态相差较大，人类基因组含有约3亿个碱基对，而大肠杆菌基因组则仅有4.6万个碱基对。
基因组形态的研究涉及到植物、动物、微生物等不同类型生物的基因组分析，包括线性染色体、圆形染色体、质粒等等。
2. 基因组的序列分析基因组序列分析是基因组研究过程中最常用的一种方法，其核心是通过生物信息学手段对基因组的DNA序列进行计算分析，进而获得生物信息和器官信息。
基因组序列分析可用于预测基因位置、鉴定基因功能、预测的生物学性质和进化等方面。
3. 基因组的结构变异基因组结构变异是指基因组内股位点的插入、缺失、倒置和重复等变化。
基因组结构变异可能造成基因功能的改变，也可能导致疾病的发生。
因此，对基因组结构变异的分析是发现疾病相关基因和新功能基因的重要途径。
二、基因组的功能分析基因组的结构分析是揭示基因组内部信息的方法之一，但是基因组的功能分析对于生命科学领域的深入研究尤为关键。
基因组功能分析主要包括基因的表达调控、基因调控网络、基因功能识别等多个方面。
1. 基因的表达调控基因的表达调控是指基因转录后形成的RNA与DNA之间的相互作用。
基因的表达调控是基因功能分析的核心方法，包括转录因子、组蛋白修饰因子、外显子识别等方面。
通过对基因的表达调控的分析，可以为基因功能和疾病发生等提供新的解释。
2. 基因调控网络基因调控网络是指基因本身与基因之间以及基因与生命现象之间的相互作用关系。
基因调控网络的分析可以揭示基因在不同生态系统中的作用、介导生物适应性和进化，甚至为发现新疾病的分子机制提供基础。
研究植物基因功能的策略和方法_3110
研究植物基因功能的策略和方法研究植物基因功能主要有两种策略：正向遗传学（forward genetics）和反向遗传学（reverse genetics）策略。
正向遗传学即通过生物个体或细胞基因组的自发突变或人工诱变，寻找相关表型或性状改变，然后通过图位克隆并结合一些基因差异表达筛选技术（如差减杂交、差异显示PCR、差异显示分析等）从这些特定性状变化的个体或细胞中找到对应的突变基因，并揭示其功能，例如遗传病基因的克隆。
反向遗传学的原理正好相反，人们首先是改变某个特定的基因或蛋白质，然后再去寻找与之有关的表型变化，例如基因剔除技术或转基因研究。
简单地说，正向遗传学是从表型变化研究基因变化，而反向遗传学则是从基因变化研究表型变化。
研究植物体内基因功能的方法主要有以下几种：（1）基因功能丧失或减少，即筛选目的基因功能部分丧失或全部丧失的突变体，比较其与野生型的表型差异来确定该基因功能；（2）基因功能增加或获得，即筛选目的基因高水平表达的植株，比较其与相应对照植株（野生型植株，功能丧失突变体或模式植物植株）差异，观察其表型性状变化来鉴定基因功能；（3）基因异位表达（Ectopic expression），通过定向调控靶基因的时空表达模式来研究基因功能；（4）微阵列（Microarray）是一种在全基因组水平对基因表达进行高通量检测的技术；（5）酵母双杂交技术（Yeast two-hybrid system）用于分析基因产物即蛋白质之间的互作。
1 基因功能丧失或减少以前，通常通过筛选自然突变体来获得基因功能部分或全部丧失的突变体，但概率较低；现在一般通过各种人工方法来获得合适突变体。
人工产生基因功能丧失的方法有插入突变、反义抑制（antisense suppression）、共抑制（cosuppression）、双链RNA干扰（double-stranded RNA interference, dsRNAi）。
生物信息学中的基因功能分析技术
生物信息学中的基因功能分析技术引言生物信息学是将计算机科学和生物学相结合的交叉学科，致力于收集、存储、管理和分析大量的生物信息数据。
在过去的几十年中，随着DNA测序技术的快速发展和计算能力的提升，生物信息学已经成为研究基因功能的重要工具。
本文将讨论生物信息学中的基因功能分析技术，包括基因注释、基因本体论和基因互作网络分析等。
一、基因注释基因注释是生物信息学中的重要步骤之一，它通过将DNA或RNA序列与已知的基因数据库进行比对，来确定该序列所对应的基因的功能和特征。
在基因注释过程中，主要涉及到两个方面的信息：基因功能预测和基因变异分析。
1. 基因功能预测基因功能预测是根据DNA或RNA序列的特征和结构信息，来预测该基因的功能。
这可以通过比对已知基因数据库中具有相似序列的基因来实现。
目前常用的基因功能预测软件包括BLAST、HMMER和InterProScan等。
此外，还可以利用基因组学和蛋白质组学的方法来预测基因的功能，如基因组学注释和结构预测技术。
2. 基因变异分析基因变异分析是研究基因序列中的突变和多态性等变异情况，以了解这些变异对基因功能的影响。
在基因变异分析中，常常使用数据库中的已知基因变异信息进行比对和注释。
此外，还可以利用SNP分析、基因组上的重排分析和表型基因关联研究等技术来进行基因变异分析。
二、基因本体论基因本体论是一种描述基因功能和关系的标准化方法，它将基因的功能和生物过程以及细胞组分之间的关系进行分类和归纳。
基因本体论的主要作用是提供一个一致的标准，使得不同研究中的基因功能可以进行比较和整合。
基因本体论的核心是基因本体，它是一个由谓词关系组成的有向无环图。
基因本体分为三个主要部分：分子功能、细胞组分和生物过程。
其中，分子功能描述基因所编码的蛋白质的功能和活性；细胞组分描述蛋白质在细胞中的定位；生物过程描述基因参与的生物学过程和代谢途径。
基因本体论的优势在于提供了一种标准化的描述和分类基因功能的方法，为基因功能的研究提供了方便和便捷。
基因功能分析的基本策略
基因功能分析的基本策略一、利用转基因模型研究基因的功能1转基因动物：是指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。
2基本原理：将目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中，使目的基因整合到基因组中，然后将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体动物园的输卵管（或子宫）中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物。
导入基因的方法有显微注射法、胚胎干细胞法、逆转录病毒感染法、精子载体法。
二、利用基因敲除模型研究基因的功能1基因打靶：是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在生物活体内研究此基因的功能。
若定向敲除某个基因，称为基因敲除，若定向将一段基因序列替代另一段基因序列，称为基因敲入。
2同源重组：是指发生在同源序列间的重组，它通过链的断裂和再连接，在两个DNA分子同源序列之间进行单链或双链片段的交换。
又称基本重组。
3基因敲除：是目前在体内研究基因功能的最佳方法，是指通过DNA同源重组定向的将外源基因插入宿主细胞染色体DNA，从而使特定基因在细胞内或生物或体内失活的过程。
4基因打靶的必备条件：胚胎干细胞（ES）、打靶载体5打靶载体的筛选标志：neo（新霉素）阳性筛选标志；HSV-tk阴性筛选标志。
6基因敲除的基本程序：①打靶载体的构建②打靶载体导入ES细胞③基因敲除ES细胞注射入胚泡④胚泡植入假孕小鼠的子宫中⑤嵌合体的杂交育种7构建打靶载体的基本过程①获得目的基因的同源片段，将此DNA片段克隆到一般的质粒载体中；②从重组质粒中切除目的基因的大部分同源DNA序列，只留部分序列在线性质粒载体的两端；③将neo基因克隆到带有目的基因同源顺序的线性质粒中，使之位于残留目的基因同源顺序的中间；④在目的基因同源顺序的外侧线性化重组质粒载体，将HSV-tk基因克隆到此线性载体中。
三、通过抑制或沉默基因表达对基因的功能进行分析研究1利用反义RNA抑制基因表达水平2利用RNAi技术在细胞中沉默特定基因已研究其功能1。
基因功能分析的基本策略-硕士
化学合成
质量高，高纯度，高成本 适用于已经验证过抑制效率的靶点序列 不适于筛选靶点序列
体外转录
成本适中，省时，适用于筛选靶点序列 不适用于长期的研究或者针对某个特定靶 点序列的大量研究
长片断dsRNA酶解法
dsRNA在体外被RnaseⅢ家族 成员切割成siRNA 不需要验证筛选多个靶点序列 不适用于长期研究或者特定 siRNA序列的研究
Embryonic Stem Cells
同源重组
5´ 3´ 3´ 5´
5´ 3´
5´ 3´
3´ 5´
5´
3´
3´ 5´
target
targeting vector
TK
homologous recombination
5´ 3´
“knockout”
待剔除基因
克隆载体
克 隆
重组载体
切割基因使待剔 除基因失去活性
siRNA表达质粒或者病毒载体在细胞中表达siRNAs
AAACCAGCAGAACGTGTACGA
载体介导的细胞内表达siRNA 方法的特点
操作简便，稳定性好 siRNA表达载体一旦构建成功，可以无限制的应用于 研究 适用于长期的对于某个基因的研究，尤其是带有筛选 标记的载体，能够用于构建特定基因缺陷的细胞株
目的基因mRNA获取：
1、检索文献获取有实验证明有效的靶点序列（核对）
2、/ 3、其它网站
载体构建：
dsDNA形成：退火 载体的酶切和回收 连接 转化 鉴定
转染：瓶颈之一
含有真核细胞筛选标志 含有荧光标志
效应检测：mRNA水平和蛋白水平兼顾
RNA
translation
Protein
基因功能分析的基本策略
后代
受精
植入
全能性细胞
假孕小鼠
转基因动物应用
1、通过转基因动物来研究特定基因在组织中特异表达或表达 的时相； 2、在活体内研究或发现基因的新功能； 3、可用于只在胚胎期才表达的基因结构和功能研究； 4、建立研究外源基因表达、调控的动物模型； 5、遗传性疾病的研究； 6、建立人类疾病的动物模型，为人类的基因治疗提供依据； 7、动物新品种的培育； 8、基因工程产品的制备；
13、乍见翻疑梦，相悲各问年。。22.8.722.8.718:19:4518:19:45August 7, 2022
14、他乡生白发，旧国见青山。。2022年8月7日星期日下午6时19分45秒18:19:4522.8.7
15、比不了得就不比，得不到的就不要。。。2022年8月下午6时19分22.8.718:19August 7, 2022
Cre／loxP系统的原理
➢ Cre／loxP系统来源于F1噬菌体，可以介导位点特异的 DNA重组。 ➢该系统含有两种成分：①一段长34bp的DNA序列，含有 两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。这段 34bp序列是重组酶识别的位点，被称为loxP位点(10cus of X—over in P1)。 ➢②Cre重组酶(cyclizationrecombination)，它是一种由343 个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发loxP位点的DNA重组。 任何序列的DNA，当其位于两个loxP位点之间的时候，在 Cre重组酶的作用下要么被缺失(两个loxP位点的方向相同)， 要么方向发生倒转(两loxP位点的方向相反)，如图所示。
一、反义RNA技术
反义RNA技术是根据RNA序列人工合成的互补RNA。根 据反义RNA的作用机制可将其分为三类： 1、反义RNA是直接作用于靶mRNA的核蛋白体结合位 点或与靶mRNA直接结合形成双链RNA，从而直接抑制 mRNA的翻译或被RNA酶Ⅲ识别降解。 2、反义RNA是与mRNA的非编码区结合，引起mRNA 构象的变化，从而抑制其翻译。 3、反义RNA是作用于基因的启动子，直接抑制靶 mRNA的转录。
生物学领域中的基因功能化和分析方法
生物学领域中的基因功能化和分析方法基因是生命体内非常重要的一部分。
它们携带着生物体遗传信息的基本单位，控制着个体的性状和特征。
在生物学领域中，基因功能化和分析方法一直都是关注的重点。
本文将从以下几个方面分析基因功能化和分析方法的相关内容。
一、基因功能化1. RNAiRNAi，即RNA介导的基因沉默，是一种生物过程，可以通过小RNA分子促进甲基化修饰和和组蛋白构象改变来对遗传信息进行调节。
在RNAi过程中，双链小RNA为RNA诱导复合物（RISC）提供靶标信息，并将其中一个链引导至靶标mRNA上，导致RNA酶的降解和抑制其翻译。
2. CRISPR-CasCRISPR-Cas技术是一种最新的基因编辑技术，能够精确地修改基因序列。
它可以剪切基因序列，插入或删除特定片段，以实现调整基因序列的目的。
这种技术可以在生命科学领域中广泛应用，为基因功能化提供了重要途径。
二、基因分析方法1. 基因组测序基因组测序是一种利用高通量测序技术对生物体基因组进行全面测序的方法。
它可以揭示基因组的结构和组成，检测基因突变和多态性等。
这种方法被广泛应用于研究基因对遗传性病理、药物治疗、基因家族和进化等方面的影响。
2. 基因芯片技术基因芯片技术是一种利用微阵列技术测定基因表达谱的方法。
这种方法可以分析差异表达基因和富集途径，揭示分子机制并鉴定生物标记物，对于基因功能的分析和理解提供了新的思路。
3. 质能谱表征质能谱表征是一种利用质谱仪和高能质子发射素谱(HEPS)技术对多聚核苷酸进行精确检测和鉴定。
多能谱表征被广泛应用于定性和定量生物分子，如研究蛋白质-蛋白质相互作用和质谱代谢组学等方面。
总之，基因功能化和分析方法的不断研究和发展，不仅可以对生物学和医学领域的研究提供帮助，同时也为了解生物学和人类疾病提供了更丰富的信息。
随着技术的不断提升和发展，我们对于基因的理解和应用也将越来越全面和深入。
基因组的比较和功能分析
基因组的比较和功能分析随着现代生物学的发展，基因组编码的信息已成为解开生命奥秘的重要工具。
基因组比较和功能分析是基因组学研究的重要内容。
基因组比较可以揭示生物物种间的遗传变异和进化关系，功能分析有助于揭示基因的功能和调控机制。
本文将介绍基因组比较和功能分析的基本原理和应用。
一、基因组比较基因组比较是将两个或多个物种的基因组进行比较和分析，以揭示遗传变异和进化关系的过程。
基因组比较可以采用不同的方法和策略，比如比较基因组序列、结构和编码基因的数量与分布等。
具体方法有以下几种：1.序列比对序列比对是将两个或多个序列按其相似性进行比较，从而找到相同和不同之处的过程。
序列比对主要有全局比对和局部比对两种方式。
全局比对是将整个序列进行比对，局部比对是将序列的一部分进行比对。
序列比对方法包括BLAST、FASTA和Smith-Waterman方法等。
2.基因组装和注释基因组装和注释是将原始基因组序列进行拼接和注释的过程。
基因组装方法包括De Bruijn图法、Overlap-Layout-Consensus法、链式分析等。
基因组注释方法包括基因预测、基因结构预测和基因功能注释等。
3.基因家族分析基因家族是多个基因拥有相似功能和结构特征的基因集合，通过基因家族分析可以揭示基因组中不同基因家族的数量和分布情况。
基因家族分析可以采用BLAST、HMM等方法。
基因组比较的主要应用包括以下几个方面：1.揭示进化关系不同物种的基因组比较可以揭示它们之间的遗传相似性和差异性，从而推断它们的进化关系。
例如，使用多序列比对和分子钟方法可以推断物种的演化树，进而探讨其进化历史和进化速率。
2.发现功能性元素基因组比较可以帮助鉴定基因组中的功能性元素，如启动子、转录因子结合位点及细胞信号途径等，从而了解基因底层的控制机制。
3.基因功能注释通过比较不同物种的基因组，可以发现基因在不同生物过程中的共同点和差异点，推断其功能和调控机制。
基因功能分析的方法和原理
基因功能分析的方法和原理基因功能分析是研究基因在细胞内所起作用的一种方法。
它探究基因是如何影响生物的生理活动、发育过程和疾病表现的。
通过基因功能分析，科学家可以深入了解基因的调控机制，揭示基因在不同生物体系中的功能，并且有助于识别和理解疾病的基因变异。
基因功能分析的方法主要包括基因沉默、基因过表达和基因敲除等。
其中，基因沉默是指抑制基因的表达，减少或消除基因的功能。
常用的基因沉默技术有RNA 干扰（RNAi）和使用反义寡核苷酸技术。
RNAi 是一种通过介导mRNA的降解来抑制特定基因表达的机制。
通过合成双链小干扰RNA (siRNA) 或构建操纵RNAi的表达载体，可以选择性地降低目标基因的表达水平。
反义寡核苷酸技术则是设计成与目标基因的mRNA序列互补的寡核苷酸，以阻断其翻译或增加其降解，从而靶向抑制特定基因。
基因过表达是指增加特定基因的表达水平，以增加或改变基因的功能。
基因过表达的方法主要包括转基因技术、CRISPR/Cas9技术和表达载体介导的过表达等。
转基因技术通过把目标基因导入到特定生物体系中，使其在细胞内产生高表达。
CRISPR/Cas9技术则是一种高效且精准的基因编辑工具，可以实现基因的过表达。
表达载体介导的过表达则是通过构建含有目标基因的表达载体，并将其转染至细胞中，使细胞能够大量产生目标基因。
基因敲除是指在生物体内删除目标基因，观察敲除后生物体发生的变化。
常用的基因敲除技术有CRISPR/Cas9技术和选择性基因敲除技术。
CRISPR/Cas9技术通过设计合成特定的RNA与Cas9蛋白结合，形成RNA-Cas9复合物并导入到细胞中，从而切割目标基因的DNA序列，导致基因敲除。
选择性基因敲除技术则是通过设计引物，在细胞内产生剪切效应，并从整个基因组中获得目标基因的敲除。
基因功能分析的原理是基于对基因组、转录组和蛋白质组进行系统性的分析。
通过利用不同的技术手段，如DNA测序、RNA测序和质谱仪等，研究人员可以获得大量的基因和蛋白质的信息，进而了解它们的表达模式、功能等。
基因功能分析策略
欧盟国家总面积不到２０万公顷，０.３％左右。
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(藍色者為全球統計)
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转基因玉米研究
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toxin.
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转基因玉米
抗虫害的玉米
玉米是主要粮食之一，又可以提炼油脂，也可以用作食品和 工业的原料以及作饲料，浑身是宝。人们称它是含金的植物。如 今培育出转基因玉米，品质更好，产量更高。
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从植物体中分离出 合成赖氨酸的基因，把 这基因转入小麦植株中， 培育出转基因小麦。用 这种转基因小麦制造出 来的面粉，更适合用来 烤面包，而且面粉中赖 氨酸含量高，这种面包 的营养价值高。
4．胚胎干细胞法：将转染的胚胎干细胞注射
入受体囊胚腔，可参与嵌合体的形成，将来出生的动 物的生殖系统就有可能整合上外源基因，通过杂交繁 育得到纯合目的基因的个体，即为转基因动物。
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转基因动物的应用前景
1、研究基因的结构与功能，了解动物生命现 象的内在本质。
2、建立多种疾病的动物模型，研究发病机理 及治疗方法。
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转基因生物： 转基因生物： 生物 ִ外源基因导入生物体表达。 外源基因导入生物体表达。 基因打靶： 基因打靶： ִ外源基因替换内源基因。 外源基因替换内源基因。 ִ基因敲除。 基因敲除。 ִ基因敲入。 基因敲入。 基因沉默： 基因沉默： ִ导入特定基因，抑制内源性基因表达。 导入特定基因，抑制内源性基因表达。
一.转基因生物的意义
20 世纪 80 年代 (Brinster and Palmiter)： ： ִ著名的转基因小鼠实验，金属硫蛋白基 著名的转基因小鼠实验， 著名的转基因小鼠实验 因启动子驱动大鼠生长激素基因表达。 因启动子驱动大鼠生长激素基因表达。 转基因生物的用途： 转基因生物的用途： ִ研究手段：疾病的转基因动物模型。 研究手段：疾病的转基因动物模型。 ִ改良动物性状：抗病性、耐寒性等。 改良动物性状：抗病性、耐寒性等。 ִ生产产品：抗体、疫苗等的生产。 生产产品：抗体、疫苗等的生产。
分析动物表型与外源基因的关系，揭示外 分析动物表型与外源基因的关系， 源基因的功能。 源基因的功能。 建立人类疾病的转基因动物模型。 建立人类疾病的转基因动物模型。 基因产品的制备：乳腺、膀胱生物反应器。 基因产品的制备：乳腺、膀胱生物反应器。
人类疾病的转基因动物模型
完整的动物模型可以模拟人类疾病的起始 和发展，帮助了解疾病的病因和发展过程。 和发展，帮助了解疾病的病因和发展过程。 为测试各种可能的治疗方案提供一个统一 有效的系统。 有效的系统。 转基因动物模型提供了人类疾病的研究手 段。
提高显微注射 DNA 表达的成功率
转入的外源基因要能够高效表达，最好是 转入的外源基因要能够高效表达， 可以诱导表达。 可以诱导表达。 转入基因中应该包含有帮助提高整合效率 的序列，如微卫星序列。 的序列，如微卫星序列。
微卫星序列
诱导表达 启动子
外源基因
微卫星序列
2) 胚胎干细胞法
胚胎干细胞(embryo 胚胎干细胞(embryo stem cells, ES 细胞)： 细胞) ִ可人工培养增殖的小鼠胚泡发育期胚胎细 胞，当把这种胚胎细胞重新导入另一胚泡 期的胚胎之后， 期的胚胎之后，它仍然保持着分化成其他 类型细胞的能力。 类型细胞的能力。 ES 细胞具有与胚胎细胞相似的形态特征和分 化特性。 化特性。
胚胎干细胞法的特点
定点整合。 定点整合。 ES 细胞在体外培养，外源 DNA 导入后可 细胞在体外培养， 用正细胞, 用正-负选择法筛选择正确整合的 ES 细胞, 相对较简单。 相对较简单。 目前只在小鼠身上获得成功。
3）逆转录病毒感染法
逆转录病毒载体的构建 获得四/八细胞胚胎/囊胚/ 获得四/八细胞胚胎/囊胚/原肠胚 外源 DNA 导入早期胚胎： 导入早期胚胎： 获得病毒颗粒感染早期胚胎 包装细胞与早期胚胎共培养 感染后的胚胎植入受体动物子宫，发育 感染后的胚胎植入受体动物子宫， 成携带外源基因的动物。 成携带外源基因的动物。
1) DNA显微注射法 DNA显微注射法
制备超量受精卵。 制备超量受精卵。 DNA 显微注射。 显微注射。 转移注射卵到输卵管或子宫。 转移注射卵到输卵管或子宫。 转基因鼠的鉴定及鼠系建立。 转基因鼠的鉴定及鼠系建立。
DNA 显微注射
DNA注射针 DNA注射针
精原核 卵原核 持卵管
DNA 显微注射
基本原理
供体基因
受体的受精卵
基本原理
转基因的受精卵
基本原理
转基因动物
基本过程
上游— 上游—基因改造和载体构建 中游—基因转移、 中游—基因转移、胚胎移植与建系 下游—基因整合、 下游—基因整合、表达的检测与细胞筛选
1. 上游—基因改造和载体构建 上游—
外源基因: 完整的转录单位, 由顺式作用元件、 外源基因: 完整的转录单位, 由顺式作用元件、结构 基因和转录终止信号组成。 基因和转录终止信号组成。 报告基因 (reporter gene) : 在表达载体中引入易于 检测的提示重组体存在的基因。GFP、 LacZ、AP、 检测的提示重组体存在的基因。GFP、 LacZ、AP、 LUC。 LUC。 融合基因 (fusion gene): 将特定的目的基因与报告 基因拼接成融合基因， 基因拼接成融合基因，并与顺式作用元件拼接成完 整的转录单位。 整的转录单位。
利用转基因动物反应器生产药用蛋白
转基因动物反应器：乳腺、膀胱、 转基因动物反应器：乳腺、膀胱、血液 生物反应器等。 生物反应器等。 III：转基因绵羊的乳汁中。 抗凝血酶 III：转基因绵羊的乳汁中。 β乳球蛋白 红细胞生成素 凝血因子 VIII 凝血因子 IX 生长激素
转基因改良移植器官
改造异种来源器官的遗传性状，使之适应 改造异种来源器官的遗传性状， 于人体器官或组织的移植。 于人体器官或组织的移植。 1997 年起，利用遗传改良的转基因猪肝做 年起， 为严重肝病患者的离体生命支持物。 为严重肝病患者的离体生命支持物。
第二节 基因打靶
基因打靶(Gene 基因打靶(Gene Targeting) ：通过 DNA 定 点同源重组， 点同源重组，改变基因组中的某一特定基 在生物活体内研究此基因的功能。 因，在生物活体内研究此基因的功能。 基因敲除(gene 基因敲除(gene knockout): 将某个基因定向 去除。 去除。 基因敲入(gene 基因敲入(gene knockin): 定向将一段基因 序列替代另一段基因序列。 序列替代另一段基因序列。
胚胎干细胞法
分离和培养 ES 细胞。 细胞。 细胞。 外源基因导入 ES 细胞。 细胞的子宫转移。 导入外源基因的 ES 细胞的子宫转移。 转基因鼠的鉴定及鼠系建立。 转基因鼠的鉴定及鼠系建立。
胚胎干细胞的分离和培养
胚胎干细胞 胚泡 培养皿中分离 胚泡内层细胞
加饲养层细胞培养
胰蛋白酶 消化解离
胚胎干细胞的分离和培养
3. 下游—基因整合与表达检测及筛选 下游—
染色体基因水平：是否整合了外源基因以 染色体基因水平： 及整合的位点和拷贝数。 及整合的位点和拷贝数。 转录水平：转基因的 mRNA 的存在与否以 转录水平： 及表达水平。 及表达水平。 蛋白水平： 蛋白水平：转基因的蛋白质的表达以及功 能检测。 能检测。
4）精子载体法
外源 DNA 共育法 脂质体转染法 电穿孔法 精子 卵细胞 受精卵 转基因动物
DNA 磷酸钙-DNA共沉淀法 磷酸钙-DNA共沉淀法 DNA 逆转录病毒感染法 电穿孔法
精子 卵细胞
受精卵 显微注射 DNA 四细胞 胚胎
胚胎干细胞
微注射 囊胚 原肠胚 转基因 动物
逆转录病毒感染 DNA
第一节 转基因技术
转基因技术(transgenic technology)： 转基因技术(transgenic technology)：将外源 基因导入细胞，随机整合到受体基因组内， 基因导入细胞，随机整合到受体基因组内， 并随细胞分裂而遗传给后代。 并随细胞分裂而遗传给后代。 ִ细胞模型。 细胞模型。 ִ转基因动物。 转基因动物。 ִ转基因植物。 转基因植物。
DNA 显微注射到尚未发生核融合的受精卵 的精原核。显微镜下观察， 的精原核。显微镜下观察，精原核比卵原 核大，容易辨别。 核大，容易辨别。 线性 DNA 整合效率比超螺旋 DNA 高出数 倍，因而用于显微注射的转入基因通常是 DNA。 去除载体序列的线状 DNA。
DNA 显微注射法的特点
DNA 大小无限制，最大可达 250Kb。 大小无限制， 250Kb。 随机整合： 随机整合：在染色体上整合的位点是随 机的，整合的拷贝数也不一定。 机的，整合的拷贝数也不一定。 转入的基因有可能碰巧整合到具有重 要功能的基因之中， 要功能的基因之中，干扰该基因的正 常表达，影响转基因动物的正常发育 常表达， 和代谢。 和代谢。 总效率较低(实际成功率1/1000)。 总效率较低(实际成功率1/1000)。
鉴定方法
PCR Southern blot 染色体原位杂交 Northern blot RT-PCR RTWestern blot
基因转移鼠纯合鼠系的建立
生殖系细胞中不 含转入基因
×
生殖系细胞中含 转入基因
转基因杂合鼠 未转基因鼠 未转基因鼠
子代多次交配可得到纯合 转基因鼠系
三、转基因动物的应用
一、基因打靶的基本程序
打靶载体的构建。 打靶载体的构建。 细胞及其鉴定。 打靶载体导入 ES 细胞及其鉴定。 细胞注射入胚泡。 基因敲除 ES 细胞注射入胚泡。 胚泡植入假孕小鼠的子宫。 胚泡植入假孕小鼠的子宫。 嵌合体的杂交建立基因打靶的纯合鼠系。 嵌合体的杂交建立基因打靶的纯合鼠系。
动物转基因常用的载体
腺病毒载体 逆转录病毒载体 非病毒类载体：如质粒等。 非病毒类载体：如质粒等。
2. 中游—基因转移、胚胎移植与建系 中游—基因转移、
基因导入技术：物理、化学和生物学方法 基因导入技术：物理、 1) 显微注射法 （microinjection) 2) 胚胎干细胞法（embryonic stem cells, ES 胚胎干细胞法（ 细胞） 细胞） 3) 逆转录病毒感染法 4) 精子载体法
逆转录病毒感染法
外源基因 逆转录病毒载体
四/八细胞胚胎/囊胚/原肠胚 八细胞胚胎/囊胚/
逆转录病毒感染
纯合体小鼠 嵌合小鼠
逆转录病毒感染法的特点
通过病毒 DNA 插入宿主 DNA 的机制，将 的机制， 外源目的基因整合到宿主基因组，整合效率 外源目的基因整合到宿主基因组， 高。 反转录病毒载体容量有限，只能转移小片段 反转录病毒载体容量有限， DNA(＜10kb)。 DNA(＜10kb)。 对家禽类的转基因研究有重要意义。 对家禽类的转基因研究有重要意义。
动物的克隆
1996 年，首次实现动物的无性生殖。 首次实现动物的无性生殖。 由绵羊的乳腺细胞提供细胞核， 由绵羊的乳腺细胞提供细胞核，卵细胞提供 细胞质发育而来。 细胞质发育而来。 核移植技术（ 核移植技术（Nuclear Transfer)