蛋白质含量的测定考马斯亮蓝染色法
实验8考马斯亮蓝法测蛋白质的含量
对实验条件进行优化，如调整PH值、反应时间、温度等，以提高实验
结果的稳定性。
03
应用拓展
进一步研究考马斯亮蓝法在特殊蛋白质或不同来源蛋白质测定中的应用，
拓展其应用范围。同时，可以探索与其他蛋白质测定方法的比较研究，
为蛋白质定量分析提供更多选择。
THANKS
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标准曲线的绘制
加样
将标准蛋白溶液分 别加入相应的试管 中。
测定光密度值
在特定波长下测定 各试管的光密度值， 记录数据。
准备标准蛋白溶液
制备一系列不同浓 度的标准蛋白溶液。
显色反应
向每个试管中加入 适量的考马斯亮蓝 溶液，混合均匀。
绘制标准曲线
根据测得的光密度 值与标准蛋白浓度 绘制标准曲线。
加样
样品稀释
根据实验需求，将蛋白质 样品进行适当稀释，以便 后续测量。
样品标记
对每个样品进行标记，以 便后续结果分析时能够准 确对应。
考马斯亮蓝溶液的配制
准备试剂
储存与使用
按照实验要求准备考马斯亮蓝溶液所 需的试剂。
将配制好的考马斯亮蓝溶液储存于棕 色瓶中，避免光照，使用前摇匀。
配制溶液
将各试剂按比例混合，制备出考马斯 亮蓝溶液。
影响因素
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量时，PH值、反应时间、温度等因素 可能影响实验结果。
适用范围
考马斯亮蓝法适用于大多数蛋白质的定量测定，但对于某些特殊蛋 白质或不同来源的蛋白质可能存在一定误差。
对实验的改进建议与展望
01
标准化操作
为提高实验准确性，建议对实验操作进行标准化，减少人为误差。
02
优化条件
考马斯亮蓝与蛋白质结合的机制
蛋白质含量测定法考马斯亮蓝法
蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法[实验目的]学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质含量的方法[实验原理]（蓝色）变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250max λ−−→−+-[器材与试剂]器材722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支 试剂1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA ），配制成1.00mg/ml 。
2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg 考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。
[实验方法]标准方法1.取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
3.用标准蛋白浓度（mg/ml ）为横坐标，用A 595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。
根据测得的未知样品的A 595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。
根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g 鲜重) =）测定时提取液体积（）样品重（）提取液总体积（）查得的蛋白质（ml g ml g g ⨯⨯/μSDS 干扰实验1.取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
[实验数据与结果分析]（一）标准方法的数据和图表1 考马斯亮蓝标准法实验表格根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。
图1 考马斯亮蓝标准法根据线性拟合公式y=a x+b计算所测溶液的蛋白质的含量。
（二）SDS干扰数据和图表2 考马斯亮蓝SDS干扰实验表格根据表2，以A595为纵坐标，SDS浓度为横坐标，作图2。
蛋白质含量的测定考马斯亮蓝染色法
➢ 蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合2min左右达到平衡，完成反应
十分迅速，其结合物在室温1h内保持稳定
➢ 考马斯亮蓝G-250染色法简单迅速，灵敏度高，一些阳离子如
K些+去、污Na剂+、如MTgri2t+o、nXN-H104+0以、及SD乙S等醇严等重物干质扰都测不定干，扰且测样定品，测但定一 后不能回收
度计的光源
➢ 单色器 把混合光波分解为单一波长光的装置 在分光光度计中多用棱镜或光栅作为色散元件 ✓ 棱镜：是根据光的折射原理而进行的分光系统，当一束平行光进入棱镜散
射器后就会按波长顺序分解成单一波长的单色光
✓ 光栅：是利用光的衍射和干涉原理进行的分光系统
转动棱镜或光栅的波长盘，可以改变单色器出射光束的波长，调节出入射
狭缝隙的宽度，可以改变出射光束的带宽和单色光的纯度
纯粹的单色光只是一种理想情况，实际上只是具有一定波长范围的谱带，
对于单色光纯度来说，狭缝是越窄越好，但光的强度也就越弱
➢ 吸收池
亦称样品室、比色池或吸收池，由透明材料（有机玻璃、石英或蓝宝石等）
制成
在紫外光波区检测选用石英、蓝宝石比色杯；在可见光波区检测可选用有机
➢血清蛋白质含量的计算：利用标准曲线，根据血清蛋白测定的 吸光值求出相应的蛋白含量，注意稀释倍数
பைடு நூலகம்
六、实验思考
➢如何正确使用722型可见光分光光度计？ ➢考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量的原理是什么？ ➢考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量有什么优缺点？
➢人眼可见的光只占电磁波谱的很小一部分（400~760nm）。它是一种频率较 大的电磁波。电磁波按频率大小，从频率最小的无线电波到频率最大的γ-射线 排成一列，即组成电磁波的波谱，如下图所示
蛋白质含量测定实验报告
一、实验目的1. 理解并掌握考马斯亮蓝法测定蛋白质含量的原理和操作步骤。
2. 学习使用分光光度计进行比色分析。
3. 通过实验，掌握蛋白质含量测定的实际操作，提高实验技能。
二、实验原理考马斯亮蓝法是一种快速、简便的蛋白质定量方法。
该法基于蛋白质与考马斯亮蓝G-250染料的结合，蛋白质含量与染料结合程度呈线性关系。
通过测定溶液在特定波长下的吸光度，可以计算出蛋白质的含量。
实验原理：蛋白质分子中的肽键在碱性条件下能与考马斯亮蓝G-250染料发生结合，形成有色的复合物。
该复合物在特定波长下有特征性吸收峰，其吸光度与蛋白质含量呈线性关系。
三、实验材料1. 蛋白质标准品（如牛血清白蛋白）。
2. 考马斯亮蓝G-250染料。
3. 6.0mol/L NaOH溶液。
4. 双蒸水。
5. 分光光度计。
6. 试管、移液器、吸管等实验器材。
四、实验步骤1. 标准曲线制作：将不同浓度的蛋白质标准品配制成溶液，分别加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度，绘制标准曲线。
2. 样品处理：取待测样品，按照一定比例稀释，加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度。
3. 数据处理：根据标准曲线，计算待测样品中的蛋白质含量。
五、实验结果与分析1. 标准曲线制作：根据实验数据，绘制标准曲线，得出线性方程。
2. 样品处理：取待测样品，按照一定比例稀释，加入考马斯亮蓝G-250染料，在特定波长下测定吸光度。
3. 数据处理：根据标准曲线，计算待测样品中的蛋白质含量。
实验结果显示，待测样品中的蛋白质含量为XX g/L。
六、实验讨论1. 实验过程中，应注意操作规范，避免污染和误差。
2. 在制作标准曲线时，应选择合适的浓度范围，保证线性关系良好。
3. 待测样品的稀释倍数应根据实际浓度选择，以保证在检测范围内。
4. 在测定吸光度时，应注意仪器校准和操作，避免误差。
七、实验总结本次实验通过考马斯亮蓝法测定了待测样品中的蛋白质含量，实验结果准确可靠。
蛋白质含量的测定考马斯亮蓝染色法
1 2
洗涤
用洗涤液洗涤染色后的蛋白质样品，去除多余的 染料。
测量
使用分光光度计测量蛋白质样品的吸光度值。
3
结果计算
根据标准曲线和吸光度值计算蛋白质含量。
04
结果分析
数据记录与整理
数据记录
在实验过程中，应详细记录每个实验 组的吸光度值，包括空白对照组。
数据整理
将实验数据整理成表格，包括实验组 别、吸光度值以及相应的波长等。
VS
药物研发
在药物研发过程中，考马斯亮蓝染色法可 用于评估药物对蛋白质表达的影响，为新 药研发提供实验依据。
未来发展方向与挑战
技术优化
随着科学技术的不断发展，考马斯亮蓝染色法需要不断优化和完善， 以提高检测的灵敏度和特异性。
应用领域拓展
随着蛋白质组学研究的深入，考马斯亮蓝染色法的应用领域将进一 步拓展，为生命科学和医学研究提供更多支持。
蓝色与黄色
考马斯亮蓝染色后呈蓝色，与未结合蛋白质的黄色形成鲜明对比，便于观察和 检测。
颜色深浅与浓度正相关
随着蛋白质浓度的增加，染色后样品的颜色逐渐加深，通过比色法可测定出不 同浓度下的光密度值，进而计算出蛋白质浓度。
03
实验步骤
样品准备
样品收集
蛋白质提取
选择具有代表性的样品，确保样品新 鲜、无污染。
05
应用与展望
在生物学领域的应用
蛋白质表达分析
考马斯亮蓝染色法常用于检测细胞或组织中蛋白质的表达水平，有助于研究生物体的生 理和病理过程。
蛋白质分离与鉴定
通过考马斯亮蓝染色法对蛋白质进行染色，可以方便地对蛋白质进行分离和鉴定，为蛋 白质组学研究提供技术支持。
在医学领域的应用
蛋白质含量测定法考马斯亮蓝法
蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法[实验目的]学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质含量的方法[实验原理]（蓝色）变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250m ax λ−−→−+-[器材与试剂]器材722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支 试剂1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA ），配制成1.00mg/ml 。
2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg 考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。
[实验方法]标准方法1.取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
3.用标准蛋白浓度（mg/ml ）为横坐标，用A 595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。
根据测得的未知样品的A 595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。
根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g 鲜重)=）测定时提取液体积（）样品重（）提取液总体积（）查得的蛋白质（ml g ml g g ⨯⨯/μ以蛋白标准溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
计算出回归方程。
如Y=aX+b让后把待测样品的吸光值代入回归方程，算出待测样品浓度 SDS 干扰实验1.取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
[实验数据与结果分析]（一）标准方法的数据和图表1 考马斯亮蓝标准法实验表格根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量
标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量欧阳学文一、标准曲线一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。
因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。
二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作（一）、试剂：1、考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。
最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250,4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。
2、标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
（二）、器材：1、722S型分光光度计使用及原理（）。
2、移液管使用（）。
（三）、标准曲线制作：1、A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
1）、利用标准曲线查出回归方程。
2）、用公式计算回归方程。
3）、或用origin作图，测出回归线性方程。
即A595nm=a×X( )+6一般相关系数应过0.999以上，至少2个9以上。
4）、绘图时近两使点在一条直线上，在直线上的点应该在直线两侧。
（四）、蛋白质含量的测定：样品即所测蛋白质含量样品（含量应处理在所测范围内），依照操作步骤1操作，测出样品的A595nm，然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
一般被测样品的A595nm值在0.1—0.05之间，所以上述样品如果A595nm值太大，可以稀释后再测A595nm值，然后再计算。
（五）、注意事项：1、玻璃仪器要洗涤干净。
2、取量要准确。
3、玻璃仪器要干燥，避免温度变化。
实验1考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量
蛋白质含量的测定
微量凯氏定氮法 Folin-酚试剂法（Lowry法） 双缩脲法（Biuret法） 紫外光吸收法 考马斯亮蓝法（Bradford法）
▪ 实验类型——基础验证型
实验目的
掌握和学习考马斯亮蓝G-250染色法 测定蛋白质含量的基本方法。
五 思考题
测定蛋白质含量还有哪些方法， 测定原理有哪些不同？
移液枪的使用方法
量程的调节 枪头（吸液嘴）的装配 移液的方法 移液器的正确放置 维护保养时的注意事项
吊钩 手柄
移液控制及调节旋纽 吸/枪头推出器
数字显示器
枪杆
移液枪的结构
1.量程的调节 ！！看清量程再调节
千万不要将按钮旋出量程， 否则会卡住内部机械装置而损坏了移液枪。
➢ 吸量管上端标有“吹”字。将所量液体全部放出后，还需要吹出 残留于管尖的溶液。此类吸量管为“吹出式”，未标“吹”字的 吸量管，则不必吹出管尖的残留液体。(0.5ml以下的都要吹）
➢ 吸量管尖应接触受器内壁，但不应插入受器内的原有液体之中， 以免污染吸量管及试剂。
➢ 吸取血液、尿、组织样品、粘稠试剂或有颜色的吸量管，用后应 及时用自来水冲洗干净。如果吸取一般试剂的吸量管可不必马上 冲洗，待实验完毕后，用自来水冲洗干净，晾干备用。
/mL
0
10
蛋白质浓度
(μg/mL)
A595
3
4
5
6
7
0.2
0.4
0.6
0.8 1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0
4.0
4.0
4.0
4.0 4.0
20
40
60
考马斯亮蓝法测蛋白质含量的流程
考马斯亮蓝法测蛋白质含量的流程下载提示：该文档是本店铺精心编制而成的，希望大家下载后，能够帮助大家解决实际问题。
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考马斯亮蓝法测蛋白质含量
标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量一、标准曲线一般用分光光度法测物质得含量,先要制作标准曲线,然后根据标准曲线查出所测物质得含量。
因此,制作标准曲线就是生物检测分析得一项基本技术。
二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin-酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作(一)、试剂:1、考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇,加入100ml 85% H3PO4,用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。
最终试剂中含0、01%(W/V)考马斯亮蓝G—250,4、7%(W/V)乙醇,8、5%(W/V)H3PO4。
2、标准蛋白质溶液:纯得牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0、15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
(二)、器材:1、722S型分光光度计使用及原理()。
2、移液管使用()。
(三)、标准曲线制作:1、2、以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标(六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug),在坐标轴上绘制标准曲线。
1)、利用标准曲线查出回归方程。
2)、用公式计算回归方程。
3)、或用origin作图,测出回归线性方程。
即A595nm=a×X( )+6一般相关系数应过0、999以上,至少2个9以上。
4)、绘图时近两使点在一条直线上,在直线上得点应该在直线两侧。
(四)、蛋白质含量得测定:样品即所测蛋白质含量样品(含量应处理在所测范围内),依照操作步骤1操作,测出样品得A595nm,然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
一般被测样品得A595nm值在0、1—0、05之间,所以上述样品如果A595nm值太大,可以稀释后再测A595nm值,然后再计算。
(五)、注意事项:1、玻璃仪器要洗涤干净。
2、取量要准确。
3、玻璃仪器要干燥,避免温度变化。
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量
实验一 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量【实验目的】1．掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的原理和过程。
2．熟悉蛋白质含量测定的影响因素。
【实验原理】1976年Bradford 等建立了用考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，迅速、灵敏的定量测定蛋白质的方法。
染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收的改变，从465 nm 变为595 nm ，光吸收增加。
蛋白质-染料复合物具有较大的吸光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1 g 蛋白。
染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约只需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。
由于该法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。
N CH 2CH 3CH 2N +CH 3CH 2CH 2NHCH 3CH 3O CH 2CH 3SO 3-SO 3Na蛋白质+ 蛋白质-染料复合物H +考马斯亮蓝G-250（蓝色，λmax595nm ）【仪器与试剂】1．紫外-可见分光光度计，微量注射器。
2．考马斯亮蓝G-250，95%乙醇，85%(W/V)磷酸。
【实验步骤】1．标准蛋白质溶液的配制称取牛血清白蛋白适量，加水溶解并配制成1 mg/ml 的溶液。
2．蛋白试剂的配制称取100 mg考马斯亮蓝G-250，加入95%乙醇50 ml溶解，再加入85%(W/V)磷酸100 ml，将溶液用水稀释至1000 ml。
试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%乙醇和8.5%(W/V)磷酸。
3．标准曲线的制作取标准蛋白质溶液5、10、20、50、100 μl于小试管中，用水稀释至0.1 ml，然后分别加入5 ml蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595 nm测定其吸光度值。
以0.1 ml水及5 ml蛋白试剂作为空白对照。
以蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量依据。
4．样品测定取含10~100 μg蛋白质溶液于小试管中，加水稀释至0.1 ml，然后加入5 ml 蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595 nm测定其吸光度值。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量
考马斯亮蓝法测蛋白质含量实验概要bradford法是最常用的蛋白质快速定量方法。
coomassie brilliant blue g-250与蛋白质结合使染料的最大吸收峰由465 nm变为595 nm，溶液的颜色由棕色变为蓝色，595nm波长下吸光度值与蛋白含量成正比。
灵敏度比lowry法高4倍，与bca法相当。
反应迅速，2分钟即可达到平衡并在1小时内保持稳定。
操作简便，只需要一种反应试剂。
实验原理考马斯亮蓝(coomassie brilliant blue)法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰g-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465 nm变为 595 nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。
主要试剂考马斯亮蓝g-250染色工作液： 10mg考马斯亮蓝g-250粉末溶于5ml 95%乙醇中，彻底溶解后，加入10ml 85%磷酸中，边加边搅拌（市售液体磷酸（h3po4）的质量分数≥85.0%，稠状透明液体，可直接使用，对皮肤有很强的腐蚀作用，建议使用5ml移液枪缓慢吸取使用）蒸馏水稀释至100ml。
后经滤纸过滤后储存于棕色试剂瓶中，避光保存。
长时间不用，可放置于4℃冰箱中保存1年，再次使用还需过滤，加入反应管前需要升至室温，否则虽不影响精度，但测得的od值较低，对仪器要求较高。
标准牛血清白蛋白（bsa）：精确称取4mg bsa粉末，溶于1ml 0.15mol/l nacl溶液配制成4mg/ml标准蛋白溶液，-20℃保存。
（如用1cm比色皿测定，建议精确称取40mg bsa 粉末，溶于10ml 0.15mol/l nacl溶液配制成4mg/ml标准蛋白溶液，分装成小管，-20℃保存。
考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量
实验一 考马斯亮蓝染色法测定蛋白质的含量【实验目的】1．掌握考马斯亮蓝染色法测定蛋白质含量的原理和过程。
2．熟悉蛋白质含量测定的影响因素。
【实验原理】1976年Bradford 等建立了用考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合，迅速、灵敏的定量测定蛋白质的方法。
染料与蛋白质结合后引起染料最大吸收的改变，从465 nm 变为595 nm ，光吸收增加。
蛋白质-染料复合物具有较大的吸光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度，最低检出量为1 g 蛋白。
染料与蛋白质的结合是很迅速的过程，大约只需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。
由于该法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。
N CH 2CH 3CH 2N +CH 3CH 2CH 2NHCH 3CH 3O CH 2CH 3SO 3-SO 3Na蛋白质+ 蛋白质-染料复合物H +考马斯亮蓝G-250（蓝色，λmax595nm ）【仪器与试剂】1．紫外-可见分光光度计，微量注射器。
2．考马斯亮蓝G-250，95%乙醇，85%(W/V)磷酸。
【实验步骤】1．标准蛋白质溶液的配制称取牛血清白蛋白适量，加水溶解并配制成1 mg/ml 的溶液。
2．蛋白试剂的配制称取100 mg考马斯亮蓝G-250，加入95%乙醇50 ml溶解，再加入85%(W/V)磷酸100 ml，将溶液用水稀释至1000 ml。
试剂的终浓度为0.01%考马斯亮蓝G-250，4.7%乙醇和8.5%(W/V)磷酸。
3．标准曲线的制作取标准蛋白质溶液5、10、20、50、100 μl于小试管中，用水稀释至0.1 ml，然后分别加入5 ml蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595 nm测定其吸光度值。
以0.1 ml水及5 ml蛋白试剂作为空白对照。
以蛋白浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线作为定量依据。
4．样品测定取含10~100 μg蛋白质溶液于小试管中，加水稀释至0.1 ml，然后加入5 ml 蛋白试剂，充分振荡混合，2分钟后于595 nm测定其吸光度值。
蛋白质含量的测定(考马斯亮蓝)
Coomassie Dye-Based 蛋白质定量
O CH 2CH 3
Coomassie G-250
NH
PROTEIN
+
CH 3 C + CH3CH 2 N CH 2 SO3CH 3 N CH 2CH 3 CH 2
Hale Waihona Puke SO3NaAcid
BLUE
Protein - Dye Complex
Amax = 595nm
2、样品的测定
取一EP管 加入样品液1.0ml＋4.0ml考马斯亮蓝液 取一EP管，加入样品液1.0ml＋4.0ml考马斯亮蓝液4.0ml，同上操 考马斯亮蓝液4.0ml， 作，测A595
五、 结果及分析
1、以标准管的浓度为横坐标，A595为纵坐 、以标准管的浓度为横坐标， 标做标准曲线图 2、根据标准曲线，求出样品的浓度。 、根据标准曲线，求出样品的浓度。
标准蛋白溶液(mL) 标准蛋白溶液(mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.9％ 0.9％ NaCl(mL) 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 标准蛋白含量( 10 20 30 40 标准蛋白含量(µg) 0 考马斯亮蓝试剂(mL) 4.0 mL 考马斯亮蓝试剂(mL) 颠倒摇匀，静置5min， 号试管为空白对照， 595nm处比色 颠倒摇匀，静置5min，以 1 号试管为空白对照，在595nm处比色 A595（OD595） 0
六、 注意事项
1、EP管、试剂要求干净，不含有去污剂。 EP管 试剂要求干净，不含有去污剂。 2 、 蓝色物质不易洗去 ， 测定完后用乙醇将蓝 蓝色物质不易洗去， 色的比色杯洗干净。 色的比色杯洗干净。
七、 思考题
1、与其它测定蛋白质浓度的方法相比，考马 与其它测定蛋白质浓度的方法相比， 斯亮蓝染色法测定有何优点？ 斯亮蓝染色法测定有何优点？ 2、制作标准曲线及测定样品时，为什么要将 制作标准曲线及测定样品时， 各管中溶液颠倒混合 ？
考马斯亮蓝 法测定蛋白质含量
二、Bradford法(一）、原理：考马斯亮蓝G250 ( CBB- G-250）与蛋白质结合后形成蓝色的化合物，在595nm有最大吸收峰，且蓝色的深浅与蛋白浓度成正比。
这是一种快速、准确、重复性好的蛋白质定量方法。
该方法快速、准确、干扰因素少。
CBB- G-250在2分钟内即可完全与蛋白结合，并在2小时内保持稳定，该反应几乎不受钠、钾等阳离子的干扰，更不受蔗糖等碳水化合物的干扰。
但较高浓度的十二烷基硫酸钠（Soldium dodecyl sulfate），Triton X－100等对其有干扰，此影响可通过选择适当的对照品来消除。
（二）器材及试剂1、器材A. 分光光度计B. 微量加样器C. 移液管、试管及试管架D. 坐标纸2. 试剂（1）考马斯亮蓝G-250溶液：称取CBB- G-250 100毫克溶于50 ml 95%(V/V)乙醇溶液中，然后加入100毫升85%（V/V）磷酸，最后加蒸馏水定容至1000毫升。
（2）0.14mol/L 氯化钠溶液（生理盐水）（3）标准蛋白质溶液（0.1mg/ml）：精确称取10.0毫克牛血清白蛋白，用生理盐水定容至100毫升。
(4) 血清样品(已稀释200倍)(5) 层析样品(三）、操作（标准曲线制作）：取7支试管按下表操作：混匀，室温放置5分钟，在595nm测定各管O.D值并以蛋白浓度为横坐标，以O.D 值为纵坐标绘制标准曲线．以Bradford法测定层析分离蛋白内的蛋白浓度取试管从层析样品中各取20.0ul，加入生理盐水20ul,最后加入考马斯亮蓝G-250溶液5.0ml，混匀，以595nm 波长测定二者光密度，在标准曲线上查出其蛋白浓度以上需要购买的试剂有：1、标准蛋白质即牛血清白蛋白。
教学内容：实验八考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量【实验目的】1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质的原理与方法2. 熟练分光光度计的使用和操作方法【实验原理】此方法是1976年Bradform建立。
考马斯亮蓝法法测定蛋白质含量
（优选）考马斯亮蓝法法测定 蛋白质含量
【实验原理】
考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于 染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G250在酸性溶液中呈棕 红色，最大吸收峰在465nm；当它与蛋白 质通过范德华键结合成复合物时变为蓝色， 其最大吸收峰移至595nm，而且消光系数 更大。
考马斯亮蓝G-250在游离状态 下呈红色，最大光吸收在 465nm；当它与蛋白质结合 后变为青色，蛋白质-色素结 合物在595nm波长下有最大 光吸收。其光吸收值与蛋白质 含量成正比。
蛋白质与考马斯亮蓝G250的 结合十分迅速，约2min即可 反应完全，其复合物在1h内 保持稳定。
考马斯亮蓝R250与蛋白 质反应虽然比较缓慢， 但是可以被洗脱下去， 所以可以用来对电泳条 带染色。
在一定蛋白质浓度范围内 (1～1000µg/ml）,
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；
蛋白质－染料复合物在595nm处的光吸收与蛋白 考马斯亮蓝试剂（mL）
蛋白质与考马斯亮蓝G250的结合十分迅速，约2min即可反应完全，其复合物在1h内保持稳定。 考马斯亮蓝法法测定蛋白质含量
质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。 当一束平行单色光(I0)照射有色溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液(I)
蛋白质与考马斯亮蓝G250的结合十分迅速，约2min即可反应完全，其复合物在1h内保持稳定。 由于蛋白质－染料复合物具有很高的消光系数，因此大大提高了蛋白质测定的灵敏度（最低检出量为1µg）。 考马斯亮蓝G250测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。 （优选）考马斯亮蓝法法测定蛋白质含量
当它与蛋白质通过范德华键结合成复合物时变为蓝色，其最大吸收峰移至595nm，而且消光系数更大。 可见光范围内波长和颜色的关系
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光源
单色器
0.575
检测器 显示器 吸收池
➢ 光源 不同的光源都有其特有的发射光谱，因此可采用不同的发光体作为仪器的
光源
钨灯的发射光谱：钨灯光源所发出的320～1100nm波长的光谱，光通过三
棱镜折射后，可得到由红、橙、黄、绿、蓝、靛、紫组成的连续色谱；该 色谱可作为可见光分光光度计的光源
氢灯的发射光谱：氢灯能发出195～400 nm波长的光谱，可作为紫外光光
756型紫外/可见光分光光度计
紫外/可见光分光光度计
PE5808红外光分光光度计
➢ 考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量，属于染料结合法的
一种
➢ 考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈棕红色，当它与蛋白质通过
疏水作用结合后变为蓝色，前者的最大光吸收在465nm，后 者在595nm
➢ 在一定蛋白质浓度范围内（0.01～1.0mg/mL），蛋白质-色素
示出来
主要有四种类型：指针式、LD数字式、VGA屏幕式和计算机式
72光光度计的使用步骤
将灵敏度旋钮调整“1”档（放大倍率最小） 打开分光光度计电源，开盖预热20min 选择所需波长 将空白比色杯垂直放入样品槽，使光面对准光路 将旋钮打至T，开盖调0，闭盖调100 将旋钮打至A，闭盖调0 将样品比色杯放入样品槽，闭盖，读出读数 开盖取出样品比色杯，关闭电源
度计的光源
➢ 单色器 把混合光波分解为单一波长光的装置 在分光光度计中多用棱镜或光栅作为色散元件 ✓ 棱镜：是根据光的折射原理而进行的分光系统，当一束平行光进入棱镜散
射器后就会按波长顺序分解成单一波长的单色光
✓ 光栅：是利用光的衍射和干涉原理进行的分光系统
转动棱镜或光栅的波长盘，可以改变单色器出射光束的波长，调节出入射
结合物在595nm波长下的光吸收与蛋白质含量成正比
➢ 蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合2min左右达到平衡，完成反应
十分迅速，其结合物在室温1h内保持稳定
➢ 考马斯亮蓝G-250染色法简单迅速，灵敏度高，一些阳离子如
K些+去、污Na剂+、如MTgri2t+o、nXN-H104+0以、及SD乙S等醇严等重物干质扰都测不定干，扰且测样定品，测但定一 后不能回收
➢血清蛋白质含量的计算：利用标准曲线，根据血清蛋白测定的 吸光值求出相应的蛋白含量，注意稀释倍数
六、实验思考
➢如何正确使用722型可见光分光光度计？ ➢考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量的原理是什么？ ➢考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量有什么优缺点？
合作愉快
2011
➢分光光度计的分类 红外分光光度计：测定波长范围为大于760 nm的红外光区 可见光分光光度计：测定波长范围为400～760 nm的可见光区 紫外分光光度计：测定波长范围为200～400 nm的紫外光区
➢无论哪一类分光光度计都包括光源、单色器、吸收池、检测器和显示装置。 分光光度计各部件的次序如图所示：
三、实验器材
➢试管及试管架 ➢移液管 ➢722型可见光分光光度计
四、实验材料与试剂
➢ 染色液 ➢ 蛋白标准液（0.1mg/mL） ➢ 稀释血清
五、实验操作
➢制作标准曲线 取6支试管，按下表操作
以各管的相应蛋白浓度为横坐标，吸光值为纵坐标绘出标准曲线
➢血清蛋白质吸光值的测定：准确吸取0.1mL血清，置于100mL容 量瓶中，用生理盐水稀释至刻度，再取1支试管，在试管中加入 0.5mL血清稀释液，0.5mL蒸馏水和3mL染色液，混匀后室温放置 15min，在595nm波长处测吸光值
玻璃比色杯 吸收池使用注意事项 ✓ 吸收池必须与光束方向垂直 ✓ 每套比色皿的质料、厚度应完全相同，以免产生误差 ✓ 比色皿上的指纹、油污或壁上的沉积物都会显著地影响其透光性，因此在使
用前务必彻底清洗 检测器 是一种光电转换装置，主要是把光强度转变成电讯号，再通过放大器把信号
输送给测量仪器
常用的检测器有光电管、光电倍增管和光电二极管矩阵 ➢ 显示装置 把从光电监测器中获得的电信号，通过放大器后，以图形或数字等形式显
狭缝隙的宽度，可以改变出射光束的带宽和单色光的纯度
纯粹的单色光只是一种理想情况，实际上只是具有一定波长范围的谱带，
对于单色光纯度来说，狭缝是越窄越好，但光的强度也就越弱
➢ 吸收池
亦称样品室、比色池或吸收池，由透明材料（有机玻璃、石英或蓝宝石等）
制成
在紫外光波区检测选用石英、蓝宝石比色杯；在可见光波区检测可选用有机