免疫分析法课件
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xx年xx月xx日
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目录
contents
免疫分析概述免疫分析的基本原理免疫分析在医学中的应用免疫分析的新技术与新发展免疫分析的局限性及解决方案研究展望与未来趋势
01
免疫分析概述
免疫分析定义
指利用抗原-抗体特异性反应的生物分析方法
免疫分析分类
根据所用抗体的来源和性质不同分为体内和体外免疫分析
03
免疫分析在医学中的应用
1
感染性疾病的诊断与分型
2
3
感染性疾病是临床常见疾病之一，其诊断与分型对于治疗方案的选择和预后判断至关重要。
免疫分析技术通过检测病原体特异性抗原、抗体或细胞因子等，为感染性疾病的诊断与分型提供重要依据。
例如，免疫荧光、ELISA和化学发光等免疫分析方法可应用于流感病毒、结核分枝杆菌等感染的诊断与分型。
抗原抗体的概念
抗原是指能够刺激机体产生免疫应答的物质，而抗体则是机体在抗原的刺激下产生的免疫应答产物。抗原和抗体结合时会产生一系列的反应，这些反应被称为抗原-抗体反应。
抗原-抗体反应
抗原抗体的特异性
抗原和抗体的结合具有高度的特异性，这是因为抗体只能与相应的抗原结合。抗原抗体的特异性决定了免疫分析的灵敏度和特异性。
抗原抗体的结合力
抗原和抗体结合的力主要是静电引力、范德华力和疏水相互作用等。这些力的相互作用使得抗原和抗体能够紧密结合。
信号放大
免疫分析通常使用信号放大的方法以提高检测的灵敏度。常见的信号放大方法包括酶联免疫分析、化学发光免疫分析和荧光免疫分析等。
检测方法
免疫分析的检测方法包括肉眼观察、仪器测量和放射自显影等。不同的检测方法适用于不同的免疫分析类型和检测范围。
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xx年xx月xx日
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目录
免疫分析概述免疫分析的实验技术免疫分析的生物化学基础免疫分析的质量控制免疫分析的未来发展趋势免疫分析实例解析
01
免疫分析概述
免疫分析是一种利用抗原-抗体特异性反应原理，对样本中的抗原或抗体进行定性或定量检测的方法。
免疫分析基于抗原-抗体之间的特异性结合反应，通过检测反应产物来对样本中的抗原或抗体进行定性或定量检测。
在自动化免疫分析仪器的基础上，对整个免疫分析流程进行优化，实现全流程自动化，包括样本处理、加样、孵育、洗涤、检测等环节，减少人为操作误差。
免疫分析的自动化
高灵敏度检测试剂的研发
通过提高检测试剂的灵敏度，能够更早地检测出疾病标志物，提高疾病的早期诊断率。
信号放大技术的运用
采用信号放大技术，如量子点、纳米线等纳米材料的应用，能够将信号放大，提高检测灵敏度和准确性。
常见肿瘤标志物的免疫分析
肿瘤标志物的免疫分析
THANKS
感谢观看
免疫荧光技术的应用
免疫荧光技术被广泛应用于细胞和组织的免疫标记研究。
01
02
03
免疫印迹技术的原理
免疫印迹技术是一种利用特异性抗体识别蛋白质条带，并通过显色反应显示蛋白质存在的方法。
免疫印迹技术的实验步骤
免疫印迹技术通常包括样品处理、电泳分离、转膜、特异性抗体孵育、显色反应等步骤。
免疫印迹技术的应用
抗原结合部位
抗体分子上发挥效应功能的部位，如补体激活、调理吞噬等。
效应功能部位
抗体的结构与功能
04
免疫分析的质量控制
实验计划的制定
制定详细的实验计划，包括实验目的、实验步骤、实验时间、预期结果等，以便于实验的顺利进行。
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酶联免疫分析法——应用2
2、放射免疫分析法(RIA)
• 简介
1959 年美国的 Yalow 和 Berson 首先使用放射性核 素标记胰岛素从而创立了放射免疫分析法 (radioimmunoassay，RIA)。
• 定义:把放射性核素测定与抗原、抗体间的免疫
化学反应两种方法巧妙地结合起来所形成的一种 超微量物质的测定方法。
兴奋剂检测的主要方法有气相色谱、高
效液相色谱、气相色谱－质谱联用、液相 色谱－质谱联用、免疫分析法、流动注射 电化学发光、高效毛细管电泳、毛细管电 泳－离子阱质谱等方法。
二、免疫分析法
免疫分析法是利用抗原与抗体的特异 性免疫反应来实现对禁用药物的检测的 方法。
特点：快速、高灵敏度、高特异性。 应用：主要被应用于类固醇类兴奋剂 和激素类兴奋剂的检测。
免疫分析法ppt
兴奋剂的检测方法
之免疫分析法
一、兴奋剂的概念 二、免疫分析法
（1）酶联免疫分析法 （2）放射64年，国际运动医学会的国际兴奋剂 会议将兴奋剂的概念定义为: 参加竞赛的 运动员使用任何异体物质，或以不正常的 量和不正常的进入机体的途径使用生理物 质，试图人为地以不正当方式提高其竞赛 成绩的行为。
抽干。
4、结果
γ一记数 仪记数， 并自动计 算尿中MA
浓度 (ng·ml-1)
3、化学发光免疫分析法（CLIA）
1977年Halman将化学反应系统与免疫系统相 结合，创建了化学发光免疫测定法(CLIA )，以检 测抗原或抗体。CLIA是建立放射免疫分析技术 (RIA)基础上的免疫分析技术，既有免疫反应的 特异性，更兼有发光反应的高敏感。
1、酶联免疫分析法(ELISA)
酶联免疫分析法——原理
生化分析之免疫分析PPT幻灯片
参考书目:
生化分析, 李元宗,常文保, 高等教育出社,2003.
Analytical Biochemistry, D.J. Holme, H. peck, 世界图书出版公司,1999.
免疫原性的化学基础
２、抗体
通过免疫应答产生的，能够与抗原发生特 异性反应的蛋白质就是抗体。
a: 抗体的结构 b: 免疫球蛋白的种类 c: 免疫球蛋白的抗原决定簇 d: 抗体的制备 e:单克隆抗体
c)工作曲线
竞争性免疫分析分析条件的优化(2)
求最高灵敏度的优化法(1)
求最高灵敏度的优化法(2)
主要的标记 免疫分析方法
酶免疫分析方法（１）
酶标试剂
酶的选择
碱性磷酸酯酶、过氧化物酶、β-D-半乳糖苷酶、 葡萄糖氧化酶、尿素酶 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、溶菌酶、马来酸脱氢酶
酶的标记
酶标记反应要尽可能小地影响酶和免疫反应的活性； 酶与连接物之间的化学键在EIA条件下稳定； 酶的标记率要低，高的标记率会影响EIA 的灵敏度； 自由态酶及被标记物应尽可能完全地与结合物分离； 抗原与抗体上所标记的酶数目要一致，且能控制．
微粒固定相:非磁性(乳胶、琼脂糖凝胶、葡聚糖 凝胶)及磁性两类
固体表面固定相
涂覆试管
微孔板
非竞争性免疫分析(Non-competitive Immunoassay)
竞争性免疫分析 (Competitive Immunoassay)
竞争性免疫分析分析条件的优化(1)
经验性方法
a)确定标记抗原的浓度:[Ag*] =1/5[Ag]~2[Ag] b) 抗体稀释曲线
凝胶沉淀反应(免疫扩散)
单向琼脂扩散实验(Simple Diffusion Test):
免疫分析法PPT课件
全抗原： 指同时具有免疫原性和抗原特异性的
物质。 作为全抗原的物质其分子量必须足够
大（分子量>1000），且要求化学结构较 复杂，如蛋白质、多肽等。
半抗原（Hapten）：指只能与特异抗体作用
但不引起机体免疫应答的物质。
人工抗原 ：药物(半抗原) 本身不具免疫原性，
只有当它们与某些大分子的载体物质(如蛋白质 或多肽)共价结合后，才具有免疫原性。这种小 分子半抗原和大分子载体物质结合后所形成的全 抗原。人工抗原直接免疫动物可产生特异抗体。
2. 可逆性
抗原与抗体的特异性结合是由于两者 的分子结构及立体构型相互吻合，它仅发 生在分子的表面，并依靠抗原-抗体分子 间的静电力作用、疏水作用、氢键作用及 范德华引力等而存在。这种结合具有相对 稳定性，但仍为可逆反应。
3. 最适比例性
抗原抗体的结合反 应具有一定的量比关 系。只有当抗原抗体 两者的分子比例合适 时，才能发生最强的 结合反应。
抗体： (antibody ， Ab)
机体是在抗原物质的刺激下形成的一类能与 抗原特异性结合的活性球蛋白，又称免疫球蛋白 (immunoglobin ， Ig) ，由细胞合成并分泌。抗体 是机体对抗原物质产生免疫应答的重要产物，具 有各种免疫功能，主要存在于动物的血清、淋巴 液、组织液及其它外分泌液中。
免疫分析基于抗体与药物结合时所具有的 专一性和可饱和性，利用被测药物同标记药物 之间竞争抗体结合原理，建立药物浓度和响应 值（如RIA中的放射性强度）之间的函数关系， 用于体内药物分析。
抗体（Ab）、标记抗原（标记药物， Ag*）和非标记抗原（非标记药物，Ag） 三种试剂是所有免疫分析必需的基本试 剂，也是任何免疫分析试剂盒应提供的 试剂。
免疫分析法ppt
用已知不同浓度 的标准物Ag和一 定量的*Ag及限 量的Ab反应，随 着Ag增加， *Ag 与Ab结合的少，
二者变化如右图
所示。游离的 *Ag为F, *Ag-Ab为 B。
RIA反应示意图
放射免疫分析法——原理
B／(B+F)与Ag的量存在 着函数关系，绘制得标 准曲线。将未知浓度 样品按同样条件操作， 所得结合率(％)与标准 曲线相比，即可得出样 品中待测抗原的浓度。
甲基苯丙胺(MA)及其代谢物自尿排出体外， 可以通过检测尿液中的苯丙胺类兴奋剂及其 代谢物来认定吸毒者。通过建立甲基苯丙胺 放射免疫分析法 ，采用碳化二亚胺法制备甲 基苯丙胺半抗原，免疫兔使其产生相应的抗 体与Na125I标记抗原组成试剂盒，检测人体体 液中的甲基苯丙胺(MA)。
放射免疫分析法——应用
放射免疫分析法——特点
• 缺点： 1.检测中有放射性污染，对操作人员有一定的
辐射损害； 2.放射性废物处理上的困难和对环境有一定的
污染；
放射免疫分析法——应用
（尿液中苯丙胺类兴奋剂的检测）
甲基苯丙胺(MA)属于苯丙胺类兴奋剂，作 用于中枢神经系统，具有药物依赖性及毒理 学特性，是我国最为严重的滥用毒品之一。
2020/3/30
化学发光免疫分析法——应用
目前，CLIA已广泛应用于生命分析、环境 检测、临床检验、食品安全和工业分析等领域， rhGH兴奋剂检测试剂盒“CMZ-Assay”就是 利用CLIA技术分别检测22kD-hGH和非22kDhGH的浓度。
2020/3/30
化学发光免疫分析法——应用
世界反兴奋剂组织检测采用的是由Lasne等于2002年 提出的等电聚焦( isoelectric focu-sing，IEF) 结合免疫 双印迹化学发光法。
免疫分析技术PPT课件
❖ 1971年，Engvall和Perlman首次报道建立酶联免疫吸附试 验（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssays, ELISA）。
❖ 由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优 点，使其得到迅速的发展和广泛应用 。
第19页，共41页。
（3）酶联免疫分析技术
❖ 基本原理：利用酶催化底物反应的生物放大作用,提高特异性抗原-
第7页，共41页。
第二节 四种常见免疫分析技术
第8页，共41页。
（1）荧光免疫分析技术
❖ 荧光免疫分析技术是标记免疫技术中发展最早的一种，是将
抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感性和直观性结合 起来的一种方法。
➢ 1941年，Coons首次采用荧光素进行标记而获得成功。这 种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗 体技术。
❖直接法测定抗体
❖缺点：每检查一种抗体需制备相应的特异抗体。
第21页，共41页。
（3）酶联免疫分析技术
❖间接法测定抗体
❖优点：灵敏度高，在不同抗体的检测中只需应用一种 酶标抗体。既可检测抗原，也可检测抗体。
第22页，共41页。
（3）酶联免疫分析技术
❖双抗体夹心测定抗原
第23页，共41页。
（3）酶联免疫分析技术
❖ 应用：作为免疫净化柱，适用于复杂样本中痕量农 兽药残留的分离分析。
❖ 步骤：加样→洗涤→洗脱 详见下图
第37页，共41页。
免疫亲和色谱柱示意图
第38页，共41页。
第六节 免疫印迹技术
免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹 (Western blotting)，是一种借助特异性抗体鉴定抗原的 有效方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基 础上发展起来的一种新的免疫生化技术。
❖ 由于ELISA具有快速、敏感、简便、易于标准化等优 点，使其得到迅速的发展和广泛应用 。
第19页，共41页。
（3）酶联免疫分析技术
❖ 基本原理：利用酶催化底物反应的生物放大作用,提高特异性抗原-
第7页，共41页。
第二节 四种常见免疫分析技术
第8页，共41页。
（1）荧光免疫分析技术
❖ 荧光免疫分析技术是标记免疫技术中发展最早的一种，是将
抗原抗体反应的特异性与荧光物质检测的敏感性和直观性结合 起来的一种方法。
➢ 1941年，Coons首次采用荧光素进行标记而获得成功。这 种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗 体技术。
❖直接法测定抗体
❖缺点：每检查一种抗体需制备相应的特异抗体。
第21页，共41页。
（3）酶联免疫分析技术
❖间接法测定抗体
❖优点：灵敏度高，在不同抗体的检测中只需应用一种 酶标抗体。既可检测抗原，也可检测抗体。
第22页，共41页。
（3）酶联免疫分析技术
❖双抗体夹心测定抗原
第23页，共41页。
（3）酶联免疫分析技术
❖ 应用：作为免疫净化柱，适用于复杂样本中痕量农 兽药残留的分离分析。
❖ 步骤：加样→洗涤→洗脱 详见下图
第37页，共41页。
免疫亲和色谱柱示意图
第38页，共41页。
第六节 免疫印迹技术
免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹 (Western blotting)，是一种借助特异性抗体鉴定抗原的 有效方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基 础上发展起来的一种新的免疫生化技术。
《酶联免疫分析法》课件
酶联免疫分析法具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点。
酶联免疫分析法广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域。
分类：直接法、间接法、双抗体夹心法、竞争法等 应用：临床诊断、药物研发、食品安全检测、环境监测等领域 优点：灵敏度高、特异性强、操作简便、成本低等 局限性：存在假阳性和假阴性结果，需要标准化操作和严格的质量控制
汇报人：PPT
PPT,a click to unlimited possibilities
汇报人：PPT
CONTENTS
PART ONE
PART TWO
酶联免疫分析法（ELISA）是一种免疫学检测方法，用于检测样品中的抗原或抗体。
原理：利用抗原-抗体特异性结合的原理，通过酶催化底物产生颜色反应，从而定量或定性检测样品中的抗原或 抗体。
优点：灵敏度高，特异性强，检测速度快，操作简便 缺点：成本较高，需要专业人员操作，容易受到环境因素影响
PART THREE
抗原选择：选择合适的抗原，如蛋 白质、多肽等
抗原标记：将抗原与酶或荧光素等 标记物结合
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
抗原纯化：通过离心、层析等方法 纯化抗原
抗原保存：将标记好的抗原保存在 适当的条件下，如低温、避光等
检测水中有机污染物：如农药、多 环芳烃等
检测土壤中的污染物：如重金属、 有机氯农药等
添加标题
添加标题
添加标题
添加标题
检测空气中的污染物：如二氧化硫、 氮氧化物等
检测生物体内的污染物：如农药残 留、重金属等
蛋白质定量分析：通过酶联免疫分析法检测蛋白质的浓度 抗体检测：通过酶联免疫分析法检测抗体的存在和浓度 细胞因子检测：通过酶联免疫分析法检测细胞因子的存在和浓度 基因表达分析：通过酶联免疫分析法检测基因的表达水平和调控机制
酶联免疫分析法广泛应用于医学、生物学、环境科学等领域。
分类：直接法、间接法、双抗体夹心法、竞争法等 应用：临床诊断、药物研发、食品安全检测、环境监测等领域 优点：灵敏度高、特异性强、操作简便、成本低等 局限性：存在假阳性和假阴性结果，需要标准化操作和严格的质量控制
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CONTENTS
PART ONE
PART TWO
酶联免疫分析法（ELISA）是一种免疫学检测方法，用于检测样品中的抗原或抗体。
原理：利用抗原-抗体特异性结合的原理，通过酶催化底物产生颜色反应，从而定量或定性检测样品中的抗原或 抗体。
优点：灵敏度高，特异性强，检测速度快，操作简便 缺点：成本较高，需要专业人员操作，容易受到环境因素影响
PART THREE
抗原选择：选择合适的抗原，如蛋 白质、多肽等
抗原标记：将抗原与酶或荧光素等 标记物结合
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抗原纯化：通过离心、层析等方法 纯化抗原
抗原保存：将标记好的抗原保存在 适当的条件下，如低温、避光等
检测水中有机污染物：如农药、多 环芳烃等
检测土壤中的污染物：如重金属、 有机氯农药等
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检测空气中的污染物：如二氧化硫、 氮氧化物等
检测生物体内的污染物：如农药残 留、重金属等
蛋白质定量分析：通过酶联免疫分析法检测蛋白质的浓度 抗体检测：通过酶联免疫分析法检测抗体的存在和浓度 细胞因子检测：通过酶联免疫分析法检测细胞因子的存在和浓度 基因表达分析：通过酶联免疫分析法检测基因的表达水平和调控机制
第二章：免疫分析法ppt课件
55
超抗原的种类： ① 外源性超抗原(细菌性) ：金黄色葡萄球
菌A～E---肠毒素；
② 内源性超抗原(病毒性) ：小鼠乳腺肿瘤
病毒蛋白；(HIV)---人类的病毒性超抗 原等。
56
超抗原可能参与引起机体的生理和病理效 应。超抗原可与食物中毒反应、某些自身 免疫病、AIDS和一些肿瘤发病有关。
57
2．根据抗原刺激B细胞产生抗体是否需要Th细 胞(helper T cell，辅助性T细胞）辅助：
胸腺依赖性抗原(thymus-dependent antigen,TD-Ag)：如多数蛋白质抗原
胸腺非依赖性抗原(thymus-independent antigen, TI- Ag)：如细菌脂多糖，聚 合鞭毛素
淋巴细胞，简称B细胞。人类的B细胞，是在骨髓 中分化的。
47
载体-半抗原概念极其重要，它可解释
为什么低分子量化合物与体内载体蛋白 质分子结合诱发超敏性反应产生的药物 过敏症。
如苯胺类染料、镇静剂司眠脲、退热剂 阿司匹林、氨基比林以及多种抗生素分 解产物等是诱发药物过敏症的原因。
48
（三）抗原的特异性
抗原的特异性，是指某一抗原分子只能诱 导相应淋巴细胞发生免疫应答的专一性， 以及某一抗原分子只能与相应抗体或致敏 淋巴细胞特异性结合的专一性。
49
（四）共同抗原和交叉反应
一个抗原分子上可能只有一种表位，称为单 纯抗原；但是天然情况下很少发现单纯抗原， 多数抗原分子上都存在多种表位。
一般地说，不同的抗原物质具不同的表位， 故各具特异性；
22
3）免疫方式
包括抗原进入的途径、剂量、次数和间隔 时间以及免疫佐剂的使用等因素也可影响 免疫应答。
23
A、免疫原的剂量及进入途径： 剂量： ①剂量不足或过多均不引起免疫应答。 ②重复进入，引起强免疫应答。
超抗原的种类： ① 外源性超抗原(细菌性) ：金黄色葡萄球
菌A～E---肠毒素；
② 内源性超抗原(病毒性) ：小鼠乳腺肿瘤
病毒蛋白；(HIV)---人类的病毒性超抗 原等。
56
超抗原可能参与引起机体的生理和病理效 应。超抗原可与食物中毒反应、某些自身 免疫病、AIDS和一些肿瘤发病有关。
57
2．根据抗原刺激B细胞产生抗体是否需要Th细 胞(helper T cell，辅助性T细胞）辅助：
胸腺依赖性抗原(thymus-dependent antigen,TD-Ag)：如多数蛋白质抗原
胸腺非依赖性抗原(thymus-independent antigen, TI- Ag)：如细菌脂多糖，聚 合鞭毛素
淋巴细胞，简称B细胞。人类的B细胞，是在骨髓 中分化的。
47
载体-半抗原概念极其重要，它可解释
为什么低分子量化合物与体内载体蛋白 质分子结合诱发超敏性反应产生的药物 过敏症。
如苯胺类染料、镇静剂司眠脲、退热剂 阿司匹林、氨基比林以及多种抗生素分 解产物等是诱发药物过敏症的原因。
48
（三）抗原的特异性
抗原的特异性，是指某一抗原分子只能诱 导相应淋巴细胞发生免疫应答的专一性， 以及某一抗原分子只能与相应抗体或致敏 淋巴细胞特异性结合的专一性。
49
（四）共同抗原和交叉反应
一个抗原分子上可能只有一种表位，称为单 纯抗原；但是天然情况下很少发现单纯抗原， 多数抗原分子上都存在多种表位。
一般地说，不同的抗原物质具不同的表位， 故各具特异性；
22
3）免疫方式
包括抗原进入的途径、剂量、次数和间隔 时间以及免疫佐剂的使用等因素也可影响 免疫应答。
23
A、免疫原的剂量及进入途径： 剂量： ①剂量不足或过多均不引起免疫应答。 ②重复进入，引起强免疫应答。
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• 甾体：通过含游离羧基的甾体衍生物与载体蛋白相连
• 抗生素：ß-内酰胺环在偏碱性条件下可以与蛋白质的自 由氨基以酰胺键的形式共价结合；氨基糖苷类抗生素 用碳化二亚胺为连接剂实现药物和载体蛋白的连接
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17
（2）半抗原和载体的选择原则
• 半抗原：最好含有芳香结构；应考虑抗原抗体反 应的微环境；合理利用分子类似物之间的交叉反 应。
✓ 影响因素： 抗体对相应抗原的亲合力－－亲合力越高，结合越
牢固，越不易解离 环境因素对复合物的影响－pH、离子强度
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11
比例性和 反应阶段性
✓ 比例性：抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的 量比关系
前带(prezone)：抗体过量 后带(postzone)：抗原过量 等价带(equivalence zone)：抗原抗体比例合适
可能会发生改变。
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15
• 3、药物分析中，为了得到高效价的抗血清，通 常会与蛋白质载体合成人工抗原进行试验。
• 常用载体：牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白 （OA）、破伤风类毒素（TT）、钥孔蛋白 （KLH）等。
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16
（1）半抗原和载体结合的化学反应
• 多肽类激素：活化蛋白质或多肽的游离羧基形成肽键； 与蛋白质或多肽的游离羧基缩合形成肽键
• 全抗原（complete antigen）
• 半抗原（hapten）：只能与特异抗体作用，但不引起 机体免疫应答的分子
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14
2.2 药物分子的抗原性
• 1、药物分子的免疫原性 大多数的药物分子通常都是半抗原； 一些蛋白类药物、多肽类药物、激素类药物
也是完全抗原。
• 2、药物分子的抗原特异性 药物分子和蛋白质载体结合后，抗原特异性
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23
抗体的基本结构
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24
Fab：抗原结合片段 Fc：可结晶片段
➢IgG分子由四条多肽链构成，以二硫键相连，有三个功能区。
➢抗体在Fab区结合抗原分子，同时通过hi区的转动以适应不同距离的 抗原决定簇。
➢与抗原结合后，IgG分子构象改变，暴露出Fc上的活性位点，从而表
现出固定和激活补体以及粘结学单习交核流细PPT胞等亲细胞反应的功能。
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12
主要内容
一、概述 二、抗原 三、抗体与免疫反应 四、免疫分析方法及应用
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13
2.1 定义
• 抗原（antigen）：指在机体中引起特异性免疫应答 反应的物质。
• 免疫原性（immunogenicity）：被注射入动物体内后， 使其产生循环抗体或改变免疫细胞的反应性
• 抗原特异性（antigenic specificity）：具有能与特异 抗体作用的性质
《生物药物分析》
第三章 免疫分析法
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1
主要内容
一、概述 二、抗原 三、抗体与免疫反应 四、免疫分析方法及应用
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2
பைடு நூலகம்
主要内容
一、概述 二、抗原 三、抗体与免疫反应 四、免疫分析方法及应用
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3
一、概述
免疫学是研究免疫系统的结构与功能，了 解其在免疫应答反应中对机体有益的防卫功能 和有害的病理损伤的机制，研究有效的免疫措 施，实现以防病，治病为目的的一门现代医学 学科。
免疫分析
标记物 有无
酶联免疫分析 非放射免疫分析
荧光免疫分析
标记免疫分析
电化学免疫分析 化学发光免疫分析
放射免疫分析（放射污染）
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7
免疫分析检测的发展
放射免疫检测（兴起于20世纪70年代)
酶联免疫检测（兴起于20世纪80年代， 各临床机构普遍使用）；
以化学发光为代表的光生物学标记及免 疫检测技术（20世纪90年代开始推广使 用，产品步入成长期）三个阶段。
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5
在药物分析中，免疫分析法的 应用主要集中在以下几方面：
(1) 在实验药物动力学和临床药物学中，测定生物利用度 和药物代谢动力学参数等生物药剂学中的重要数据，以 便了解药物在体内的吸收、分解、代谢和排泄情况；
(2) 在药物的临床检测中，对治疗指数小、超过安全剂量 易发生严重不良反应或最佳治疗浓度和毒性反应浓度有 交叉的药物血液浓度进行监测；
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21
1、抗体的结构与功能
➢抗体泛指与待测分子特异性结合的蛋 白质分子，包括免疫球蛋白 （immunoglobulin）, 受体（receptor） 和其他结合蛋白质，主要是免疫球蛋 白，常用的是IgG分子 .
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22
免疫球蛋白的基本结构
• IgG分子基本结构是由四个肽链组成的，二条较 小的轻链和二条较大的重链，轻链与重链是由 二硫键连接形成，分为氨基端（N端），羧基 端（C端）。
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4
什么叫免疫分析？ ➢ 基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种技
术手段。抗原抗体反应是指抗原与相应的抗体之 间发生的特异性结合反应。它既可以发生在体内， 也可以发生在体外。 ➢ 在体内发生的抗原抗体反应为体液免疫应答的效 应作用。体外的抗原抗体结合反应主要用于抗原 或抗体的检测，用于免疫学诊断。
• 载体：载体对监测系统的影响；载体效应在免疫 过程中的影响。
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（3）合成抗原的测定
• 定性测定方法：光谱分析、热力学分析 • 定量测定方法：相对含量测定；绝对含量测定。
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主要内容
一、概述 二、抗原 三、抗体与免疫反应 四、免疫分析方法及应用
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➢免疫分析实际上是一种特殊的试剂分析， 特点是抗体成为分析试剂。
(3) 在药物生产中，从发酵液或细胞培养液中快速测定有 效组分的含量，以实现对生产过程的在线监测；
(4) 对药品中是否存在特定的微量有害杂质进行评价。
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➢免疫分析：
利用抗原与抗体的特异性结合作用，来选择性识别和测定，可 以作为抗体或抗原的待测物.
➢免疫分析方法
非标记免疫分析（抗原抗体结合理化性质发生变化）
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免疫分析法的特点
特点
特异性
可逆性
比例性 反应阶段性
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特异性
✓ 特异性：抗原与抗体结合反应的专一性
✓ 分子基础:抗原表位与抗体分子高变区之间
空间构型的互补性
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可逆性
✓ 可逆性：抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条 件下又可解离为游离抗原与抗体，解离后的抗原或抗 体均能保持原有的结构和活性。
• 抗生素：ß-内酰胺环在偏碱性条件下可以与蛋白质的自 由氨基以酰胺键的形式共价结合；氨基糖苷类抗生素 用碳化二亚胺为连接剂实现药物和载体蛋白的连接
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（2）半抗原和载体的选择原则
• 半抗原：最好含有芳香结构；应考虑抗原抗体反 应的微环境；合理利用分子类似物之间的交叉反 应。
✓ 影响因素： 抗体对相应抗原的亲合力－－亲合力越高，结合越
牢固，越不易解离 环境因素对复合物的影响－pH、离子强度
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比例性和 反应阶段性
✓ 比例性：抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的 量比关系
前带(prezone)：抗体过量 后带(postzone)：抗原过量 等价带(equivalence zone)：抗原抗体比例合适
可能会发生改变。
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• 3、药物分析中，为了得到高效价的抗血清，通 常会与蛋白质载体合成人工抗原进行试验。
• 常用载体：牛血清白蛋白（BSA）、卵清白蛋白 （OA）、破伤风类毒素（TT）、钥孔蛋白 （KLH）等。
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（1）半抗原和载体结合的化学反应
• 多肽类激素：活化蛋白质或多肽的游离羧基形成肽键； 与蛋白质或多肽的游离羧基缩合形成肽键
• 全抗原（complete antigen）
• 半抗原（hapten）：只能与特异抗体作用，但不引起 机体免疫应答的分子
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2.2 药物分子的抗原性
• 1、药物分子的免疫原性 大多数的药物分子通常都是半抗原； 一些蛋白类药物、多肽类药物、激素类药物
也是完全抗原。
• 2、药物分子的抗原特异性 药物分子和蛋白质载体结合后，抗原特异性
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抗体的基本结构
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Fab：抗原结合片段 Fc：可结晶片段
➢IgG分子由四条多肽链构成，以二硫键相连，有三个功能区。
➢抗体在Fab区结合抗原分子，同时通过hi区的转动以适应不同距离的 抗原决定簇。
➢与抗原结合后，IgG分子构象改变，暴露出Fc上的活性位点，从而表
现出固定和激活补体以及粘结学单习交核流细PPT胞等亲细胞反应的功能。
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主要内容
一、概述 二、抗原 三、抗体与免疫反应 四、免疫分析方法及应用
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2.1 定义
• 抗原（antigen）：指在机体中引起特异性免疫应答 反应的物质。
• 免疫原性（immunogenicity）：被注射入动物体内后， 使其产生循环抗体或改变免疫细胞的反应性
• 抗原特异性（antigenic specificity）：具有能与特异 抗体作用的性质
《生物药物分析》
第三章 免疫分析法
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主要内容
一、概述 二、抗原 三、抗体与免疫反应 四、免疫分析方法及应用
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பைடு நூலகம்
主要内容
一、概述 二、抗原 三、抗体与免疫反应 四、免疫分析方法及应用
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一、概述
免疫学是研究免疫系统的结构与功能，了 解其在免疫应答反应中对机体有益的防卫功能 和有害的病理损伤的机制，研究有效的免疫措 施，实现以防病，治病为目的的一门现代医学 学科。
免疫分析
标记物 有无
酶联免疫分析 非放射免疫分析
荧光免疫分析
标记免疫分析
电化学免疫分析 化学发光免疫分析
放射免疫分析（放射污染）
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免疫分析检测的发展
放射免疫检测（兴起于20世纪70年代)
酶联免疫检测（兴起于20世纪80年代， 各临床机构普遍使用）；
以化学发光为代表的光生物学标记及免 疫检测技术（20世纪90年代开始推广使 用，产品步入成长期）三个阶段。
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在药物分析中，免疫分析法的 应用主要集中在以下几方面：
(1) 在实验药物动力学和临床药物学中，测定生物利用度 和药物代谢动力学参数等生物药剂学中的重要数据，以 便了解药物在体内的吸收、分解、代谢和排泄情况；
(2) 在药物的临床检测中，对治疗指数小、超过安全剂量 易发生严重不良反应或最佳治疗浓度和毒性反应浓度有 交叉的药物血液浓度进行监测；
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1、抗体的结构与功能
➢抗体泛指与待测分子特异性结合的蛋 白质分子，包括免疫球蛋白 （immunoglobulin）, 受体（receptor） 和其他结合蛋白质，主要是免疫球蛋 白，常用的是IgG分子 .
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免疫球蛋白的基本结构
• IgG分子基本结构是由四个肽链组成的，二条较 小的轻链和二条较大的重链，轻链与重链是由 二硫键连接形成，分为氨基端（N端），羧基 端（C端）。
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什么叫免疫分析？ ➢ 基于抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种技
术手段。抗原抗体反应是指抗原与相应的抗体之 间发生的特异性结合反应。它既可以发生在体内， 也可以发生在体外。 ➢ 在体内发生的抗原抗体反应为体液免疫应答的效 应作用。体外的抗原抗体结合反应主要用于抗原 或抗体的检测，用于免疫学诊断。
• 载体：载体对监测系统的影响；载体效应在免疫 过程中的影响。
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（3）合成抗原的测定
• 定性测定方法：光谱分析、热力学分析 • 定量测定方法：相对含量测定；绝对含量测定。
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主要内容
一、概述 二、抗原 三、抗体与免疫反应 四、免疫分析方法及应用
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➢免疫分析实际上是一种特殊的试剂分析， 特点是抗体成为分析试剂。
(3) 在药物生产中，从发酵液或细胞培养液中快速测定有 效组分的含量，以实现对生产过程的在线监测；
(4) 对药品中是否存在特定的微量有害杂质进行评价。
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➢免疫分析：
利用抗原与抗体的特异性结合作用，来选择性识别和测定，可 以作为抗体或抗原的待测物.
➢免疫分析方法
非标记免疫分析（抗原抗体结合理化性质发生变化）
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免疫分析法的特点
特点
特异性
可逆性
比例性 反应阶段性
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特异性
✓ 特异性：抗原与抗体结合反应的专一性
✓ 分子基础:抗原表位与抗体分子高变区之间
空间构型的互补性
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可逆性
✓ 可逆性：抗原与相应抗体结合成复合物后，在一定条 件下又可解离为游离抗原与抗体，解离后的抗原或抗 体均能保持原有的结构和活性。