透射电镜的样品制备技术

支持膜的制作
支持膜是一种能支持观察样品的膜，厚度 约20nm。性能良好的支持膜应具备： 1.较高的透明度 2.在电镜下无可见结构
3.与所支持的各种样品不发生化学反应
方华膜、碳膜、火棉胶基底碳膜、硝化纤维素基底碳膜、微筛膜等
支持膜的制作
方华膜（方华的
化学成分是聚乙 烯醇缩甲醛，为 淡黄色粉末）： 准备-附膜-漂膜-
• 操作步骤（以全身灌流固定法为例） 麻醉要进行灌流的动物,将动 物固定于实验台上,打开胸腔暴露 心脏,将针头刺入左心室，剪开右 心耳以引出血液和灌流液。用注射 器或输液器缓慢注入37 ℃、 0.9%NaCl,直至内脏血色消失或流 出液无血色为止,注入4 ℃固定液， 待组织变硬后取材。
体外培养细胞的固定
多聚甲醛(Paraformaldehyde)
• 白色粉末，使用浓度为4％ • 优点 –对组织的浸透力强 –保存抗原性物质，多用于免疫电镜技 术中 • 缺点 –高浓度时可使组织结构流失，多不单 独使用
常用缓冲液
• 用于配制固定液和漂洗
0.2M磷酸盐缓冲液:较常用 0.2M二甲砷酸盐缓冲液:用于电镜细胞化学
• 可使核酸、蛋白质、结缔组织纤维的反差增强。
–0.1％～0.4％柠檬酸铅
• 可使膜结构、脂类的反差增强。
正染色
TEM样品：
①超薄切片厚度要均匀 ②无震颤 ③无刀痕 ④无染色污染 ⑤反差适当
负染技术
• 指利用重金属盐类与结构背景 相结合，增加背景电子散射能 力，使背景呈黑色，样品结构 变亮。
原位固定法
• 多用于解剖关系比较复杂、质地柔软或对 缺氧比较敏感的组织。以保证器官的血液 供给，避免缺血造成的组织损伤或自溶。 • 操作步骤 在动物麻醉后保持血液供应的条件下， 边解剖边在取材的部位局部滴加固定液， 直至组织达到适当的硬度为宜。
灌流固定法
• 指通过血液循环途径，将固定液灌 注到组织器官内，进行固定后再取材的 方法。常用于对缺氧敏感，死后变化快 的组织器官，如中枢神经系统、心脏、 胃肠道、视网膜和肾脏等。也可用于所 取组织的种类较多以及解剖关系比较复 杂、难以渗透的组织器官。 • 包括全身灌流固定法（适用于小动 物）和器官灌流固定法（适用于大动 物）。
Fig. 4. Colloidal gold nanoparticles (20 nm). 1: anti-TTX Mab labelled colloidal gold nanoparticles (showing the protein halo around the labelled nanoparticles), 2: unlabelled colloidal gold nanoparticles.
二.固定
• 目的
–尽可能保存组织和细胞在生活状态下的结构 –使细胞内的各种成分固定下来，避免在以后 的冲洗和脱水等步骤中溶解和流失 –防止细胞内酶活性造成的细胞自溶 –防止外界微生物侵入繁殖而产生腐败致使细 胞的超微结构遭受破坏
• 方法
–物理方法 •快速冷冻法 •干燥法 –化学方法 •浸泡固定法 •原位固定法 •灌流固定法
浸泡固定法
是将所取样品直接放入预冷固定液内固定 的方法，适用于大多数组织器官。最常用的 是戊二醛、锇酸双重固定。 操作步骤:
前固定： 2.5%-4%戊二醛
后固定：1%锇酸 漂洗： 蒸馏水 4℃
4℃
1-2h或数月
2-4h 中间换3次 30min） 10min
漂洗：用配固定液的缓冲液 4℃ 4℃
1.5-2h（培养细胞
捞膜
支持膜的制作
碳膜：观察高分
辨率的样品及某
些悬浮液对方华 膜有溶解作用时 需用碳膜。碳膜 的机械性能及化
学性能较好，减
少热漂移。喷膜漂膜摆网-捞膜
• 切片的厚度可根据干涉色来判断。
–暗灰色调 40nm –灰色 40-50nm，较薄，易被电子 束击破 –银白色 60-70nm，最常用 –金黄色 70-80nm –紫色为 90nm以上，较厚，细节结 构不清
化学的包埋后染色。
包埋剂配方（K4M) K4M(单体） 交联剂 引发剂 8.65g 1.35g 50mg
LR white: 为混合的丙烯酸单体，对脂类溶 解度低，保存膜结构较好，可耐受电
子束轰击，因而可不做支持膜。热聚
合60 ℃；冷聚合-25 ℃ ，加速剂协助
聚合。
包埋方法
1.常规包埋方法 适用于大多数组织块及细胞团
一.取材
• 从人体、动植物、细胞和微生物的培养物中 选取电镜观察材料的过程。 • 在活体取材时要做到： •快─离体1～2min内放入固定液 •准─取材部位要准，有代表性 •小─1mm×1mm×1mm大小，太小时结构少， 太大时固定不充分结构保存不好 •轻─动作要轻，器械要锋利 •冷─0℃ ～ 4℃ ，器械、容器、固定液 均需预冷
超薄切片质量好坏指标
• 样品结构保存良好，结构细腻，无丢失。 • 切片厚薄均匀，厚度在60-90nm之间。表面 无皱折、刀痕、震颤等缺陷。 • 样品反差良好，无染色沉淀。 • 支持膜厚度适中，观察时不产生漂移和破裂。
六.电子染色
• 利用重金属盐类选择性地与生物样品中不同 结构成分相结合，来提高结构成分散射电子 的能力，从而增加图像反差的染色，又称为 正染色。 • 常用的染色剂: –0.5％～１％醋酸双氧铀
• 超薄切片:采用超薄切片机
–操作步骤: •包埋块固定 •刀固定 •水槽加水 •切片 •选片 •捞片
切片带弯曲可能原因及解决办法
可能原因 梯形或矩形组织面上下边不平行 刀刃锋利程度不一
解决办法 用双面刀片重新休整组织切面使之平行 更换新玻璃刀
组织面上边或下边与刀刃不平行
重新调整组织与刀刃距离，使之平行
注意事项 （负染） 样品浓度要适中 样品要不含杂质 样品的pH值要与染液pH值一致 掌握滴染时机（样品要未完全干燥时） 负染样品观察时，加速电压要适当,物镜 光阑要小，反差较好，照相要快.
Fig. 1. The labelling results of colloidal gold probe. A: colloidal gold, B: labeled colloidal gold (showing the protein halo around the labeled particles).
常用固定剂
• 戊二醛(Glutaraldehyde，GA)
–无色透明液体，pH=4，使用浓度为2.5～4％， 使用温度4℃。 – 优点
• 穿透能力强 • 能较好地保存蛋白质、碳水化合物的结构及酶的 活性 • 固定保存时间长(4℃可达数周至数月)
–
缺点
• 组织反差不好 • 对脂类无固定作用 • 固定后标本要充分冲洗
生物医学样品的特点：
1、样品多样化，包括组织、细胞、微生物及生 物大分子。 2、含水量多、质地软、脱水时容易皱缩变形。 3、机械程度低，对电子束轰击的耐受力差。 4、多由低原子序数的元素组成，故导电性能差。 5、样品形态对试剂的PH值及温度较敏感
主要步骤
• 取材 • 固定 • 脱水 • 浸透及包埋 • 切片 • 染色
染色剂
磷钨酸（PTA） pH 6.7-7
染色步骤
复膜载网－滴样品-滴染1-2min－用滤纸 吸去染液－观察
优点
适用于悬浮液的样品（细菌、病毒、其他 微生物、大分子、分离细胞器） 操作快速、简便 样品用量少 图像结构反差好
小结：（超薄切片） 1.取材:要求部位准确,块小,时间短,低温,器械锋利, 减小机械损伤. 2.固定:戊二醛固定时间可以适当延长,一般不要超过 一周,期间要更换一次固定液,且要保持低温固定,充 分清洗后再进行锇酸固定1-2小时,时间一定不要太长. 3.脱水:锇酸固定后经过充分清洗,进行酒精梯度脱水, 一般50%,70%,80%,95%,无水酒精, 4.样品侵透,包埋.一定要保持干燥,侵透彻底. 5.聚合:由室温到高温梯度升温聚合.如35度,45度,60 度顺序. 6.超薄切片:切片机性能,片厚度,捞片,载网质量都需 要注意. 7.电子染色:过程中一定要避免一切污染.
锇酸(Osmium tetroxide OsＯ4) • 淡黄色块状结晶，使用浓度1～4％， 使用温度4℃。 • 优点 –对蛋白质和脂类有较好的固定作用 –可避免组织块收缩或膨胀 –可产生明显的反差
锇酸(Osmium tetroxide OsＯ4)
• 缺点 –分子量大，穿透能力差 –对碳水化合物和酶固定效果不好 –固定时间较长易引起组织变脆 –有强烈的刺激味对角膜、鼻粘膜有毒性作用 –光热作用时易发生变化
透射电镜的生物 样品制备技术
分为两类： • 透射电镜样品的基本制备技术 –超薄切片技术 –负染技术 • 生物样品特殊制样技术
超薄切片技术
• 概念:
指制备厚度低于100nm的切片技术。
• 特点：
• 是透射电镜生物样品制备技术中最 常见、最基本的技术； • 是其他技术方法的基础； • 程序长、操作较复杂、精细。
五.切片
• 目的：制备厚度小于100nm的切片 • 准备工作: 1.复膜载网
• 支持膜 –formvar膜 –火棉胶膜 –碳膜 用于负染技术 • 支持网 –铜网 常用 –不锈钢网、镍网、铂网（组化用）
2.制刀
3.修块 –目的是去除组织块周围多余的包埋介 质，便于切片。 • 半薄切片: –目的是确定所要观察的准确部位，厚 度为0.5～1μ m，用甲苯胺兰染色显示。
常用的包埋剂
具有低黏度、亲和性强和优良的切割性能， 切片透明度高，组织结构保存好，并能耐受 电子束的轰击及在低温下聚合的特点。
• 环氧树脂Epon812(进口) 渗入组织容易，对细胞结构保存好，较 常用。 • 丙烯酸酯（acrylicwk.baidu.comresin) 618(国产)
Lowcryl K4M：
为低温水溶性包埋剂，较常用。特点是低温下(-35 ℃) 可保持低黏度；在紫外光（波长360nm）下可聚合。聚合后 可在常温下切片；能较好地保持组织结构和抗原性及植物凝 血素结合部位，减少背景非特异性染色，故多用于免疫细胞
• 单层细胞固定 • 悬浮细胞固定
加入融化的2%琼脂或BSA增加粘附性。 离心。
三.脱
• 目的
水
–将组织内部游离的水分脱净，有利于 浸透和包埋
• 常用脱水剂
–乙醇:使组织收缩较小，但与包埋剂的互溶
性差
–丙酮:可溶解脂类，与包埋剂的互溶性好，
但易使组织变脆
脱水步骤
• 从低浓度至高浓度系列脱水
–50% 酒精 4℃ 10～15min –70% 酒精 4℃ 10～15min或过夜 –80% 酒精 室温 10～15min –90% 酒精 室温 10～15min –95% 酒精 室温 10～15min –95%酒精：95%丙酮（1：1）室温 10～15min –95%丙酮 室温 10～15min –无水丙酮 室温 40min 中间换一次
• 2 、切片及单层培养细胞（需要在玻片上进 行）： 在光镜下选出所需观察的部位，在玻片反面 用笔做好标记。前固定、漂洗、后固定，脱水 及浸透同常规包埋方法，但各步骤时间可适当 缩短。在玻片有标记处的正面位置滴上包埋剂， 将顶端平整的废包埋块压在其上，于60 ℃聚合 硬化。将粘有包埋块的玻片置于90 ℃热板上加 温10s，取下包埋块修块，超薄切片及电子染色。
• 浸透
–环氧丙烷 室温 –环氧丙烷:包埋剂 1:1 –包埋剂 室温 20min 室温 3h 40-60min
• 包埋
–将样品放入包埋板或胶囊内 –放好标签 –充填满包埋剂
• 聚合(使包埋剂变硬)
35 ℃ 45 ℃ 55 ℃ 12h 12h 12h
2.原位包埋法
适用于组织块中数量少的特殊结构，如： 运动终板；冷冻切片、半薄切片及单层培养细 胞的某些结构的观察. • 1、组织块：前固定后用振动切片机切成50100μ m的厚片，显微镜下选出含有所需结构的 厚片进行漂洗。经过1%锇酸后固定，乙醇及 丙酮系列脱水，环氧树脂浸透，把厚片铺于载 玻片上，将顶端平整的废包埋块安在切片的特 定部位上，60 ℃聚合后修块，常规切片及染 色。
四.浸透及包埋
• 浸透：目的是使包埋剂逐渐取代脱水剂
渗透到组织细胞中。因包埋剂与脱水剂不 相溶，需用一种既能与脱水剂相溶，又能 与包埋剂相溶的物质进行转换，常用的转 换剂为环氧丙烷。
• 包埋：目的是让包埋剂完全浸透到组织
细胞内部，使组织具有一定的硬度、弹性 和韧性，能够承受切片时的各种压力，以 便制备超薄切片.