原核生物的同源重组

原核生物的同源重组在生物细胞中，DNA或RNA分子间或分子内的同源序列能在自然条件下以一定的频率发生重新组合，这个过程称为同源重组（Homologous Recombination）。

同源重组的频率与DNA 或RNA序列的同源程度（即序列的相似程度）、同源区域大小以及生物个体的遗传特性密切相关，一般而言，同源程度越高、同源区域越大，重组的频率就越高。

同源重组是生物进化的一种重要方式，对于原核细菌、噬菌体和病毒而言，同源重组现象的发生尤为普遍。

3.1.1 原核细菌的基因转移程序原核细菌的基因转移程序是基于物理学和生物学的原理建立起来的，将质粒或噬菌体DNA导入细菌受体细胞的方法主要有以下几种：1．Ca2+诱导转化法1970年，有人发现用CaCl2处理过的大肠杆菌能够吸收噬菌体DNA，此后不久，对这种程序进一步的优化实现了质粒DNA转化大肠杆菌的感受态细胞，其整个操作程序如图3-1所示。

将处于对数生长期的细菌置入0℃的CaCl2低渗溶液中，使细胞膨胀，同时Ca2+协助细胞膜磷脂层形成液晶结构，使得位于外膜与内膜间隙中的部分核酸酶离开所在区域，这就构成了大肠杆菌人工诱导的感受态。

此时加入DNA，Ca2+又与DNA结合形成抗脱氧核糖核酸酶（DNase）的羟基-磷酸钙复合物，并粘附在细菌细胞膜的外表面上。

经短暂的42℃热脉冲处理后，细菌细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，随之出现许多间隙，致使通透性增加，DNA 分子便趁机进入细胞内。

此外在上述转化过程中，Mg2+的存在对DNA的稳定性起很大的作用，MgCl2和CaCl2又对大肠杆菌某些菌株感受态细胞的建立具有独特的协同效应。

1983年，有人除了用CaCl2和MgCl2处理细胞外，还设计了一套用二甲基亚砜（DMSO）和二巯基苏糖醇（DTT）进一步诱导细胞产生高频感受态的程序，从而大大提高了大肠杆菌的转化效率。

目前，Ca2+诱导法已成功地用于大肠杆菌、葡萄球菌以及其它一些革兰氏阴性菌的转化。

2．原生质体转化法在高渗培养基中生长至对数生长期的细菌，用含有适量溶菌酶的等渗缓冲液处理，剥除其细胞壁，形成原生质体，它丧失了一部分定位在膜上的DNase，有利于双链环状DNA分子的吸收。

此时，再加入含有待转化的DNA样品和聚乙二醇的等渗溶液，均匀混合。

通过离心除去聚乙二醇，将菌体涂布在特殊的固体培养基上，再生细胞壁，最终得到转化细胞。

这种方法不仅适用于芽孢杆菌和链霉菌等革兰氏阳性细菌，也对酵母菌、霉菌甚至植物等真核细胞有效。

只是不同种属的生物细胞，其原生质体的制备与再生的方法不同。

3．电穿孔转化法电穿孔（Electroporation）是一种电场介导的细胞膜可渗透化处理技术。

受体细胞在电场脉冲的作用下，细胞壁上形成一些微孔通道，使得DNA分子直接与裸露的细胞膜脂双层结构接触，并引发吸收过程。

这项技术最早用于将重组DNA导入真核细胞，但最近已被发展用来转化大肠杆菌等其它原核生物。

理论上来说，较高的电压和较长的脉冲时间有利于转化效率的提高，但在这种情况下细胞的生存率也大幅度降低，使得表观转化效率受到很大影响。

因此，针对受体细胞的性质合理优化电场强度、脉冲时间和DNA浓度是获得最佳转化效率的必要条件。

对于大肠杆菌来说，大约50l的细菌与DNA样品混合后，置于装有电极的槽内，然后选用大约25微法拉第、千伏和200欧姆的电场强度处理毫秒，每微克DNA可获得109~1010个转化子的理想转化率。

虽然电穿孔法转化较大的重组质粒（>100 kb）的转化效率比小质粒（约3 kb）低1000倍，但比Ca2+诱导和原生质体转化方法效果要好，因为这两种方法几乎不能转化大于100 kb的质粒DNA。

几乎所有的细菌均可找到一套与之匹配的电穿孔操作条件，因此电穿孔转化方法有可能成为细菌转化的标准程序。

4．碱金属离子法用高浓度的碱金属离子溶液（尤其是钾离子）处理细菌，可以提高质粒的转化率。

这种方法的优点是能同时转化单体和线型质粒DNA。

将细胞悬浮在氯化钾溶液中，然后在35%PEG 的存在下，用质粒DNA进行转化，每微克DNA可获得103个转化子。

研究表明，单价阳离子能诱导细菌细胞内自溶酶系统的活化，这是转化得以实现的机制。

5．接合转化法接合（Conjugation）是指通过细菌细胞之间的直接接触导致DNA从一个细胞转移至另一个细胞的过程。

这个过程是由接合型质粒完成的，它通常具有促进供体细胞与受体细胞有效接触的接合功能以及诱导DNA分子传递的转移功能，两者均由接合型质粒上的有关基因编码。

在DNA重组中常用的绝大多数载体质粒缺少接合功能区，因此不能直接通过细胞接合方法转化受体细胞，然而如果在同一个细胞中存在着一个含有接合功能区域的辅助质粒，则有些克隆载体质粒便能有效地接合转化受体细胞。

因此，首先将具有接合功能的辅助质粒转移至含有重组质粒的细胞中，然后将这种供体细胞与难以用上述转化方法转化的受体细胞进行混合，促使两者发生接合作用，最终导致重组质粒进入受体细胞。

接合转化的标准程序如图3-2所示。

整个过程涉及到包括受体菌在内的三种菌株的混合，即受体菌、含有接合质粒的辅助菌以及含有待转化重组质粒的供体菌。

三者混合后，接合质粒即可从辅助菌株转移至供体菌，也可直接进入受体菌。

含有两种相容型质粒的供体菌再与受体菌或辅助菌发生接合反应。

此时细菌混合液中已出现多种形式的细胞，因为任何菌株接合发生频率都不可能达到100%。

为了迅速而准确地筛选出仅接纳了重组质粒的受体细胞（即接合转化细胞），必须依赖于所使用的菌种和质粒上相应的遗传标记，例如携带接合质粒的菌株A不能在最小培养基上生长，且对抗生素X敏感；含有待转化的重组质粒的菌株B，也不能在最小培养基生长，它如果失去含有X抗性基因的重组质粒，则同样对X敏感；受体细胞C能在最小培养基中生长，且在抗生素X和Y存在时不能生长。

三种菌株首先在无抗生素的完全培养基中进行混合，短暂培养启动接合转化，然后迅速涂布在含有抗生素的最小培养基上进行筛选。

此时，只有接纳了重组质粒的受体细胞才能长成菌落（克隆），其中为数极少的菌落含有双质粒。

随机选择几个菌落，将之涂布在含有抗生素的最小培养基上，凡是在这种培养基中不能生长的菌落即为只含有重组质粒的受体转化克隆，因为只有接合质粒所携带的Y抗生素抗性基因能赋予受体细胞对Y的抗性。

应当特别指出的是，在接合转化过程中使用的重组质粒与接合质粒必须具有互为相容性，否则两者难以稳定地存在于供体菌中。

6．噬菌体转导法以-DNA为载体的重组DNA分子，由于其分子量较大，通常采取转染的方法将之导入受体细胞内。

在转染之前必须对重组DNA分子进行人工体外包装，使之成为具有感染活力的噬菌体颗粒。

用于体外包装的蛋白质可以直接从大肠杆菌的溶原株中制备，现已商品化。

这些包装蛋白通常被分成分离放置且功能互补的两部分，一部分缺少E组份，另一部分缺少D 组份。

包装时，只有当这两部分的包装蛋白与重组-DNA分子三者混合后，包装才能有效进行，任何一种蛋白包装溶液被重组分子污染后均不能包装成有感染活力的噬菌体颗粒，这种设计是基于安全考虑。

整个包装操作过程与转化一样简单：将-DNA和外源DNA片段的连接反应液与两种包装蛋白组份混合，在室温下放置一小时，加入一滴氯仿，离心除去细菌碎片，即得重组噬菌体颗粒的悬浮液。

将之稀释合适的倍数，并和处于对数生长期的大肠杆菌受体细胞混合涂布，过夜培养即可用于筛选与鉴定。

3.1.2 与同源重组有关的原核生物基因原核生物细胞中的同源重组是个较为复杂的过程，涉及到下列多个基因的联合作用： 1．recA基因在一项以高频转导细菌为供体、F-细胞为受体的大肠杆菌接合实验中，人们筛选出无法产生选择性突变子的F-克隆，从而分离得到recA突变子。

它与野生型亲本株的不同点在于其转导缺陷特征，对紫外线和X射线呈现高度耐受性，既不为紫外线所突变，也不能使紫外线失活的-噬菌体回复突变，更无法通过紫外线诱导溶源噬菌体进入裂解循环。

进一步的研究结果表明，大肠杆菌recA基因编码的RecA蛋白是一个39 kDa的单一多链肽，它作为一种重要的重组酶参与同源重组，其主要作用包括促进DNA同源片段的联会以及DNA分子间的单链交换。

由于RecA蛋白具有依赖于单链DNA的ATP酶活性，因此涉及到所有耗能的DNA反应，如互补单链DNA区域的退火、线状单链DNA和环状双链DNA间D-噜噗结构的形成、线状双链DNA和环状单链DNA转变成线状单链DNA和环状双链DNA、两条线状双链DNA分子间的单链交联（即同源重组Holliday机制的中间体，图3-3）等。

RecA介导的同源重组反应对单链DNA的结构要求与同源DNA分子间的联会机制有关。

在中性pH的条件下，RecA能大量结合于单链DNA，每个单体与单链DNA上的3-5个碱基结合，而且这种结合作用呈现高度的协同效应。

此外，RecA还具有依赖pH和ATP等三磷酸核苷酸的双链DNA结合活性。

这种持续的结合作用使得双链DNA有效地解离为单链，直到与含有大于50碱基的同源区域发生联会，并形成Holliday中间体hDNA。

在RecA蛋白催化的D-噜噗分叉迁移反应中，单链DNA同化是单方向的，速度极慢，每秒仅几个碱基，并且存在着1%以上的错配碱基。

RecA介导的链同化反应对于DNA底物具有较强的选择性，两种不同类型的反应证明了这一点。

只有当双链DNA的3’端同源并互补于单链环状DNA分子时，它们的重组才能形成稳定的hDNA；类似地，在SSB蛋白存在的情况下，只有当线状单链DNA的3’端与环状双链DNA同源时，hDNA结构才能产生。

这说明单链同化反应只能沿着的固定方向进行，这个方向对双链DNA上的互补链来说是3’→5’；而对于入侵的单链DNA来说则是5’→3’。

RecA 蛋白要求单链或双链DNA分子上具有3’同源末端以启动稳定的链同化反应。

RecA促进DNA同源重组反应并形成稳定的重组产物，要求底物具备三个条件：即DNA 分子间或分子内存在较高的同源序列、至少一种DNA底物呈单链结构、至少一条DNA链具有自由末端。

但值得注意的是，当拓扑异构酶参与反应时，最后一个条件并不是必需的。

对纯化的RecA蛋白和完整细胞的研究表明，有效重组事件的发生至少需要40~50个碱基对的同源性，30个同源碱基对通常不能发生联会作用。

类似RecA的蛋白质广泛存在于各种细菌中，鼠伤寒沙门氏杆菌（Salmonella typhimurium）和奇异变形杆菌（Proteus mirabilis）等细菌均含有能互补大肠杆菌recA 突变株的DNA片段，并诱导SOS反应。

它们所编码的蛋白质结构呈高度保守性，并且具有相近的分子量（约40 kDa），这表明由RecA蛋白介导的同源重组机制具有广泛的代表性。