基因诊断与产前诊断中常用的分子生物学技术

我们实验室基于Sanger法实现的 DNA自动测序原理图：
DNA测序大体步骤：
• • • • 测序模板PCR 测序产物纯化——酒精/EDTA/NaAc法 上机毛细管电泳——高分辨率变性胶电泳 数据处理
MLPA
• • • • • 实验原理 操作流程 主要优点 技术应用 结果分析（以DMD为例）
MLPA实验原理：
PCR实验步骤：
• 变性（Denaturation） 将待扩增DNA模板加热， 一般变性温度为95℃，双链DNA变性成为单链 DNA。 • 退火（Anealing） 两条引物分别与两条DNA的两 翼序列特异性结合——复性。退火温度（Tm）与 引物序列的碱基组成、长度相关。 • 延伸 ( Extention) 在适合的条件下，由Taq(或其 他)DNA聚合酶催化引导DNA合成，即引物的延伸。 延伸的温度一般是72℃， 这种热变性—复性—延伸的过程就是一个PCR循 环。
目的片段的指数扩增
PCR反应体系（终体积20~100ul）：
• • • • • • 10×PCR缓冲液 2mmol/L dNTP 引物 DNA模板 Taq DNA聚合酶 ddH2O 1/10体积 1/10体积 各10~50pmol 10~20拷贝 0.2~2.5U 补至终体积
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)
DNA测序：
• 实验原理（Sanger法） • 实验步骤
DNA测序原理：
• 目前用于测序的技术主要有Sanger等发明 的双脱氧链末端终止法和Maxam 和Gilbert 发明的化学降解法。这两种方法原理上差 异很大，但都是根据核苷酸在某一固定的 点开始，随机在某一特定的碱基处终止， 产生A,T,G,C四组不同长度的一系列核苷酸， 然后再变性的PAGE胶上电泳进行检测，从 而获得DNA序列。在这里主要讲解我们实 验室的测序法——Sanger双脱氧链终止法
脱 氧 核 苷 酸 与 双 脱 氧 核 苷 酸 结 构
DNA复制是按着5’（核苷酸戊糖的5位碳原子 处接着的磷酸基团）向3’（核苷酸戊糖的3 位碳原子处接着的羟基基团）方向进行的。 在DNA复制过程中起关键作用的酶是DNA 聚合酶，该酶只能将游离的核苷酸加到新 链的3’端（而绝不是5’端）。因为双脱氧的 核苷酸3’端的羟基也脱了氧，所以就不能继 续形成3’，5’-磷酸二酯键了，所以新链不能 继续延伸，故DNA复制终止于双脱氧核苷 酸处。
Sanger法测序基本原理示意图：
DNA自动测序原理：
• PCR体系中含有正常dNTP和四色荧光标记 的ddNTP。 • ddNTP 的3′端为-H ，其不能和后续dNTP 形成磷酸二酯键，从而终止延伸。 • PCR反应中dNTP与ddNTP产生竞争，形成 大量不同片断的产物。 • PCR产物进行毛细管电泳，根据荧光峰识 别每一个碱基。
MLPA操作流程图：
主要优点
• 所需样本量小，仅需30 ng DNA即可完成检测； • 可实现多重分析，同时可对46种靶基因位点进行检测； • 检测精确度高，能够检测出单个碱基的突变或SNP及基 因拷贝数一倍量的增加或减少； • 所需仪器简单，只需一个PCR仪和一个电泳分析系统； ； • 耗时短，24 h内即可出结果； • 自动化程度高； • 不同检测试剂盒操作基本相同。
基因诊断与产前诊断中常用的 分子生物学技术
张淑杰
Commonly used Techniques
• • • • • PCR 聚丙烯酰胺凝胶电泳 DNA测序 MLPA 基因芯片
PCR
• 实验原理 • 实验步骤
PCR实验原理：
PCR (Polymerase chain reaction)即聚合酶链 式反应，是指在DNA聚合酶催化下，以母 链DNA为模板，以特定引物为延伸起点， 通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制 出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。 是一项DNA体外合成放大技术，能快速特 异地在体外扩增任何目的DNA。
• 实验原理 • 主要试剂 • 实验步骤
实验原理：
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体和少量交 联剂甲叉双丙烯酰胺通过化学催化剂（过 硫酸铵），四甲基乙二胺（TEMED)作为加 速剂或光催化聚合作用形成的三维空间的 高聚物。聚合后的聚丙烯酰胺凝胶形成网 状结构。具有浓缩效应、电荷效应和分子 筛效应。当DNA分子进入凝胶，在电场下 进行泳动时，可根据各自迁移率的不同而 得以分离 。
MLPA是一种高通量、针对待测核酸中靶序列进行定性和定量分析的新技 术。这一技术最先于2002年由荷兰的 Schouten JP等报道。并非通过 PCR扩增样本DNA,而是扩增与DNA靶序列杂交的探针。每个MLPA探针均 是由两个寡核苷酸序列所组成，两者特异性地与互补的DNA靶序列结 合，且两者结合的位点是毗邻的。在连接酶的作用下，两者连接成为 单一的分子。此外，所有的探针均含有序列相同的侧翼序列，因此， 使用带有荧光的通用引物即可使其呈指数形式地扩增。在针对某一特 定基因的MLPA试剂盒中，probemix含有所有针对不同位点的探针，为 所有探针的混合物。但是每一种探针扩增后的片段长度却是独一无二 的，从130bp-480bp不等。因此在进行毛细管电泳时，其电泳的速度 也会存在明显的区别。只有寡核苷酸与DNA靶序列充分结合后，才能 在连接酶的作用下发生连接反应，进而扩增并获得相应探针的扩增峰。 如果待检DNA样本与探针结合的靶序列区域存在点突变或者片段的缺 失或重复，则探针与其杂交的过程就会受阻，进而影响最后的扩增信 号收集。
主要试剂：
• 30%丙烯酰胺： 丙烯酰胺 29g N,N’-亚甲双丙烯酰胺 1g（非变性胶液） 加去离子水至100ml 室温避光保存 10%过硫酰铵（APS）： 过硫酰铵 1g 加去离子水至10ml 4℃避光保存
•
• •
TEMED（N,N,N’,N’-四甲基乙二胺） 4℃避光保存 10×TBE： Tris碱 86.4g 硼酸 55g EDTA（粉末） 5.96g 加去离子水至800ml 高压蒸气灭菌，室温 保存
MLPA
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片段分析
样本
对照
•扩增产物通过毛细管电泳分离和定量。 •通过比对对照样本判断目的序列的拷贝数。 •每个峰值大小（或面积）表示该目的片段扩增数量在所有扩增片段总量中所占的 比值；每个峰的位置由其片段大小决定。
MLPA操作流程：
（1）DNA变性和杂交 （2）连接反应 （3）PCR反应 （4）PCR产物扫描与数据分析
分为变性胶与非变性胶两种，区别在于前者 中含有一定浓度的变性剂（尿素）。非变 性胶可用于双链DNA分子的分离与纯化， 变性胶可用于单链DNA分子的分离与纯化。 由于变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可消除DNA 分子不同构象对迁移率的影响，常用于进 行遗传病家系的单体型分析。
变性胶与非变性胶
非变性胶用于双链DNA分子的分离与纯化，双链 DNA分子在非变性胶中的迁移率与其大小的常用对 数值成反比。即越小跑的越快。但其迁移率也受 其碱基组成和序列的影响。 变性胶可用于单链DNA分子的分离与纯化。由于 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳可消除DNA分子不同构 象对迁移率的影响，即DNA在胶中的迁移率几乎与 其碱基组成及序列完全无关。常用于进行遗传病 家系的单体型分析。
•每对探针只有与其靶序列完全匹配后才能被连接。 •样本中靶序列的数量决定了可连接探针的数量。
MLPA
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用相同引物x和y对所有 探针连接产物进行PCR扩增
引物X
引物Y
•连接反应后，所有已连接的探针均可进行PCR扩增
•所有探针的扩增只需一个引物对(X和Y)
•未连接的探针没有引物连接序列，不能进行PCR扩增反应 •特异性的扩增产物数量只与基因目的序列的拷贝数有关
50ml
2.5ml 500ml 1.2g 500ml 4g 2.7ml
PAGE实验大体步骤：
• • • • • • • 制胶（区分胶液及梳齿） 点样（区分上样缓冲液及点样环境） 电泳（区分电压及时间） 固定 2min 染色 10min 显色 至出现DNA清晰条带 胶图扫描
银染法显色：
原理:银染色液中的银离子(Ag+)可与核酸形成 稳定的复合物，然后用还原剂甲醛 使Ag+ 还原成银颗粒，可把核酸电泳带染色黑褐 色，主要用于聚丙烯酰胺凝胶电泳染色.， 也用于琼脂糖凝胶染色，其灵敏度比EB高 200倍.但银染色后，DNA不宜回收。
Sanger法测序原理：
• 每一次测序由一套四个单独的反应构成，每个反 应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸（dNTP），并 混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸 （ddNTP）。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G,A,C,T处 终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一 dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应 得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们 具有共同的起始点，但终止在不同核苷酸上。可 通过高分辨率的变性凝胶电泳分离大小不同的片 段。凝胶后可用X-光胶片放射自显影或非同位素 标记进行。
•
8%丙烯酰胺（含50%尿素）： 丙烯酰胺 38g N,N’-亚甲双丙烯酰胺 2g（变性胶液） 10×TBE 25ml 尿素 250g 加去离子水至500ml室温避光保存
• 固定液： 无水乙醇 冰醋酸 加一蒸水至 • 染色液： AgNO3 加一蒸水至 • 显色液： NaOH 甲醛 加一蒸水至500ml
结果分析（以DMD为例）：
DMD基因位于X染色体上。在反应中含有一条 检测SRY基因的探针，如果是女性，即无此 峰。通过与正常男性和女性样品对照样品比 较，对应位置没有出现波峰，提示此外显子 缺失或男性半合子缺失；如果样品为女性， 当该峰值大约为正常女性对照样品的一半或 与其他外显子峰相比明显降低，则表示该样 品存在此外显子杂合性缺失。同样，波峰增 高大致为正常男性的倍数，提示此外显子出 现拷贝数增加，为重复突变。一倍为杂合突 变，两倍为纯和突变。
毛细管电泳 结果分析
MLPA
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设计探针
人工合成的寡聚核苷酸 1A 2A 引物x结合部位 M13转染的寡聚核苷酸 1B 2B 填充片段 引物y结合部位
靶特异性序列
•每一个探针包含两个寡核苷酸序列，每一个MLPA反应中最多可包含46种不同的探 针。 •其中一个探针长约40-50bp,为人工合成；另一个探针长约80-440bp,为M13噬菌体 转染。 •每个M-13噬菌体转染的探针包含一个非杂交的填充片段，该填充片段为探针特异性， 即每个探针所包含的填充片段大小不同，决定扩增片段峰值位置。 •每对探针在其末端有着相同的PCR引物结合序列。
Ratio
0.2 1
0.4
0.6
0.8
1.2
1.4
0
X-032.0 DMD exon 01 X-032.0 DMD exon 02 X-032.0 DMD exon 03 X-032.0 DMD exon 04 X-032.0 DMD exon 05 X-032.0 DMD exon 06 X-032.0 DMD exon 07 X-032.0 DMD exon 08 X-032.0 DMD exon 09 X-032.0 DMD exon 10 X-032.0 DMD exon 21 X-032.0 DMD exon 22 X-032.0 DMD exon 23 X-032.0 DMD exon 24 X-032.0 DMD exon 25 X-032.0 DMD exon 26 X-032.0 DMD exon 27 X-032.0 DMD exon 28 X-032.0 DMD exon 29 X-032.0 DMD exon 30 X-032.0 DMD exon 41 X-032.0 DMD exon 42 X-032.0 DMD exon 43 X-032.0 DMD exon 44 X-032.0 DMD exon 45 X-032.0 DMD exon 46 X-032.0 DMD exon 47 X-032.0 DMD exon 48 X-032.0 DMD exon 49 X-032.0 DMD exon 50 X-032.0 DMD exon 61 X-032.0 DMD exon 62 X-032.0 DMD exon 63 X-032.0 DMD exon 64 X-032.0 DMD exon 65 X-032.0 DMD exon 66 X-032.0 DMD exon 67 X-032.0 DMD exon 68 X-032.0 DMD exon 69 X-032.0 DMD exon 70 c c c c c
对比其他技术，MLPA 能检测的范围更广，小到点 突变，大到染色体的缺失和重复
MLPA技术应用
• 用于检测人类基因或基因片段的缺失或重 复（如DMD基因诊断及SMA基因诊断等） • 用于检测染色体重排 • 用于检测单核苷酸多态性（SNP)和突变 • 用于检测染色体三体性 • 检测肿瘤（甲基化特异性MLPA,MS-MLPA)
MLPA
长 探 针 制 备 示 意 图
MLPA
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多重杂交和连接
不匹配探针不连接 1A 1B Target 1 2A 1B Target 1
2A 2B
Target 2
•探针与靶序列杂交后，通过连接反应，就可形成一个完整的可扩增序列。
•每对探针的靶特异性序列与邻近的靶序列杂交，并通过热稳定的连接酶连接。
MLPA
Mlpa技术原理.
设计探针
人工合成的寡聚核苷酸 M13转染的寡聚核苷酸 1A 1B 2A 2B
引物x连接部位 短探针Baidu Nhomakorabea长探针 填充片段 引物y连接部位
多重杂交和连接
不匹配探针不连接 1A 1B 目的片段1 2A 1B 目的片段 1 2A 2B 目的片段2
用共同引物x和y对探针进行PCR扩增