高效液相色谱法

液相色谱
1、按流动相与固定相的分子聚集状态分类
流动相 固定相
固体(solid,S) 液体(liguid,L) 化学键合相 (bonded phase,BP)
气体 (gas,G)
GSC GLC
GBPC
液体
超临界流体
(liguid,L) (supercrttical fluid,SF)
LSC
SFSC
LLC
50MPa) 柱效高（H↓，n↑） 分析时间大大缩短 可以在线检测
二、HPLC与GC差别
相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测
主要差别：分析对象的差别、流动相的差别、操作条件差别
GC
HPLC
能气化、热稳定性 好、且沸点较低的样 品。
高沸点、挥发性差、 热稳定性差、离子型 及高聚物的样品不可 检测 。
Q nFN I nF dN
dt 流速一定时，dN 与流动相中的浓度有关。
dt 特点：灵敏度高，适合痕量物质检测
适用于：氧化还原活性的物质，如：胺、酚、羰基、巯基化合物
d、蒸发光散射检测器
I kmb;lg I b lg m lg k
• 用氮气流动相混合喷雾形成 小液滴，
• 通过一个加热的腔体除去流 动相，溶质的挥发性小于流 动相，因此产生气溶胶，进 入检测室
主流
极性:固定相 < 流动相
固定相 - 极性弱 流动相(甲醇, 乙腈等)- 极性强
分离的 核心部分
极性大物质先出峰
固定相-填充材料的物理性质
•硅胶纯度 •色谱柱尺寸 •颗粒形状 物理性质 •粒径 •表面积 •孔径
填料硅胶的纯度 与残留金属离子浓度
键合固定相的化学性质
•键合类型 化学性质 •碳覆盖率
双柱塞往复泵
优点：消除脉动 恒流量
b, 梯度淋洗装置
先
先
加
混
压
合
后
后
混
加
合
混合和加压的顺序
压
高压梯度:
利用两台高压输液泵，将两 种不同极性的溶剂按一定的比例 送入梯度混合室，混合后进入色 谱柱。
低压梯度:
一台高压泵, 通过比例调节 阀,将两种或多种不同极性的溶 剂按一定的比例抽入高压泵中 混合。
(2) 进样装置
紫外
发
能级 量
可见
射
吸
荧
收
光
外
发 T1*
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射
换
磷
光 振动
S0
能级
l1
l2
l3
l4
特点：
高灵敏度，高选择性 。 对多环芳烃，维生素B ，黄曲霉素，卟啉类化 合物，农药，药物，氨 基酸，甾类化合物等有 响应。
定量关系：F 2.3QKI0 cl
荧光检测器的应用
• 环境中的污染物
多环芳烃（PAH）
苯 氯仿 二氯甲烷 四氢呋喃 丙酮 乙腈 甲醇
水
紫外截止 波长/nm
190 380 265 210 245 233 212 330 190 205 187
光电二极管阵列检测器
80年代出现的一种新型检测器。单晶硅上密集排列一系列光电 二极管，一个光电二极管对应接受光谱上一个谱带宽度的单色光。 例如，安捷伦1100 HPLC光电二极管阵列检测器，波长范围为 200～900nm对应1024个光电二极管，平均0.7nm谱带宽度由一个 光电二极管接收。
1、HPLC与经典LC区别 2、HPLC与GC差别 3、高效液相色谱仪流程图 4、特点
一、HPLC与经典LC区别
主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段
经典LC
HPLC
柱内径1~3cm，固定 相粒径>100μm 且不 均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测
柱内径2~10mm，固定 相粒径<10μm（球形， 匀浆装柱） 高压输送流动相(40-
荧光检测器的缺点
• 不是所有化合物都有荧光，有的需要衍生化 • 检测器对溶解气体及其他淬灭物质（如甲醇）敏
感
• 对Ex及Em的最佳l，易受温度、溶剂的极性和粘 度、溶剂的pH值及样品浓度影响
• 多数仪器的批次间差异较大，同一型号的不同荧 光检测器会得到不同的结果。
C、安培检测器
原理：电极施加恒电位，当电活性成分经过时，发生氧化 还原反应，产生电流。
样品中不同化合物的最大吸收波
长不同时，需要使用多波长检测， 或使用折衷的波长 受流动相组成的影响：
用截止波长以上至少5～10nm 作为工作波长
缓冲盐、离子对试剂、胺改性 剂也会有影响
背景吸收的影响
吸光度
理想
2
1
实
际
1
0
背景吸收
0 浓度
背景吸收降低了线性范围 多数流动相有紫外吸收
溶剂名称
正己烷 二硫化碳 四氯化碳
– 多环芳烃(PAH)，多酚， H3C CH3
CH3
氨基甲酸酯等
CH3 OH
• 食品、饮料
CH3
维生素
– 食品中的毒素；例如： 黄曲霉毒素
– 染料
O
O O
O
O
H3C
NH
O
O CH3
– 维生素及衍生氨基酸 • 生物技术及制药
O
CH3 O
CH3
黄曲霉毒素 氨基甲酸酯类杀虫剂
荧光检测器的优点
• 选择性提高 • 灵敏度提高（在 pg/fg 范围） • 低背景技术
mV
0.50 0.40 0.30 0.20 0.10 0.00 -0.10
6.894
O
O 9.639
CH3
O
HN
CH3
H2N
H3C
O
200pg Excitation l=280 Emission l=360
5.00 6.00 7.00 8.00 9.00 10.00 11.00 12.00 13.00 Minutes
• 光照后，气溶胶发生光散射 • 散射光由光电倍增管检测 • 散射光强度与溶质的存在量
呈比例关系
• 应用领域：
– 碳水化合物 – 油脂及脂肪酸 – 未衍生的氨基酸 – 制药行业 – 表面活性剂 – 天然产物
优点
缺点
通用型 － 比流动相
挥发性小的物质都 能被检测
可以作梯度实验； 检测下限可到纳 克级水平 对环境条件不敏 感；可以使用有 强紫外吸收的溶 剂作流动相
三维紫外图
时间——波长——吸光度
3.0 nm
1.0 nm
光学分辨率（带宽）
Benzene
5.0 nm
190
230.00
250.00
nm
270.00
nm
3.0nm vs 1.0nm 损失分辨率，
UV最大波长移动
好的光谱分辨率可得到高质量的光谱信息
优点
通用的UV/Vis检 测 好的选择性、线 性 提供色谱峰的 UV/Vis光谱图 （峰指认） 可提供纯度估计
缺点
低光学通量 （较窄的带宽 通量） 与普通UV/Vis 相比更复杂， 容易漂移 灯输出能量随 时间降低
b. 荧光检测器
荧光：电子由第一激发单重态的最低振动能级→基态（ 多为 S1→ S0跃迁），发射波长为 l ‘2的荧光；10-7～10 -9 s 。
S2*
内转换
振动弛豫 体系间 跨越
S1*
电子 能
不能使用不挥发性的流动相（例如： 磷酸盐） 要求使用雾化气源（典型的是氮气）
不同的色谱条件下雾化及除溶剂的 参数需要重新优化
蒸发出的溶剂要通到户外或通风橱 里 对挥发性化合物的检测不理想 一般得到的是非线性校正曲线
某些化合物的检测灵敏度不如其他 检测器
e. 示差折光检测器
除紫外检测器之外应用最多的检测器。 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折射率差值。差 值与浓度成正比。 通用型检测器（每种物质具有不 同的折光指数）。 灵敏度低，对温度敏感，不能用 于梯度洗脱。 偏转式、反射式和干涉型三种。 应用范围： 碳水化合物、聚合物、脂肪酸及 油脂类
电离源
1、电喷雾电离源（ESI）
电离源
2、大气压化学电离源（APCI）和大气压光电离（APPI）
Molecular Weight
100,000
ESI
10,000
1,000 APCI
nonpolar
Analyte Polarity very polar
LC-MS的离子产生
同一种物质在不同的离子源中，可能产生不同的带电离子， 进而产生不同的信号。
529
H3C
CH3
57
530
H3C
EI
APCI(-): 40V 527
HO
O
H3C
H3C
CH3
233
489
543
m/z
200 300 400 500 600 700 800
O (CH2)17
219
CH3
515
97 147 278
100 200 300 400 500 m/z
APCI和ESI是液质联用常用的离子源，EI是气质联用常用的离子源。
朗伯—比尔定律
A Ecl
优点
缺点
这种检测器简单、可靠
可以作梯度实验并且是 非破坏性的 大多数有机化合物有一 定程度的吸光度 一般来说灵敏度还可以， 线性范围较宽；
对流动相的流速和 温度变化不敏感
波长可选，易于操 作
不是所有化合物都有吸光度，不 是通用检测器
对某些化合物的检测灵敏度不及 其他检测器
第十八章 高效液相色谱法
High performance liquid chromatography
陈睿婷
高效液相色谱 (High Performance Liquid Chromatography，HPLC)
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发 展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前 已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。它是在经典 液相色谱基础上，引入了气相色谱的理论，在技术上采用了高 压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，因而具备分离效率高、 选择性好、分析速度快、检测器灵敏度高、操作自动化和应用 范围广的特点。
流动相与组分间有亲合作用力，为提 高柱的选择性、改善分离度起很大作 用 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起 到重要作用
选用不同比例的两种或两种以上液体 作为流动相可以增大分离选择性 操作条件：室温、高压 梯度洗脱
液相色谱的基本流程图
流动相 预备柱
进样阀 色谱柱 泵
检测器
•封端
（4）、检测器
专属型
紫外/可见光检测器 荧光检测器 安培检测器 质谱检测器
通用型
示差折光检测器 蒸发光散射检测器 电导检测器
固定波长 可变波长 光电二极管阵列
1. 要求 灵敏度高、噪音低、
线性范围宽、响应快、 死体积小、对温度和 流速变化不敏感
a. 紫外检测器
• 目前应用最广泛的检测器 • 测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失 • 吸光度与样品浓度呈线性关系 • 在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大
泵输液 进样
①②
分离
③
检测
④
AB C DE G F
计算机
⑤
高效液相色谱仪
流动相
六通阀
脱气装置 泵
检测器
常用的高效液相色谱仪
美国Agilent
美国Waters
日本岛津
4.2.2 高效液相色谱主要部件
(1) 泵输液系统——a，高压输液泵
主要部件之一，压力可达40MPa，有的可达100MPa。 为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相(<10μm)，液体的 流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高 效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳，脉冲小，流量稳定可调，耐腐蚀等特性。
SFLC
LBPC
SFBPC
气相色谱 液相色谱 超临界色谱
HPLC
高效液相色谱法的分类
按固定 相分类
液液色谱法 液固色谱法 化学键合色谱法
按分离 机理分类
分配色谱法 吸附色谱法 离子交换色谱法 分子排阻色谱法 手性色谱法 亲合色谱法 胶束色谱法
高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相 色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法。
液质联用数据示例：石墨电弧富勒烯产物分析
Intens. mAU
200
UV Chromatogram, 360 nm
手动进样：
流路中为高压力工作 状态，通常使用耐高压 的六通阀
其结构如下：
load
inject
自动进样：
用于大量在同样操作条
件下分离的类似样品
注射器吸取的样品量必 须大于定量环的量。
（3）色谱柱
正相HPLC
正相 色谱
20%
反相色 谱
80%
反相HPLC
极性:固定相 > 流动相 固定相 - 极性强 流动相(己烷, 庚烷)- 极性弱 极性小物质先出峰
f、色质联用
质量分析器
+/-
电离源
m/z
MS： 质谱（Mass Spectrometry）是一种按照分子量及其电 荷分离物质的技术，。
LC/MS：液相色谱与质谱的连用。 过程：除去HPLC的溶剂；产生离子；分离离子；检测离子；
计算离子强度；处理数据
色质联用仪器
质谱
色谱 常用电离源：电子轰击源(EI)、电喷雾源(ESI)、大气压化 学电离源(APCI) 、大气压光电离（APPI）、基质辅助电离 （MALDI） 常用质量分析器：四级杆、离子阱、磁质谱、飞行时间质谱 常用检测器：电子倍增器、光电倍增器
占有机物的20%
溶解后能制成溶液 的样品。
不受样品挥发性和 热稳定性的限制
分子量大、难气化、
热稳定性差及高分子 和离子型样品均可检 测
用途广泛，占有机
流动相的差别和操作条件差别
GC
HPLC
流动相为惰性气 体 组分与流动相无 亲合作用力，只 与固定相作用 操作条件：常压， 加温操作
程序升温
流动相为液体