乳酸菌的分离与酸奶的发酵及检测

乳酸菌的分离鉴定与酸奶的发酵及检测

陈园园

（中北生物技术1803108）

摘要：乳酸菌：一群或几种能分解葡萄糖或乳糖产生乳酸，需氧和兼性厌氧，多数无动力，过氧化氢酶阴性，革兰氏阳性的无芽胞杆菌和球菌。如保加利亚乳杆菌、嗜热乳链球菌、嗜酸乳杆菌。酸奶发酵基本原理是通过乳酸菌发酵牛奶中的乳糖产生乳酸。乳酸使牛奶中酪蛋白（约占全乳的2.9%，占乳蛋白的85%）变性凝固而是整个奶液呈凝乳状态。同时，通过发酵还可形成酸奶特有的香味和风味。按凝固状态可将酸奶分为凝固型酸奶和搅拌型酸奶，二者基本工艺过程相似。发酵剂的制备分三个阶段，即乳酸菌纯培养物、母发酵剂和生产发酵剂。实验分离得到的嗜热乳酸链球菌(Streptococcus thermophilus)，培养基使用脱脂乳粉或全脂乳粉、鲜牛奶、蔗糖。

关键词：乳酸菌、酪蛋白

前言：乳酸菌是指一群通过发酵糖类，产生大量乳酸的细菌总称。乳酸从形态上可分为球菌和杆菌，并且均为革兰氏染色阳性、在缺少氧气的环境中生长良好的兼性厌氧性或厌氧性细菌。目前，对乳酸菌的应用研究，着重于食品（如发酵乳制品、发酵肉制品和泡菜）和医药工业等人类生活密切相关的领域。

近几年由于广谱和强力的抗菌素的广泛应用，使人体肠道内以乳酸菌为主的益生菌遭受到严重破坏，抵抗力逐步下降，导致疾病越治越多，健康受到极大的威胁。所以，有意增加人体肠道内乳酸菌的数量就显得非常重要。随着人们生活水平的提高和消费观念的转变，在我国生产销售的酸乳及酸乳饮品数量直线上升, 品种花样繁多, 很受消费者的青睐。酸奶是以新鲜牛乳经有效杀菌, 用不同乳酸菌发酵剂制成的乳制品, 味酸甜细腻, 营养丰富, 深受人们喜爱, 专家称它是“21 世纪的绿色食品”, 是一种“功能独特的营养品”。它对人体有较多的好处, 可以维持肠道正常菌群平衡, 调节肠道有益菌群到正常水平等。

因此，从发酵乳制品中分离性能优良的乳酸菌，制作真正的健康、绿色的食品，对促进我国发酵乳制品工业的发展具有重要的意义。

目前市售的各种酸奶制品中, 作为发酵剂的乳酸菌, 通常为保加利亚乳杆菌和嗜热链

球菌这两株菌。用嗜热链球菌和保加利亚乳酸杆菌混合培养发酵的乳酸饮品能补充人体肠道内的有益菌，维持肠道的微生态平衡，且含有易于吸收的营养素，具有抑制腐败菌、提高消化率、防癌及预防一些传染病等功效，并能为食品提供芳香风味，使食品拥有良好的质地。

保加利亚乳杆菌（L.Bulgarius）:长杆形，直径1-3mm左右,能产生大量的乳酸。酸碱度方面,为耐酸或嗜酸性,因低pH能防止一些微生物的生长;温度方面,为嗜温至少许嗜热,最适生长温度在37-45℃之间,对低温非常敏感。

嗜热链球菌（S.thermophilus）：卵圆形，直径0.7－0.9微米，呈对或链状排列，无运动性。为健康人肠道正常菌群，可在人体肠道中生长、繁殖。可直接补充人体正常生理细菌，调整肠道菌群平衡，抑制并清除肠道中对人具有潜在危害的细菌。

实验器材

菌种：市售酸奶

试剂：革兰氏染液（结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、沙黄）

改良CHALMERS培养基（配方）

大豆蛋白胨5g、牛肉浸膏5g、酵母浸膏5g、葡萄糖20g、乳糖20g、碳酸钙10g、琼脂15g、

蒸馏水1000mL、1%中性红溶液5mL

仪器：无菌水（20ml带玻璃珠三角瓶），无菌培养皿，恒温培养箱。

乳酸菌的分离

挑取典型的乳酸菌单菌落于新鲜的MC培养基上进行划线分离。并置于培养箱培养48h 发酵培养基的制备

在塑料杯中称取2g蔗糖，加入纯牛奶50mL（标记处），充分混匀。用双层套杯和封口膜将杯口密封；于80～85℃灭菌10～15min，然后冷却至35～40℃，作为制作饮料的培养基质。

酸奶→稀释→涂布→培养→检查计数

单菌接种

将纯种嗜热乳酸链球菌种子液，以5%的接种量接入发酵培养基中即为饮料发酵液。接种后摇匀，随后用封口膜或塑料手套密封。

混菌接种

以市售鲜酸乳为种子发酵，按5%的接种量接入发酵培养基中即为饮料发酵液。接种后摇匀，随后用封口膜或塑料手套密封。

培养

把接种后的酸乳瓶置于40℃恒温箱中培养12～16h。培养时注意观察，在出现凝乳后停止培养。然后转入4～5℃的低温下冷藏6h以上。经此后熟阶段，达到酸乳酸度适中(pH4～4.5)，凝块均匀致密，无乳清析出，无气泡，获得较好的口感和特有风味。

品尝和检测

以品尝为标准评定酸乳质量采用乳酸球菌和乳酸杆菌等量混合发酵的酸乳与单菌株发酵的酸乳相比较，前者的香味和口感更佳。品尝时若出现异味，表明酸乳污染了杂菌。产酸测定

用pH试纸检测最终产品的pH值

结果

平皿底为粉红色，菌落较小，圆形，红色，边缘似星状，直径2±1mm，有淡淡的晕确定为杆菌；

平皿底为粉红色，菌落较小，圆形，红色，边缘整齐，有淡淡的晕确定为球菌。

镜检、革兰氏染色、过氧化氢酶检验结果

呈革兰氏阳性，过氧化氢酶阴性，有球菌和杆菌无芽胞确定为乳酸菌。

实验并未得到要求的理想酸乳，实验制备的酸乳并未凝块但已比较粘稠且测得酸乳的pH值约为5.0，造成这样结果的原因可能是由于发酵培养基中的酪蛋白含量不足或乳酸菌用量不足。

讨论

本次实验的目的是学习乳酸发酵和制作乳酸菌饮料的方法，了解乳酸菌的生长特性。1．比较采用乳酸菌混合发酵的酸乳比单菌发酵的酸乳口感和风味哪个更佳？为什么？

乳酸菌混合发酵的酸乳口感和风味更佳。酸奶发酵基本原理是通过乳酸菌发酵牛奶中的乳糖产生乳酸。乳酸使牛奶中酪蛋白（约占全乳的2.9%，占乳蛋白的85%）变性凝固而是整个奶液呈凝乳状态。同时，通过发酵还可形成酸奶特有的香味和风味。因此单菌发酵的酸乳口感比较单一，乳酸菌混合发酵的酸乳口感则比较丰富并且风味更佳。

2.培养基中为什么要加CaCO3？

用于分离乳酸菌的培养基中加入CaCO3是因为乳酸菌产乳酸，乳酸可以分解CaCO3生成水解圈从而可以直接方便地鉴定乳酸菌。