实验十 血糖的测定

实验十血糖得测定

血液中得葡萄糖称血糖。正常人血糖浓度较恒定,维持在3.9mmol／L～6.1mmol／L之间。血糖浓度得相对恒定就是机体进行正常生理活动得前提条件之一,有着双重实际意义:其一,维持稳定得能源供给,满足机体在各种生理状态下对能量得需求。其二,保证机体不因进食致血糖浓度过高,导致糖得丢失。

因此,血糖得测定就是临床生化检验实验室得常规检测项目。血糖测定按其发展过程及反应原理得不同,大致分三类:氧化还原法 ,缩合法(主要有邻甲苯胺法),酶法(主要有己糖激酶法与葡萄糖氧化酶法)。下边介绍两种方法供选择。

一、葡萄糖氧化酶法

【目得】

1、了解葡萄糖氧化酶法测定血糖得原理,能进行血糖测定得操作。

2、掌握血糖测定得临床意义。

【原理】

葡萄糖氧化酶 (glucose oxidase,GOD) 能将葡萄糖氧化为葡萄糖酸与过氧化氢。后者在过氧化物酶 (peroxidase,POD)作用下,分解为水与氧得同时将无色得4氨基安替比林与酚氧化缩合生成红色得醌类化合物,即 Trinder 反应。其颜色得深浅在一定范围内与葡萄糖浓度成正比,在505nm波长处测定吸光度,与标准管比较可计算出血糖得浓度。反应式如下:

【器材】

试管、吸管、试管架、恒温水浴箱、分光光度计

【试剂】

1、 0、1mol/L磷酸盐缓冲液(pH7、0)

称取无水磷酸氢二钠8、67g及无水磷酸二氢钾5、3g溶于800ml蒸馏水中,用1mol/L 氢氧化钠(或1mol/L盐酸)调节pH至7、0,然后用蒸馏水稀释至1L。

2、酶试剂

称取过氧化物酶1200U,葡萄糖氧化酶1200U,4氨基安替比林10mg,叠氮钠100mg,溶于上述磷酸盐缓冲液80ml中,用1mol/L NaOH调pH至7、0,加磷酸缓冲液至100ml。置冰箱保存,4℃可稳定3个月。

3、酚溶液

称取重蒸馏酚100mg溶于100ml蒸馏水中(酚在空气中易氧化成红色,可先配成500g/L

得溶液,贮存于棕色瓶中,用时稀释),用棕色瓶贮存。

4、酶酚混合试剂

取上述酶试剂与酚溶液等量混合,4℃可以存放一个月。

5、 12mmol/L苯甲酸溶液

溶解苯甲酸1、4g于蒸馏水约800ml中,加温助溶,冷却后加蒸馏水至1L。

6.葡萄糖标准贮存液(100mmol/L)

称取已干燥恒重得无水葡萄糖1、802g,溶于12mmol/L苯甲酸溶液约70ml中,并移入100ml容量瓶内,再以12mmol/L苯甲酸溶液加至100ml。

7、葡萄糖标准应用液(5mmol/L)

吸取葡萄糖标准贮存液5、0ml 于100ml 容量瓶中,加12mmol/L 苯甲酸溶液至刻度。

【操作】

取3 支试管,编号,按下表操作。

表312 血糖测定操作步骤

加入物 (ml) 空白管标准管测定管

血清－－0、02

葡萄糖标准液－0、02 －

蒸馏水0、02 －－

酶酚混合液3、0 3、0 3、0 混匀,置 37 ℃水浴中保温 15分钟,在波长 505nm 处比色,以空白管调零,读取标准管及测定管吸光度。

【计算】

测定管吸光度

血糖(mmol/L)= ×5

标准管吸光度

【注意事项】

1.测定结果如超过20mmol／L,应将标本用生理盐水稀释后再测定,结果乘以稀释倍数。

2.若酶酚混合试剂呈红色,应弃之重配。因标本与标准用量少,其加量就是否准确对测定结果影响较大,故其加量必须准确。

3.GODPOD法得第一步反应特异性高,而由POD催化得第二步指示反应就是非特异性得,易受标本中尿酸、维生素C、谷胱甘肽、胆红素等还原物得干扰,这些物质与色素原竞争H202,使测定结果偏低。

4.Trinder反应由Trinder于1969年提出。后经许多学者改进,采用2,4二氯酚、2羟3,5二氯苯磺酸等代替苯酚,由于这些化合物氧化生成得色素得摩尔吸光系数均高于苯酚,使反应灵敏度得以提高。

【正常参考范围】

3、9～6、1mmol/L

【临床意义】

1、生理性高血糖可见于摄入高糖饮食或注射葡萄糖后,或精神紧张、交感神经兴奋,肾上腺分泌增加时。

2、病理性高血糖

⑴糖尿病:病理性高血糖常见于胰岛素绝对或相对不足得糖尿病患者。

⑵对抗胰岛素得激素分泌过多:如甲状腺功能亢进、肾上腺皮质功能及髓质功能亢进、腺垂体功能亢进、胰岛α细胞瘤等。

⑶颅内压增高:颅内压增高(如颅外伤、颅内出血、脑膜炎等)刺激血糖中枢,出现高血糖。

⑷脱水引起得高血糖:如呕吐、腹泻与高热等也可使血糖轻度增高。

3、生理性低血糖饥饿或剧烈运动、注射胰岛素或口服降血糖药过量。

4、病理性低血糖

⑴胰岛素分泌过多:由胰岛β细胞增生或胰岛β细胞瘤等引起。

⑵对抗胰岛素得激素分泌不足:如腺垂体功能减退、肾上腺皮质功能减退与甲状腺功能减退等。

⑶严重肝病患者:肝贮存糖原及糖异生功能低下,不能有效调节血糖。

【结果及分析】

【思考题】

1、血糖有哪些来源与去路,机体就是如何调节血糖浓度恒定得？

2、酶试剂为什么要用磷酸缓冲液配制,用蒸馏水就是否可以,为什么？

二、邻甲苯胺法

【目得】

了解测定血糖得原理与方法,要求在实验中培养学生严谨得作风与准确地进行实际操作得能力。

【原理】

葡萄糖在热得醋酸溶液中与邻甲苯胺缩合生成葡萄糖邻甲苯胺,后者脱水生成雪夫(Schiff)碱,再经结构重排,生成有色化合物。颜色得深浅与葡萄糖含量成正比。其反应式