普通显微镜改装成相衬显微镜的一种新方法
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( 7)
图3 透射式改装方案的光学原理图
F ig. 3 O p tica l system of changing in to p ha se con tra st m icro scop e in tran sm ission
忽略透镜 L 1 对光波振幅的影响, 在旁轴近似 下, 经 L 1 的变换后, 向 P 2 面上某点会聚的单色球 面波在紧靠透镜 L 1 后的平面上产生的复振幅分 布可表示为 U′ L 1 ( x , y ) = A exp ( - jkd i )
2 exp [ - j ( k 2d i ) ( x + y ) ]
实际制作的相衬板的参数如下: 外形尺寸 5 1314mm , 通光口径 5 12mm , 中央狭缝宽度 b =
115mm , 狭缝部分相移约 70° , 狭缝部分透过率 T = 9◊ , 厚度 d = 110mm 1 当 F c = 012 时, 人眼能较 舒服地观察, 由式 ( 6) 得所能观察到的相位变化为
a
面 P 1 上的复振幅分布为 U 0 (x 1 , y 1 ) = B exp ( - jkd ) exp [ - j ( k 2d ) 2 (x 2 ( 9) 1+ y 1) ] 物体的透射光的复振幅为 U′ 0 (x 1 , y 1 ) = U 0 ( x 1 , y 1 ) t ( x 1 , y 1 )
收稿日期: 1998- 09- 25
1期 刘晓元等1普通显微镜改装成相衬显微镜的一种新方法
81
) = C 2 [ a 2 + 2a Υ( x , y ) sin ∆] ( 5) I ( x ′ , y′ 2, 3 这就是相衬法的基本原理 1 将衬比 F c 定义为物体细节象的亮度与背景 光的亮度之差与背景光之比, 由式 ( 5) 得 2Υ( x , y ) sin ∆ ( 6) F c=
( 8)
在几何近似下, 这一会聚球面波投射到物平
82 光 子 学 报 28卷 = 010337rad 1 当用透射方式观察 5 = aF c 2sin70° 样 本 时, 能 观 察 到 的 光 程 差 为 n 0 ∆ L = 5 Κ 2 Π= 2195nm 1 当用反射方式观察样本时, 能观察到的 表面起伏为 n 0 ∆ = 115nm 1 L = 5 Κ 4Π 用上述改装成的相衬显微镜和相同型号的普
1 刘晓元1普通显微镜改为相衬显微镜的研制: [ 硕士论文 ] 1国防科技大学, 1996: 1 ～ 43 2 ～ 559 M 1玻恩, E 1沃耳夫1光学原理 ( 中译本上册) 1北京: 科学出版社, 1978: 554 3 吕乃光1傅里叶光学1北京: 机械工业出版社, 1986: 92 ～ 103, 108 ～ 115, 212 ～ 223, 224 ～ 229
设
iΥ( x , y ) F (x , y ) = e
( 1)
为光波通过相位物体后的复振幅分布, 相衬板的 透射函数为 i∆ A = a e ( 零级光谱区域) ( 2) tp = 1 ( 其它区域) 根据空间滤波原理, 可得象面上的光强分布为 ) = C 2 A + F (x , y ) - 1 2 ( 3) ,y′ I (x ′ ( 2) 代入式 ( 3) 得 将式 ( 1) 、 ) = C 2 {a 2 + 2[ 1- a co s5 ,y′ I (x ′ ) ]} ( 4) - co sΥ + a co s ( ∆- Υ ( ) 若Α ≠0, Υ ν 1, 则式 4 可写为
的因素所决定: (a ) 在任何光学仪器内, 直射光在 到达相衬板之前穿过很多光学元件的界面, 在这 些界面上由二次反射所产生的假象能形成不能被 相衬板所阻拦的背景1 (b ) 在这样多的界面上, 表 面的缺陷和灰尘能产生有害的相当强的背景1 (c ) 由聚光镜所给出的光阑的共轭象或多或少被象差 所歪曲 1 如果相衬板非常之窄, 则由于象差的存 在, 将出现寄生的背景; 如果加大相衬板的尺寸, 虽然背景的亮度减弱, 但仪器的分辨能力也随之 下降1在本文所提出的将相衬板置于物镜前的相 衬显微镜中, 由于物面与相衬板之间无其它光学 ( b ) 两项所产生的杂散光较 元件的界面, 因而 ( a ) 、 其它相衬显微镜来说, 要弱得多; 通过适当选择相 衬板的尺寸, 在降低背景光和提高分辨能力之间 取得平衡1总之, 相衬板置于物镜前的相衬显微镜 中的杂散光要较其它相衬显微镜中的杂散光要弱 得多, 这对于加大相衬板的吸收, 提高灵敏度极为 有利1
2 (x 2 1 + y 1 ) ] t (x 1 , y 1 )
( 10) ( 10) ′
显然, 相衬板对零级频谱的吸收越大, 即 a 越小, 则衬比越大1因此, 适当地增加吸收, 可提高象的 衬比 ( 度) 1
U′ 0 ( x 1 , y 1 ) = B exp ( - jkd ) exp [ - j ( k 2d )
0 引言
相衬显微术自1935年由荷兰物理学家泽尼克 提出以来, 已广泛应用于生物学、 化学、 结晶学、 矿 物学中, 在研究有相位变化的物体中显示了巨大 的优越性1我国的显微镜工业起步于50年代, 80年 代开始研制用于生物显微观察的透射式相衬显微 镜和用于金相观测的微分干涉显微镜1但同样结 构的相衬显微镜比普通显微镜要昂贵得多, 因而 目前我国生物、 医学等部门几乎还都是采用将标 本染色后再用普通显微镜观察的方法1这种局面 对于生物的研究, 对于医学诊断水平的普遍提高 是极为不利的1能否将广泛使用的普通显微镜经 简单改装后变成相衬显微镜? 从已有的相衬显微 镜来看, 这似乎是不可能的1这是因为已有的相衬 显微镜的相衬板大都安置在物镜后或物镜内, 要 改装成相衬显微镜, 就必须在显微镜内加装相衬 板, 这样就必须变动原显微镜的结构; 而且由于不 知道原显微镜的结构参数, 也就不知道相衬板应 置于何处1本文从相位滤波的概念出发, 提出将相 衬板置于物镜前, 而对原显微镜不须做任何改动, 不仅将改装设计变为可能, 而且大大降低了难度, 抑制了杂散光, 为推广、 普及相衬显微镜探索了一 条新路1
, y 1 ) exp [ j (k 2d ) ( x + y ) ]} ( f x f y ) ( 11) (Κ d ) , f y = y 2 (Κ d ) , 将式 ( 10 ) ′
1
表明 P 2 面上能得到 P 1 面上物体的频谱1我们即可 在S ′ 处设置环型或狭缝光阑, 而在 P 2 面上安置相 应的相衬板, 这就构成了一种新的相衬显微镜系 统1
1期 刘晓元等1普通显微镜改装成相衬显微镜的一种新方法
83
A NEW M ETHOD O F ADAPTAT I O N O F GENERAL M ICRO SCO PE INTO PHASE CO NTRAST M ICRO SCO PE
3 改装实验1
根据上述原理, 我们选取 XTL - 1 型160X 双
图2 频谱面位于物镜前的相干滤波系统
F ig. 2 System of coheren t filtering w ith Fou rier p lane befo re ob jective len s
目体视显微镜来改装成单目透射 反射式相衬显 微镜, 图3是透射式改装方案的光学原理图1
1 相衬法基本原理
相衬法是通过空间滤波的方法, 将相位物体 不可见的相位分布转化为可见的光强分布1图1是 相衬显微镜的典型光路3 1
图1 相衬显微镜的典型光学系统
F ig. 1 T he no rm a l op tica l system of p ha se con tra st m icro scop e
F {U ′(x
0 2 1 2 1
式 ( 11 ) 中 f x = x 2 代入式 ( 11) , 可得 U P2 ( x 2 , y 2 ) = (B jΚ d ) exp ( - jkd ) 2 2 exp [ j ( k 2d ) ( x 2 + y 2 ) ] ( 12) T (f x , f y ) 式 ( 12) 中, T ( f x , f y ) 是 t ( x 2 , y 2 ) 的傅里叶变换, 它
2 相衬板置于物镜前的相干滤波系
光波由物平面 P 1 传播到 P 2 可按菲湿耳衍射 处理, 这样可得 P 2 面上的复振幅分布为 2 2 U P2 ( x 2 , y 2 ) = ( 1 jΚ d ) exp [ j ( k源自文库2d ) ( x 2 + y 2 ) ]
统
由图1可见, 物体的频谱面位于物镜后或物镜 内, 这种常规配置对于将普通显微镜改装成相衬 显微镜来说, 几乎是不可能的 1 图 2 是另外一种形 式的相干滤波系统, 它与图1的主要区别在于物体 的频谱面 P 2 位于显微物镜 L 2 前方, 这就有可能在 物镜前方加装相衬板, 而不须改动原显微镜的结 构, 给改装带来了极大的方便1下面利用傅里叶光 学推导 P 2 确为物面 P 1 的频谱面1
如图2 所示, P 0 与 P 2 为 L 1 的一对共轭面, P 1 与
P 3 为 L 2 的一对共轭面 1 采用逐面分析的方法, 从
着手, 找出物体的频谱面所在的位置1 S′ 在旁轴近似下, 位于 S ′ 点的单色点光源发出 的球面波在紧靠透镜 L 1 前的平面上产生的复振 幅分布可表示为 2 2 U L 1 = A exp ( jkd 0 ) exp [ j ( K 2d 0 ) ( x + y ) ]
通显微镜对比观察了反射膜片、 精抛光的玻璃表 面及波导片等, 用相衬显微镜观察的效果显著1原 来在普通显微镜下几乎观察不到变化的高反射膜 片, 在改装成的反射式相衬显微镜下, 出现了许多 明亮、 清晰的亮点 1 在精抛光的玻璃表面划上一 刀, 使之产生应力变化, 从而产生折射率的变化, 在普通显微镜下只能看到划痕, 而在改装成的透 射式相衬显微镜下观察, 除了可清楚地看见划痕 外, 划痕的周围还有清晰的细节变化 1 这表明, 相 衬显微镜能观察到因应力变化而引起的折射率的 变化1用普通显微镜观察以铌酸锂为衬底的质子 交换光波导的表面, 看不到扩散条; 而用改装成的 反射式相衬显微镜观察, 可明显看到直线型的扩 散条1这说明所改装成的相衬显微镜能观察到折射 率的差异1
第28卷第1期 光 子 学 报 V o 1. 28 N o. 1
1999年 1 月 A CTA
PHO TON ICA S I N ICA
J anua ry 1999
普通显微镜改装成相衬显微镜的一种新方法
刘晓元 龙兴武 黄 云 周宁平 高伯龙
( 国防科技大学应用物理系, 长沙 410073)
摘 要 本文提出了一种新的相衬显微镜的光路系统, 这种系统非常适用于将普通显微镜改 装成相衬显微镜1首先, 叙述了相衬法的基本原理; 接着提出了一种将相衬板置于物镜前方的 相衬显微镜系统, 并运用傅里叶光学证明了在非柯勒照明条件下在物镜前方确实存在物体的 频谱面1这种相衬显微镜系统对于将普通显微镜改装成相衬显微镜来说, 不仅简单实用, 而且 杂散光小, 有利于提高灵敏度1 关键词 显微镜; 相衬显微镜; 相衬板
5 结论
本文提出的将相衬板置于物镜前的相衬显微 镜系统对于将普通显微镜改装成相衬显微镜来 说, 不仅可行, 而且简单、 实用, 杂散光小, 具有较 大的应用价值1 论文是在高伯龙教授的悉心指导下完成的, 学生在此表示衷心的感谢!
4 对杂散光的抑制
显微镜中由于存在杂散光, 降低了对比度, 给 观察带来了极不利的影响, 尤其是在相衬显微镜 中, 当相衬板吸收很强时, 杂散光成了制约衬比 ( 度) 的主要因素, 极大地限制了灵敏度的提高1在 典型相衬显微镜中, 杂散光主要由以下几个方面 参考文献
图3 透射式改装方案的光学原理图
F ig. 3 O p tica l system of changing in to p ha se con tra st m icro scop e in tran sm ission
忽略透镜 L 1 对光波振幅的影响, 在旁轴近似 下, 经 L 1 的变换后, 向 P 2 面上某点会聚的单色球 面波在紧靠透镜 L 1 后的平面上产生的复振幅分 布可表示为 U′ L 1 ( x , y ) = A exp ( - jkd i )
2 exp [ - j ( k 2d i ) ( x + y ) ]
实际制作的相衬板的参数如下: 外形尺寸 5 1314mm , 通光口径 5 12mm , 中央狭缝宽度 b =
115mm , 狭缝部分相移约 70° , 狭缝部分透过率 T = 9◊ , 厚度 d = 110mm 1 当 F c = 012 时, 人眼能较 舒服地观察, 由式 ( 6) 得所能观察到的相位变化为
a
面 P 1 上的复振幅分布为 U 0 (x 1 , y 1 ) = B exp ( - jkd ) exp [ - j ( k 2d ) 2 (x 2 ( 9) 1+ y 1) ] 物体的透射光的复振幅为 U′ 0 (x 1 , y 1 ) = U 0 ( x 1 , y 1 ) t ( x 1 , y 1 )
收稿日期: 1998- 09- 25
1期 刘晓元等1普通显微镜改装成相衬显微镜的一种新方法
81
) = C 2 [ a 2 + 2a Υ( x , y ) sin ∆] ( 5) I ( x ′ , y′ 2, 3 这就是相衬法的基本原理 1 将衬比 F c 定义为物体细节象的亮度与背景 光的亮度之差与背景光之比, 由式 ( 5) 得 2Υ( x , y ) sin ∆ ( 6) F c=
( 8)
在几何近似下, 这一会聚球面波投射到物平
82 光 子 学 报 28卷 = 010337rad 1 当用透射方式观察 5 = aF c 2sin70° 样 本 时, 能 观 察 到 的 光 程 差 为 n 0 ∆ L = 5 Κ 2 Π= 2195nm 1 当用反射方式观察样本时, 能观察到的 表面起伏为 n 0 ∆ = 115nm 1 L = 5 Κ 4Π 用上述改装成的相衬显微镜和相同型号的普
1 刘晓元1普通显微镜改为相衬显微镜的研制: [ 硕士论文 ] 1国防科技大学, 1996: 1 ～ 43 2 ～ 559 M 1玻恩, E 1沃耳夫1光学原理 ( 中译本上册) 1北京: 科学出版社, 1978: 554 3 吕乃光1傅里叶光学1北京: 机械工业出版社, 1986: 92 ～ 103, 108 ～ 115, 212 ～ 223, 224 ～ 229
设
iΥ( x , y ) F (x , y ) = e
( 1)
为光波通过相位物体后的复振幅分布, 相衬板的 透射函数为 i∆ A = a e ( 零级光谱区域) ( 2) tp = 1 ( 其它区域) 根据空间滤波原理, 可得象面上的光强分布为 ) = C 2 A + F (x , y ) - 1 2 ( 3) ,y′ I (x ′ ( 2) 代入式 ( 3) 得 将式 ( 1) 、 ) = C 2 {a 2 + 2[ 1- a co s5 ,y′ I (x ′ ) ]} ( 4) - co sΥ + a co s ( ∆- Υ ( ) 若Α ≠0, Υ ν 1, 则式 4 可写为
的因素所决定: (a ) 在任何光学仪器内, 直射光在 到达相衬板之前穿过很多光学元件的界面, 在这 些界面上由二次反射所产生的假象能形成不能被 相衬板所阻拦的背景1 (b ) 在这样多的界面上, 表 面的缺陷和灰尘能产生有害的相当强的背景1 (c ) 由聚光镜所给出的光阑的共轭象或多或少被象差 所歪曲 1 如果相衬板非常之窄, 则由于象差的存 在, 将出现寄生的背景; 如果加大相衬板的尺寸, 虽然背景的亮度减弱, 但仪器的分辨能力也随之 下降1在本文所提出的将相衬板置于物镜前的相 衬显微镜中, 由于物面与相衬板之间无其它光学 ( b ) 两项所产生的杂散光较 元件的界面, 因而 ( a ) 、 其它相衬显微镜来说, 要弱得多; 通过适当选择相 衬板的尺寸, 在降低背景光和提高分辨能力之间 取得平衡1总之, 相衬板置于物镜前的相衬显微镜 中的杂散光要较其它相衬显微镜中的杂散光要弱 得多, 这对于加大相衬板的吸收, 提高灵敏度极为 有利1
2 (x 2 1 + y 1 ) ] t (x 1 , y 1 )
( 10) ( 10) ′
显然, 相衬板对零级频谱的吸收越大, 即 a 越小, 则衬比越大1因此, 适当地增加吸收, 可提高象的 衬比 ( 度) 1
U′ 0 ( x 1 , y 1 ) = B exp ( - jkd ) exp [ - j ( k 2d )
0 引言
相衬显微术自1935年由荷兰物理学家泽尼克 提出以来, 已广泛应用于生物学、 化学、 结晶学、 矿 物学中, 在研究有相位变化的物体中显示了巨大 的优越性1我国的显微镜工业起步于50年代, 80年 代开始研制用于生物显微观察的透射式相衬显微 镜和用于金相观测的微分干涉显微镜1但同样结 构的相衬显微镜比普通显微镜要昂贵得多, 因而 目前我国生物、 医学等部门几乎还都是采用将标 本染色后再用普通显微镜观察的方法1这种局面 对于生物的研究, 对于医学诊断水平的普遍提高 是极为不利的1能否将广泛使用的普通显微镜经 简单改装后变成相衬显微镜? 从已有的相衬显微 镜来看, 这似乎是不可能的1这是因为已有的相衬 显微镜的相衬板大都安置在物镜后或物镜内, 要 改装成相衬显微镜, 就必须在显微镜内加装相衬 板, 这样就必须变动原显微镜的结构; 而且由于不 知道原显微镜的结构参数, 也就不知道相衬板应 置于何处1本文从相位滤波的概念出发, 提出将相 衬板置于物镜前, 而对原显微镜不须做任何改动, 不仅将改装设计变为可能, 而且大大降低了难度, 抑制了杂散光, 为推广、 普及相衬显微镜探索了一 条新路1
, y 1 ) exp [ j (k 2d ) ( x + y ) ]} ( f x f y ) ( 11) (Κ d ) , f y = y 2 (Κ d ) , 将式 ( 10 ) ′
1
表明 P 2 面上能得到 P 1 面上物体的频谱1我们即可 在S ′ 处设置环型或狭缝光阑, 而在 P 2 面上安置相 应的相衬板, 这就构成了一种新的相衬显微镜系 统1
1期 刘晓元等1普通显微镜改装成相衬显微镜的一种新方法
83
A NEW M ETHOD O F ADAPTAT I O N O F GENERAL M ICRO SCO PE INTO PHASE CO NTRAST M ICRO SCO PE
3 改装实验1
根据上述原理, 我们选取 XTL - 1 型160X 双
图2 频谱面位于物镜前的相干滤波系统
F ig. 2 System of coheren t filtering w ith Fou rier p lane befo re ob jective len s
目体视显微镜来改装成单目透射 反射式相衬显 微镜, 图3是透射式改装方案的光学原理图1
1 相衬法基本原理
相衬法是通过空间滤波的方法, 将相位物体 不可见的相位分布转化为可见的光强分布1图1是 相衬显微镜的典型光路3 1
图1 相衬显微镜的典型光学系统
F ig. 1 T he no rm a l op tica l system of p ha se con tra st m icro scop e
F {U ′(x
0 2 1 2 1
式 ( 11 ) 中 f x = x 2 代入式 ( 11) , 可得 U P2 ( x 2 , y 2 ) = (B jΚ d ) exp ( - jkd ) 2 2 exp [ j ( k 2d ) ( x 2 + y 2 ) ] ( 12) T (f x , f y ) 式 ( 12) 中, T ( f x , f y ) 是 t ( x 2 , y 2 ) 的傅里叶变换, 它
2 相衬板置于物镜前的相干滤波系
光波由物平面 P 1 传播到 P 2 可按菲湿耳衍射 处理, 这样可得 P 2 面上的复振幅分布为 2 2 U P2 ( x 2 , y 2 ) = ( 1 jΚ d ) exp [ j ( k源自文库2d ) ( x 2 + y 2 ) ]
统
由图1可见, 物体的频谱面位于物镜后或物镜 内, 这种常规配置对于将普通显微镜改装成相衬 显微镜来说, 几乎是不可能的 1 图 2 是另外一种形 式的相干滤波系统, 它与图1的主要区别在于物体 的频谱面 P 2 位于显微物镜 L 2 前方, 这就有可能在 物镜前方加装相衬板, 而不须改动原显微镜的结 构, 给改装带来了极大的方便1下面利用傅里叶光 学推导 P 2 确为物面 P 1 的频谱面1
如图2 所示, P 0 与 P 2 为 L 1 的一对共轭面, P 1 与
P 3 为 L 2 的一对共轭面 1 采用逐面分析的方法, 从
着手, 找出物体的频谱面所在的位置1 S′ 在旁轴近似下, 位于 S ′ 点的单色点光源发出 的球面波在紧靠透镜 L 1 前的平面上产生的复振 幅分布可表示为 2 2 U L 1 = A exp ( jkd 0 ) exp [ j ( K 2d 0 ) ( x + y ) ]
通显微镜对比观察了反射膜片、 精抛光的玻璃表 面及波导片等, 用相衬显微镜观察的效果显著1原 来在普通显微镜下几乎观察不到变化的高反射膜 片, 在改装成的反射式相衬显微镜下, 出现了许多 明亮、 清晰的亮点 1 在精抛光的玻璃表面划上一 刀, 使之产生应力变化, 从而产生折射率的变化, 在普通显微镜下只能看到划痕, 而在改装成的透 射式相衬显微镜下观察, 除了可清楚地看见划痕 外, 划痕的周围还有清晰的细节变化 1 这表明, 相 衬显微镜能观察到因应力变化而引起的折射率的 变化1用普通显微镜观察以铌酸锂为衬底的质子 交换光波导的表面, 看不到扩散条; 而用改装成的 反射式相衬显微镜观察, 可明显看到直线型的扩 散条1这说明所改装成的相衬显微镜能观察到折射 率的差异1
第28卷第1期 光 子 学 报 V o 1. 28 N o. 1
1999年 1 月 A CTA
PHO TON ICA S I N ICA
J anua ry 1999
普通显微镜改装成相衬显微镜的一种新方法
刘晓元 龙兴武 黄 云 周宁平 高伯龙
( 国防科技大学应用物理系, 长沙 410073)
摘 要 本文提出了一种新的相衬显微镜的光路系统, 这种系统非常适用于将普通显微镜改 装成相衬显微镜1首先, 叙述了相衬法的基本原理; 接着提出了一种将相衬板置于物镜前方的 相衬显微镜系统, 并运用傅里叶光学证明了在非柯勒照明条件下在物镜前方确实存在物体的 频谱面1这种相衬显微镜系统对于将普通显微镜改装成相衬显微镜来说, 不仅简单实用, 而且 杂散光小, 有利于提高灵敏度1 关键词 显微镜; 相衬显微镜; 相衬板
5 结论
本文提出的将相衬板置于物镜前的相衬显微 镜系统对于将普通显微镜改装成相衬显微镜来 说, 不仅可行, 而且简单、 实用, 杂散光小, 具有较 大的应用价值1 论文是在高伯龙教授的悉心指导下完成的, 学生在此表示衷心的感谢!
4 对杂散光的抑制
显微镜中由于存在杂散光, 降低了对比度, 给 观察带来了极不利的影响, 尤其是在相衬显微镜 中, 当相衬板吸收很强时, 杂散光成了制约衬比 ( 度) 的主要因素, 极大地限制了灵敏度的提高1在 典型相衬显微镜中, 杂散光主要由以下几个方面 参考文献