冰冻切片技术原理ppt课件
TUNEL染色-冰冻切片-(TMR Red)
TUNEL染色（TMR Red）一、实验原理：细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。
然后大约30 ﹪的染色体DNA在Ca ²和Mg²依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180～200bp核小体DNA多聚体。
DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。
二、相关试剂：1、酶缓冲液：vial 1: Enzyme Solution2、标记液：vial 2: Label Solution3、固定液：4%多聚甲醛4、清理液：PBS（pH 7.4）5、透性处理液（Permeabilisation solution）：含0.1% TritonX–100的0.1% 柠檬酸钠的缓冲液，新鲜配制三、其他设备：1、湿盒2、荧光倒置显微镜或激光共聚焦显微镜（confocal）四、染色步骤：1、标本预处理：（1）用4%多聚甲醛固定组织20分钟（15-20℃）；（2）PBS清洗30min；（3）置于透性处理液（0.1% TritonX–100的0.1% 柠檬酸钠）中冰上孵育2min（2-8℃）2、TUNEL反应液：（1）从标记液（vial 2: Label Solution）中吸出100ul用于2个阴性对照（50ul/个）；（2）将50ul酶缓冲液（vial 1: Enzyme Solution）加入到剩余450ul的标记液中充分混合均匀，得到500ulTUNEL反应液（50ul/样本，检测10个样本）。
3、标记：（1）PBS清洗3min，3次；（2）吸干样品周围的液体；（3）往组织切片上滴加TUNEL反应液（覆盖整个切片），阴性对照加标记液；（4）湿盒中避光孵育60min，注意避光；（5）PBS清洗3min，3次；（6）抗荧光淬灭封片液封片，用荧光倒置显微镜或激光共聚焦显微镜（confocal）检测（激发波长520-560nm，最大540nm，绿光；检测波长570-620nm，最大580nm，红光。
冷冻切片技术课件ppt
现代的冷冻切片技术已经实现了自 动化、数字化和标准化，为医学研 究和诊断提供了强有力的支持。
应用领域
临床病理诊断
冷冻切片技术可用于手术中的快 速病理诊断，帮助医生确定病变 的性质和范围，为手术方案提供
重要依据。
教学
冷冻切片技术可用于制作教学标 本，为医学生和病理医生提供直
观的学习材料。
科学研究
二氧化碳冷冻喷射固定设备。
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冷冻固定设备的特点
冷冻固定设备具有操作简便、冷冻速度快、温度低等特点，能够有效地
保持组织或细胞的结构和成分不变。
切片机与刀片
切片机
切片机是用于将冷冻固定的组织或细胞样品进行切片的仪器。其工作原理是通过将组织或 细胞样品放置在切片机的工作台上，利用机械或激光等方式将样品切成薄片。
生物科学研究
利用冷冻切片技术进行细胞结构和功能的深入研 究。
药物研发
利用冷冻切片技术评估药物对细胞的作用机制。
发展前景展望
自动化与智能化
01
通过自动化与智能化技术的引入，降低冷冻切片制备的难度和
操作成本。
高分辨成像
02
发展高分辨成像技术，以获得更清晰、更深入的细胞结构和功
能信息。
跨学科，如生物工程、神经科学
将切片贴在载玻片上
将切好的切片贴在预处理的载玻片上，使其平整、无气泡。
干燥与固定
使切片在室温下干燥，并进行必要的固定处理，如用醛类化合物 进行醛化处理，以增强切片的稳定性。
染色与观察
染色
根据研究或诊断需求，选择适当 的染色方法对切片进行染色，如 H&E染色、免疫染色等。
观察
用显微镜观察染色后的切片，根 据需要调整焦距和光源强度，观 察并记录组织结构和细胞成分等 细节信息。
《切片技术》PPT课件
•micrometer (µm )= 10-6 meter
•nanometer (nm) = 10-9 meter
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组织学的研究技术
• 显微镜技术: 光镜：light microscopic, LM 电镜：electronic microscopic, EM
–透射电镜（transmission electron microscope, TEM）：观察细胞内部结构
– 勿挤压组织块
– 保持组织原有形态、保持组织清洁
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• 固定
为了阻止组织细胞的死亡后变化，防止自溶与腐败，保持组 织内细胞原有的形态结构，切取组织块后应立即进入固定液， 常用的固定方法有：
– 小块组织固定法：标本：固定液为1：4～20；最常用的方法，但组织 块不易过大过厚，最好置入冰箱冷藏室内固定，冷藏固定时间适当延 长，特别是组织化学实验用的材料，冷藏固定效果会更好。
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Embedding 包埋
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切片机
石蜡切片机
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冰冻切片机
How does a microtome work?
Microtome Arm
Tissue Block
Tissue
Section
Knife
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Microscope Slide
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切片
…on Cryostat (frozen)
Organisms
Organs
Cells (20u) Nucleus (2 u) Bacteria (0.5 u) Organelles Viruses Macromolecules A... toms
切片ppt课件
B、石蜡切片
• 其优点是组织结构保存良好，在病理和回顾性研究 中有较大的实用价值，能切连续薄片，组织结构清 晰，抗原定位准确。 • 用于免疫组化技术的石蜡切片制备与常规制片略有 不同：
• ①脱水、透明等过程应在4℃下进行，以尽 量减少组织抗原的损失;或常温条件下缩短时 间。
组织学技术及免疫组化课程
山东农业大学
• ②液氮法：
• 将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直 径约2cm），如组织块小可适量加OCT包埋 剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛 有液氮的小杯内，当盒底部接触液氮时即开 始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液 氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。
• 取出组织冰块立即置入-80℃冰箱贮存备用， 或置入恒冷箱切片机冰冻切片。
• 其基本结构是将切片机置于-30℃C低温密闭 室内，故切片时不受外界温度和环境影响， 可连续切薄片至2-4μ m，完全能满足免疫组 织化学标记要求。一般以10-30μ m为佳。
• 切片时，低温室内温度以-15℃～18℃为宜， 温度过低组织易破碎 • 抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组 织切片，切勿上下移动。
• 其方法有二：
①.干冰-丙酮（酒精）法： ②.液氮法
山东农业大学
•
①干冰-丙酮（酒精）法：
• 将150-200ml丙酮（酒精）装入小保温杯内，
逐渐加入干冰，直至饱和呈粘稠状，再加干 冰不再冒泡时，温度可达-70℃，用一小烧杯 （50-100ml）内装异戊烷约50ml，再将烧 杯缓慢置入干冰丙酮（纯酒精）饱和液内， 至异戊烷温度达-70℃时即可使用。 • 将组织（大小为1cm×0.8cm×0.5cm）投入 异戊烷内速冻30-60s后取出，或置恒冷箱内 以备切片， • 或置-80℃低温冰箱内贮存。
冰冻切片法ppt课件
方法：
• 切片固定30秒－1分钟。 • 水洗。 • 染苏木素3－5分钟。 • 分化。 • 于碱水中返蓝20秒。 • 伊红染色10－20秒。 • 脱水，透明，中性树胶封固。
操作过程中常见问题与处理
标本固定应充分
• 标本经固定或不固定均可，但经过固定的组织切片冰晶少 ，细胞挤压变形小，切片完整，染色清晰，而未固定的组 织冰晶多，细胞挤压变形大，甚至会影响观察结果。因此 ，除特别需要外，一般较多采用组织固定后再行切片。固 定方法有浸入法和灌注法，浸入法主要用于活检和手术标 本，以及其它不能进行灌注的组织固定。灌注法适用于动 物实验研究。用于组织固定的固定剂种类很多，包括醛类 、非醛类、丙酮及醇类等，其中以中性缓冲液配制多种聚 甲醛较为常用2’，- 3组织固定时，一方面固定液要有足 够的量，另一方面还要保持一定时间，一般在快速灌注固 定取材后，多用相同的固定剂再固定! % " ，以使组织充分 固定，这对保持切片的完整性尤为重要。
不甚清晰, 背景模糊。 通过使用两种不同固定方法结果的比较, 我们认为 双重固定液法在冰冻切片中应用良好, 明显优于Clarke 氏单液固定法, 值得推 广应用。
合成胶水的影响
• 临床病理工作中经常遇到一些微小组织做冰冻切片,我们 体会到,异体脏器组织包埋法中的异体脏器组织存留在载 玻片上,不易擦除干净,留有背景对切片外观有影响,时有微 小组织与异体脏器组织间包埋时易产生间隙,给切片带来 不便。石蜡包埋托法往往因包埋托有一定厚度影响冷冻时 间,而且仍然需要OCT 包埋剂。合成胶水水溶性好,与组织 结合紧密,二者形成完整整体,而且冷冻后硬度相当,利于切 片,切片上的胶膜水洗后完全溶解,不会造成污染和遗留背 景色。合成胶水用量少,冷冻时间短,组织不会形成冰晶 , 因此镜检时细胞形态完整,染色清晰。合成胶水来源简便 、经济、冷冻快速。实为一种实用的替代方法。
常规冰冻制片常见问题分析 ppt课件
每台冰冻切片机都有 一个速冻台，好的冰 冻切片机可以在几分 钟内将速冻台的温度 下 降 至 -50℃ ～ -60℃ 度之间。
冷冻锤从上面压在组 织上，可以使组织上 下两面同时冷冻
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一台冰冻切片机有多个冷冻锤
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6、液氮和急冻剂
使用液氮和急冻 剂来快速冷冻组织
7、专用冷冻机
• 你所经历的课堂，是讲座式还是讨论式？ • 教师的教鞭 • “不怕太阳晒，也不怕那风雨狂，只怕先生骂我
笨，没有学问无颜见爹娘 ……”
• “太阳当空照，花儿对我笑，小鸟说早早早……”
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一、冰冻切片制片中冰晶的问题
冰晶的产生：当组织缓慢冷冻时，组织间隙的 水份凝固形成的，这时由于电解质析出，渗透压 升高，细胞内的水分子渗透到细胞外，使组织间 隙的冰晶变得更大，挤压周围组织，使组织细胞 的形态发生明显的改变，严重影响病理诊断。
1、正确选择染色试剂苏木素、伊红的配方 2、注意染色过程中的细节问题
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1、苏木素、伊红配方的选择
（1）改良Gill苏木素液：
苏木2.5克溶于乙二醇250ml中。硫酸铝铵17.6克溶于蒸馏水 730ml,以上二液充分溶调后混合，加碘酸钠0.2克，使用前加 冰醋酸20ml.
（2）酸化沉淀伊红液 贮 备 液 ： 伊 红 20 克 ， 蒸 馏 水 500ml, 经 充 分 溶 解 后 加 浓 盐 酸
5、购置专用冷冻机、急冻剂、专用液氮灌
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二、常规与冰冻制片中常见问题
切片染色的问题
冰冻切片制作与染色过程中常见问题与处理精品PPT课件
– 未经固定的脑组织、肝组织：-10- -15℃左右 – 甲状腺、脾、肾、肌肉等组织：-15～20℃ – 含脂肪组织，-25℃左右 – 含大量的脂肪 -30℃
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保持切片的完整性
• 切片破碎不全、有缺损的常见原因
– 固定不完全 – 温度设置不当 – 组织块过冷、过硬，则切片就容易破碎 – 组织块冷冻不够，硬度和韧度达不到，切片也同
样易粘、易碎 – 组织块带有皮肤、包膜、过大或冰晶过多 – 切片刀钝或较脏，切片出现刮痕，使切片不完整 – 操作手法不当，如速度不适宜
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防止切片卷缩
• 常见原因
– 切片刀钝或粘有组织碎屑 – 防卷板位置不正确或防卷板较脏 – 静电或者气流作用 – 防卷板温度高、室温高
• 采取对策：
– 保持防卷板干净、平整、无缺损、无刮伤 – 戴口罩，以避免呼出的气流直接吹到防卷板 – 切片时间过长时，应注意间隔一会儿，盖上冷冻室
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Con. TNBS
LY
ZD7288
2014.4.20 TRPV1+CGRP
同一载玻片上 • 包括各个所有组 • 染色齐性
TNBS
ZD7288
Con. LY
L1 DRG
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Con. TNBS
LY
ZD7288
2014.4.20 TRPV1+CGRP
TNBS
ZD7288
Con. LY
为防止冰晶的形成 • 采取如下方法
– 速冻法：将组织置入低温环境，使组织骤然降 温
– 利用高渗溶液吸收组织水分子：将组织置于 20% —30%的蔗糖溶液中，置4摄氏度冰箱足够 时间（多长时间? 判定？）
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冰冻切片详细说明之欧阳育创编
冰冻切片详细说明切片技术最早期是从冰冻切片开始，后来逐步有了发展和更新，冰冻切片弥补了石蜡切片和火棉胶切片之不足，石蜡切片和火棉胶切片需时太久，且在制片中要使用许多化学试剂，石蜡切片还需要加温过程，因而某些重要的不稳定的组织成分如脂类、酶以及抗体等，可能被溶解和破坏。
冰冻切片过程较简单，无须经过上述步骤，组织中的水分起着包埋剂的作用，组织经固定或不固定即可进行冰冻切片，切片厚度一般可在6-8微米，组织没有收缩，易保持生活时原有状态，是保存脂肪组织，许多神经组织特殊染色方法和组织化学方法，特别是酶的活性十分理想的切片方法，对于外科临床诊断和现代免疫荧光诊断，冰冻切片也很重要。
其缺点是组织过大不易冰冻，连续切片困难。
5微米以下切片不易成功。
但是随着现在冰冻包埋液的不断改进，已经能切出少于3微米的切片一、直接冰冻切片法冰冻切片多用于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。
组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片。
1．恒冷箱切片就是将组织在恒冷箱的切片机切片。
目前恒冷箱切片机的品种较多。
此种切片适用于科研和教学上的连续切片。
要求预先开动电源（预冷准备），配多种固定组织台，以便更换组织。
2．甲醇制冷器制冷箱为附有带导管的制冷台和制冷刀的甲醇循环装制，其冷却速度比较快，属于开放式，作一般常规冰冻切片用。
3．二氧化碳冰冻法将组织用蒸馏水洗后，放在冰冻切片机的冷冻台上，加蒸馏水少许。
打开冷冻台的二氧化碳开关，二氧化碳气体喷出，待组织出现冷霜时，将二氧化碳关闭，即可切片。
若组织冷冻过硬则切片易碎；组织冷冻硬度不足，则切片呈粥糜状，需用间歇方法继续冷却。
硬度一般在刚开始解冻时最合适，应迅速切片。
4．半导体致冷冰冻切片法将组织置半导体致冷台上，滴加少许蒸馏水，调好切片机的厚度。
先接通热器的循环流水，然后接通电源，电源的正负极切勿接反，用整流电源控制温度。
二、明胶冰冻切片法明胶包埋法一般多用于冰冻切片易破碎的组织，特别是某些有树枝状突起的组织，当其切片后投入水中时，常常引起分散，甚至发生丢失，某些间隙较多的组织，有时会因发生散乱而失去相互间的联系，可形成移位现象。
冰冻切片技术原理ppt课件
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四、冷冻切片的制作方法
• 5.以粗切削的方式进行标本的粗切削至暴露标本的最大平 面，用毛笔清除机头、标本托及刀片上的组织碎屑。
• 6.确认切片的厚度，一般6~10um不等，根据组织的不同 可适当调整切片的厚薄。
• 1.切片前，厚度应预先调制好，刀具提前安放好。 • 2.刀的角度调好位置，并多备几个冷冻托，以供速冻组织
块使用。 • 3.切片时，观察窗不可打开过大，以防温度升高影响切片。 • 4.每一例冷冻切片完成后都应及时清理冷冻组织碎屑，以
防造成污染。 • 5.切片污染是病理组织制片的大忌，在冷冻切片粗削后必
• 二、冷冻切片染色的注意事项
• 1.提倡使用新鲜苏木精染液，每天过滤，防止沉渣及结晶 的形成，保证高质量的冷冻切片以利诊断。
• 2.室温过低时，影响着色，可适当加温促进染色。 • 3.盐酸酒精分化应适度，显微镜下控制，否则易造成核着色
不佳，染色质不清晰，影响诊断。
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七、冷冻切片机的使用注意事项及日常维护
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二、恒温冷冻切片机的结构与功能
• 1.结构：恒温冷冻切片机主要由冷箱体及切片机构成，具 有快速双重制冷、自动除霜、自动消毒、负压等功能。
• 2.功能：利用物理降温的方法将新鲜组织标本冷冻使其产 生一定的硬度进行切片，与石蜡切片相比，冷冻切片不需 要脱水处理，因此制片速度快，是为术中提供快速病理诊 断的良好方法。
冷冻切片制作技术
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• 一、冷冻切片的意义 • 二、恒温冷冻切片机的结构与功能 • 三、冷冻切片组织的取材 • 四、冷冻切片的制作方法 • 五、冷冻切片的固定和染色 • 六、冷冻切片的标准及染色的注意事项 • 七、冷冻切片机的使用注意事项及日常维
冰冻切片中常见问题分析ppt课件
8、组织块脱落：
冷冻切片一般要求在30min内发出病理报告，以便手术医 生能尽快选择手术方式。但若组织块脱落，会拖延病理报 告发出的时间，而耽误病人的手术时间。常见原因有：① 冻头在冷冻机内放置时间过长，致使包埋胶还来不及渗到 冻头的底部便凝固了，导致包埋胶与冻头粘连不紧，稍受 外力的作用便脱落；② 冻头上的包埋胶冲洗不干净。
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总之，对于冰冻切片的质量因素主要 有以上几点。如果能正确对待以上几 方面的问题，冰冻切片的质量方可得 到保证，且能制备出一张质量优秀的 切片，为明确病理诊断提供较为便利 的客观条件。
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预防及处理方法：避免组织内带有坏死组织，条
件允许者重新取材；若没有组织可代替，切片固 定时间长些，经95％乙醇双重固定后，用电吹风 将切片吹干（温度不能过高，以防破坏组织结构） 然后再进行染色且动作应轻柔。② 定期更换固定 液。一般每周更换一次，例数较多者，适当增加 次数；另外，每次做完冷冻，应及时将盛固定液 的瓶盖盖好，以防固定液挥发而降低其浓度。③ 保持载玻片干净，平时应将玻片盖好，防止灰尘 或其它异物的污染。若新购买的玻片较脏，洗涤 过后才使用。④ 调好切片的厚度，切片厚度以 5～7um较为合适（脂肪组织可稍为厚些）。
冰冻切片中 常见问题分析
1、组织取材对制片的影响
组织取材大小：组织块大小要适宜，冷冻切片机 内切片刀移动的范围有一定的限制，超出其范围 时，易致切片不全。一般情况下，冰冻切片的组 织大小为1.5×1.5㎝,厚2㎜。但卵巢肿瘤及脂肪组 织可稍微大些。组织块过大，切片时阻力过大， 易产生皱折，刀痕，组织易崩碎，增加制片难度， 影响诊断。如需在同一标本托上放大于两块组织 时，应尽量冻成一个平面，与刀锋平齐，以防切 片不完整，发生漏诊。若送检组织过小，请预先 速冻一冷台面，再行包埋，利于制片。另外，包 埋时，应将组织平放在Pa冻ge 2头的中央。
《冰冻切片法》课件
近年来，冰冻切片技术不断改进，如冷冻保护剂的选择、制冷剂的种类和切片刀 的材质等方面都有所突破，提高了制片质量和效率。同时，冰冻切片法与其他技 术如免疫荧光、原位杂交等结合使用，为科学研究提供了更多手段。
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冰冻切片法的技术原理
冰冻切片的制作过程
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样本准备
将待检测组织固定在冷冻 台上，用冷丙酮或包埋剂 进行冷冻。
细胞结构和超微结构。
冰冻切片法的缺点
技术要求高
冰冻切片技术要求高，需要熟练的操 作技巧和经验，才能获得高质量的切 片。
设备昂贵
冰冻切片机等设备较为昂贵，增加了 制片成本。
容易产生冰晶
在冷冻过程中，组织内部容易形成冰 晶，影响切片的清晰度。
制片质量不稳定
由于制片过程中涉及多个步骤，且每 个步骤都可能影响制片质量，因此制 片质量有时不太稳定。
切片制作
使用冷冻切片机将冷冻的 组织切成5-10微米厚的切 片。
贴片与固定
将切片贴在载玻片上，并 用丙酮固定。
冰冻切片的质量控制
切片厚度
确保切片厚度均匀，一般 在5-10微米之间。
组织完整性
确保组织结构完整，无破 碎或裂痕。
染色效果
染色效果应均匀，无沉淀 或悬浮物。
冰冻切片的染色方法
苏木精-伊红染色法
基因表达研究
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通过冰冻切片技术，可以对组织中的基因表达进行快速检测和
分析，有助于研究基因功能和疾病机制。
在其他领域的应用
食品安全检测
冰冻切片技术可用于快速检测食品中的有害物质和微生物， 保障食品安全。
环
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冰冻切片法的优缺点及展望
冰冻切片法的优点
冰冻切片的原理和流程
冰冻切片的原理和流程下载温馨提示:该文档是我店铺精心编制而成，希望大家下载以后，能够帮助大家解决实际的问题。
文档下载后可定制随意修改，请根据实际需要进行相应的调整和使用，谢谢!并且，本店铺为大家提供各种各样类型的实用资料，如教育随笔、日记赏析、句子摘抄、古诗大全、经典美文、话题作文、工作总结、词语解析、文案摘录、其他资料等等，如想了解不同资料格式和写法，敬请关注!Download tips: This document is carefully compiled by theeditor. I hope that after you download them,they can help yousolve practical problems. The document can be customized andmodified after downloading,please adjust and use it according toactual needs, thank you!In addition, our shop provides you with various types ofpractical materials,such as educational essays, diaryappreciation,sentence excerpts,ancient poems,classic articles,topic composition,work summary,word parsing,copy excerpts,other materials and so on,want to know different data formats andwriting methods,please pay attention!冰冻切片的原理和流程冰冻切片是一种常见的生物样品处理方法，它可以将生物样品快速冻结并切割成薄片，以便于观察和分析。
冰冻切片
1.体式显微镜下，用显微剪刀沿角膜缘剪下角膜，将眼杯置于固定液内（0.2M NaH2PO410ml + 0.2M Na2HPO4 40ml + 8%多聚甲醛50ml），４℃固定过夜2.体式显微镜下，用显微剪剪除虹膜，并剪断晶体悬韧带，晶体自动游离出眼杯，尽量减少对眼杯扰动，将眼杯置于30%蔗糖（sucrose）溶液内（0.1M PB配置PH=7.4），４℃脱水过夜沉底3.将眼杯由30%蔗糖溶液取出，置于20%蔗糖溶液与OCT包埋剂（TFM™ Tissue FreezingMedium）2：1体积比例混合液中，室温浸泡摇动30min4.体式显微镜下，于平皿内用软纸采用虹吸方式吸干眼杯内外水份，尽量减少对眼杯扰动5.在模具（tissue-tek 4565）上标记样品情况，向模具内倒入20%蔗糖溶液与OCT包埋剂2：1体积比例混合液，将眼杯开口向上置于液体上，先用显微镊子按压一侧眼球（下方），使液体缓慢浸满眼杯，而后将眼杯在琼脂糖翻转，杯口朝下置底，上方眼球标记点朝向模具标记位置并置中，并使鼻侧或颞侧眼球靠近模具壁，将模具置于钢板上，移至-80℃冰箱（保证眼杯在内不动），静置10min6.将模具置于冰冻切片机恒冷箱内1h（冰冻切片参数切割头-17℃，恒冷箱-20℃），温度平衡至-20℃，样本块颜色至瓷白色，并在对应模具标记位置标记样本块（眼球上方），将样本块由模具内顶出，用刀片修整样本块7.在支撑器上涂抹OCT，待颜色稍变化，将样本块预切割侧向上（靠近模具壁侧），置于OCT内，将压制块置于标本块上8.待OCT液变色为瓷白色，将支撑器连同样本块固定于切割头上，样本块标记侧向上，将刀片保护套去除后，逐步调节样本块与刀片距离（后退钮为连续性，前进钮为间断性）9.当刀片开始切割组织块时，先将切片厚度调至30μm进行粗切，并放置下防卷板，以连续均匀的力量转动切片机的摇柄，当切割至目标区，将切片厚度调至12μm10.在促黏合载玻片上标记样本情况，先在恒冷箱预冷片刻，掀开防卷板，用刷子将冰冻切片展开平整，将载玻片黏合剂侧向下，载玻片标记侧靠近切割头，将冰冻切片敷贴于载玻片上（眼球上方统一朝向载玻片标记侧）11.载玻片室温干燥过夜，置于-20℃或-80℃冰箱内，标本块置于模具内，包装严实后置于-20℃或-80℃冰箱内注：OCT冰冻切片包埋剂（opti-mum cutting temperature compound）：一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物，其用途是在冰冻切片时支撑组织，以增加组织的连续性，减少皱折及碎裂。
冰冻切片详细说明之欧阳引擎创编
冰冻切片详细说明欧阳引擎（2021.01.01）切片技术最早期是从冰冻切片开始，后来逐步有了发展和更新，冰冻切片弥补了石蜡切片和火棉胶切片之不足，石蜡切片和火棉胶切片需时太久，且在制片中要使用许多化学试剂，石蜡切片还需要加温过程，因而某些重要的不稳定的组织成分如脂类、酶以及抗体等，可能被溶解和破坏。
冰冻切片过程较简单，无须经过上述步骤，组织中的水分起着包埋剂的作用，组织经固定或不固定即可进行冰冻切片，切片厚度一般可在6-8微米，组织没有收缩，易保持生活时原有状态，是保存脂肪组织，许多神经组织特殊染色方法和组织化学方法，特别是酶的活性十分理想的切片方法，对于外科临床诊断和现代免疫荧光诊断，冰冻切片也很重要。
其缺点是组织过大不易冰冻，连续切片困难。
5微米以下切片不易成功。
但是随着现在冰冻包埋液的不断改进，已经能切出少于3微米的切片一、直接冰冻切片法冰冻切片多用于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。
组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片。
1．恒冷箱切片就是将组织在恒冷箱的切片机切片。
目前恒冷箱切片机的品种较多。
此种切片适用于科研和教学上的连续切片。
要求预先开动电源（预冷准备），配多种固定组织台，以便更换组织。
2．甲醇制冷器制冷箱为附有带导管的制冷台和制冷刀的甲醇循环装制，其冷却速度比较快，属于开放式，作一般常规冰冻切片用。
3．二氧化碳冰冻法将组织用蒸馏水洗后，放在冰冻切片机的冷冻台上，加蒸馏水少许。
打开冷冻台的二氧化碳开关，二氧化碳气体喷出，待组织出现冷霜时，将二氧化碳关闭，即可切片。
若组织冷冻过硬则切片易碎；组织冷冻硬度不足，则切片呈粥糜状，需用间歇方法继续冷却。
硬度一般在刚开始解冻时最合适，应迅速切片。
4．半导体致冷冰冻切片法将组织置半导体致冷台上，滴加少许蒸馏水，调好切片机的厚度。
先接通热器的循环流水，然后接通电源，电源的正负极切勿接反，用整流电源控制温度。
二、明胶冰冻切片法明胶包埋法一般多用于冰冻切片易破碎的组织，特别是某些有树枝状突起的组织，当其切片后投入水中时，常常引起分散，甚至发生丢失，某些间隙较多的组织，有时会因发生散乱而失去相互间的联系，可形成移位现象。
冰冻切片技术
冰冻切片技术1：实验原理：利用物理降温的方法将新鲜组织标本冷冻产生一定的硬度进行切片，与石蜡切片相比，冷冻切片不需要脱水处理。
因此制片速度快，是术中进行快速病理争端的良好方法。
2：实验步骤：①取材：从新鲜的小鼠中剖取肝、肺、心、胰腺、肾等组织器官至载玻片上②冷冻前将恒温冷冻切片机的速冻住头温度和箱内温度调至-20--15℃，将组织器官移到涂了一层耦合剂的组织支承器冻面上，用镊子压平，再挤上一层耦合剂覆盖标本。
放至冰冻机中降温处理③标本冷冻后将组织支承器固定在切片机的机头上，调整机头的位置使其正好位于切片刀的后方。
④以粗修的方式粗修到暴露标本的最大平面，用毛笔清除机头、组织支承器及刀片上的组织碎屑。
⑤确认切片的厚度，一般为4到5vm不等，根据组织的不同可适当调整切片的厚薄。
⑥放下放卷板使其位置恰好与刀片的刀刃完全平行并略突出刀刃⑦以转动大轮推进的方式进行切片，良好的切片将在放卷板的下方形成一张完整平坦无褶的薄片，若切片略有弯曲，可用毛笔轻轻展平。
⑧打开放卷板，将标记好的载玻片平稳的轻压组织，使其平整的吸附到载玻片上。
⑨将切好的标本薄片迅速放入95％的乙醇固定液中进行3min的固定，再经过1min的流水冲洗，进入染色程序⑩按照：苏木素（1min）→流水冲洗（3min）→伊红染液（30s）→流水冲洗（1s）→85％乙醇→95%乙醇（10s）→无水乙醇①（30s）→无水乙醇②（1min）→二甲苯①（1min）→二甲苯②（1min）①将染色完成的标本使用树胶与盖玻片进行封片操作②将标本放到显微镜下，观察拍照记录10×、40×的镜下观3：实验结果：在镜下可观察到小鼠的肝细胞，细胞核被染成蓝色，胞质及细胞间隙被染成淡红色，同时可见大多数细胞中脂肪将细胞核挤到细胞一侧。
4：结果分析及讨论：①切片前先预调好厚度，提前准备好要使用的工具。
②切片时，观察窗不可打开过大，预防温度升高影响切片③在每一次切片之后都应该要注意清理碎屑，以防污染④严格把握染色时间，避免因染色时间太短或太长而影响实验观察5：思考题：①什么时候做冰冻切片：1：在手术:进行中，突然发现病人的病变原及诊断，判断病变是否为肿瘤2：判断肿瘤的良恶性2：了解淋巴结是否有转移的肿瘤细胞，或者转移的程度，以利于确定是否需要彻底扫除淋巴结或者其他的治疗措施。
冷冻技术原理ppt课件
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二、低温与酶的活性控制
低温对酶活性并不起完全的抑制作用，酶仍能保持部分活 性，因而，酶催化作用实际上也未停止，在长期的冷藏过 程中，酶的作用仍可使食品变质。 例如，胰蛋白酶在-30℃下仍然有微弱的活性，
脂肪分解酶在-20℃下仍能引起脂肪水解。 一般来说，如将温度维持在-18℃ 以下，酶的活性才 会受到很大程度的抑制。 因此，商业上一般将冻制食品放于-18℃下冻藏，对于 多数冻制食品可贮藏数周至数月。
☞ 在冰点左右，特别在冰点以上，微生物仍然具有一定 的生长繁殖能力，虽只有部分能适应低温的微生物和嗜冷 菌逐渐增长，但最后会导致食品变质。对低温不适应的微 生物则逐渐死亡。这就是高温冷藏食品时仍会出现不耐久 藏的原因。
☞ 稍低于生长温度或冻结温度时对微生物的威胁性最大， 一般为-1～-12℃,尤以-2～-5℃为最甚，此时微生物的活 动会受到抑制或几乎全部死亡。
当温度降低到微生物最低生长温度 时，它们就停止生长并出现死亡。
值得注意的是，低温可以减缓微生 物的生长和活力，并可使部分细菌死 亡，但死亡速度比在高温下缓慢得多。 仅依靠冷是不能使食品杀菌。
不同微生物对低温的敏感性不同，许 多嗜冷菌和嗜温菌的最低生长温度低 于0℃，有的可达-8℃。
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长期处在低温中的微生物能产生新的适应性，这是长 期低温培育中自然选育后形成了能适应低温的菌种。这种 微生物对低温的适应性可以从微生物生长时出现的滞后期 缩短的情况加以判断
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（二）低温导致微生物活力减弱和死亡的原因
3、冰晶体引起的机械伤害 细胞内外冰晶体的形成和增大还会使微生物细
冰冻切片详细说明之欧阳法创编
冰冻切片详细说明切片技术最早期是从冰冻切片开始，后来逐步有了发展和更新，冰冻切片弥补了石蜡切片和火棉胶切片之不足，石蜡切片和火棉胶切片需时太久，且在制片中要使用许多化学试剂，石蜡切片还需要加温过程，因而某些重要的不稳定的组织成分如脂类、酶以及抗体等，可能被溶解和破坏。
冰冻切片过程较简单，无须经过上述步骤，组织中的水分起着包埋剂的作用，组织经固定或不固定即可进行冰冻切片，切片厚度一般可在6-8微米，组织没有收缩，易保持生活时原有状态，是保存脂肪组织，许多神经组织特殊染色方法和组织化学方法，特别是酶的活性十分理想的切片方法，对于外科临床诊断和现代免疫荧光诊断，冰冻切片也很重要。
其缺点是组织过大不易冰冻，连续切片困难。
5微米以下切片不易成功。
但是随着现在冰冻包埋液的不断改进，已经能切出少于3微米的切片一、直接冰冻切片法冰冻切片多用于新鲜组织、甲醛固定组织和冰箱冷藏组织等。
组织块不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后再进行切片。
1．恒冷箱切片就是将组织在恒冷箱的切片机切片。
目前恒冷箱切片机的品种较多。
此种切片适用于科研和教学上的连续切片。
要求预先开动电源（预冷准备），配多种固定组织台，以便更换组织。
2．甲醇制冷器制冷箱为附有带导管的制冷台和制冷刀的甲醇循环装制，其冷却速度比较快，属于开放式，作一般常规冰冻切片用。
3．二氧化碳冰冻法将组织用蒸馏水洗后，放在冰冻切片机的冷冻台上，加蒸馏水少许。
打开冷冻台的二氧化碳开关，二氧化碳气体喷出，待组织出现冷霜时，将二氧化碳关闭，即可切片。
若组织冷冻过硬则切片易碎；组织冷冻硬度不足，则切片呈粥糜状，需用间歇方法继续冷却。
硬度一般在刚开始解冻时最合适，应迅速切片。
4．半导体致冷冰冻切片法将组织置半导体致冷台上，滴加少许蒸馏水，调好切片机的厚度。
先接通热器的循环流水，然后接通电源，电源的正负极切勿接反，用整流电源控制温度。
二、明胶冰冻切片法明胶包埋法一般多用于冰冻切片易破碎的组织，特别是某些有树枝状突起的组织，当其切片后投入水中时，常常引起分散，甚至发生丢失，某些间隙较多的组织，有时会因发生散乱而失去相互间的联系，可形成移位现象。
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• 1.冷冻前将恒温冷冻切片机的速冻头温度和箱内温度调整 到适宜的切片温度，一般情况下为-25~-18℃。
• 2.在标本托上涂一层冷冻包埋剂OCT，然后将取材后的新 鲜标本安放在标本冷冻托上并用OCT包埋剂覆盖标本。
• 3.组织较小或较薄，可先将OCT滴加在标本托上，冻成一 个小冷台，将组织放在小冷台上，再覆盖OCT冷冻，并用 冷冻锤轻轻压平。
• 11.正确地调整使用冷冻切片机的放卷板是获得平展完整 冷冻切片的重要手段，放卷板的正确位置是，与切片刀的 刀刃平行并略微突出于刀刃。
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五、冷冻切片的固定和染色
• 一、冷冻切片的固定、固定液的选择
• 1.丙酮液 • 2.10%中性福尔马林缓冲液 • 3.95%酒精 • 4.乙醚、纯酒精等量混合固定液 • 5.AF液 • 6.AFA液 • 可根据工作要求选择适合于本单位的固定液
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六、冷冻切片的标准及染色的注意事项
• 一、冷冻切片的标准
• 1.操作正确 • 2.切片完整 • 3.厚薄均匀 • 4.无褶无刀痕 • 5.组织内无冰晶 • 6.核质分明，染色适度 • 7.组织结构清晰 • 8.脱水透明洁净 • 9.封裱美观 • 10.时间迅速
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六、冷冻切片的标准及染色的注意事项
须用毛笔清洁碎屑，以防其他组织碎屑沾染到正在进行切 片的标本上。
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制作人：许艳华
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• 4.标本冷冻完成后将标本托固定在切片机的机头上，调整 机头的位置使其恰好位于切片刀的后方。
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四、冷冻切片的制作方法
• 5.以粗切削的方式进行标本的粗切削至暴露标本的最大平 面，用毛笔清除机头、标本托及刀片上的组织碎屑。
• 6.确认切片的厚度，一般6~10um不等，根据组织的不同 可适当调整切片的厚薄。
• 二、冷冻切片染色的注意事项
• 1.提倡使用新鲜苏木精染液，每天过滤，防止沉渣及结晶 的形成，保证高质量的冷冻切片以利诊断。
• 2.室温过低时，影响着色，可适当加温促进染色。 • 3.盐酸酒精分化应适度，显微镜下控制，否则易造成核着色
不佳，染色质不清晰，影响诊断。
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七、冷冻切片机的使用注意事项及日常维护
• 1.结构：恒温冷冻切片机主要由冷箱体及切片机构成，具 有快速双重制冷、自动除霜、自动消毒、负压等功能。
• 2.功能：利用物理降温的方法将新鲜组织标本冷冻使其产 生一定的硬度进行切片，与石蜡切片相比，冷冻切片不需 要脱水处理，因此制片速度快，是为术中提供快速病理诊 断的良好方法。
• LEICA CM1850
• 7.放下放卷板使其位置恰好与刀片的刀刃完全平行并略突 出刀刃。
• 8.以转动大轮推进的方式进行切片，良好的切片将在放卷 板下方形成一张完整平坦无褶的薄片，若切片略有弯曲可 用小毛笔轻轻展平。
• 9.打开放卷板，用载玻片平稳的轻压组织，使其平整的吸 附到载玻片上。
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四、冷冻切片的制作方法
• 10.也可不使用放卷板，用毛笔轻带组织下方的白边（OCT），随机 器的慢慢转动，用毛笔轻轻从上至下展开组织，使其平坦，组织齐 全满意时，用毛笔轻轻压住切片的下方，右手拿载玻片轻 轻平稳地压组织，使其平整地吸附在载玻片上，迅速放入固 定液，进入染色程序。
用于临床手术科室快速组织学诊断，特别是在手术进行当 中取出病变组织，要求病理医师在很短的时间内做出良、 恶性的正确的诊断，为临床医师下一步的手术方案及治疗 提供指导。 • 2.显示组织中脂质 脂肪染色和神经组织髓鞘的染色等 • 3.显示酶活性 主要应用于肌肉活检的检查 • 4.免疫荧光的研究
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二、恒温冷冻切片机的结构与功能
• 1.切片前，厚度应预先调制好，刀具提前安放好。 • 2.刀的角度调好位置，并多备几个冷冻托，以供速冻组织
块使用。 • 3.切片时，观察窗不可打开过大，以防温度升高影响切片。 • 4.每一例冷冻切片完成后都应及时清理冷冻组织碎屑，以
防造成污染。 • 5.切片污染是病理组织制片的大忌，在冷冻切片粗削后必
.
三、冷冻切片组织的取材
• 1.标本必须新鲜无固定，无液体浸泡； • 2.组织块大小厚薄适宜； • 3.组织块未受挤压； • 4.尽量保持组织的原有形态； • 5.选择好组织切面； • 6.保持组织的清洁； • 7.切除不需要的部分，遇有脂肪组织要剔除； • 8.组织内有异物一定要清除。
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四、冷冻切片的制作方法
冷冻切片制作技术
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• 一、冷冻切片的意义 • 二、恒温冷冻切片机的结构与功能 • 三、冷冻切片组织的取材 • 四、冷冻切片的制作方法 • 五、冷冻切片的固定和染色 • 六、冷冻切片的标准及染色的注意事项 • 七、冷冻切片机的使用注意事项及日常维
护
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一、冷冻切片的意义
• 1.快速Байду номын сангаас断：冷冻切片可称之为病理科的急诊工作，常
.
五、冷冻切片的固定和染色
• 二、冷冻切片染色
• 1.冷冻切片应立即放入固定液中。 • 2.固定1min左右，水洗。
• 3.入苏木精染色2min，水洗。 • 4.1%盐酸酒精分化数秒，水洗。（0.5%氢氧化铵水溶液
返蓝数秒，水洗） • 5.伊红染液20s-1min，水洗。 • 6.70%乙醇、80%乙醇、95%乙醇逐级脱水。 • 7.无水乙醇脱水2次。 • 8.二甲苯透明两次。 • 9.中性树胶封固。