青霉素培养基优化ppt课件

苯乙酸 0.7g 1.0g 1.3g
水平
1 2 3
设计适合的正交表
• 由于是三因子三水平，可选用L9(34) • 将乳糖/葡萄糖、醋酸铵、苯乙酸分别安排 在第2、3、4列，第1列为空列。 • 为了优化产青霉素的培养基，即比较各培 养基产生的青霉素的含量，就可以确定最 佳优化培养基成分。 • 本设计方案用抑菌圈大小来间接测定青霉 素产量。
• 4、生测平板的制备:生测培养基400ml,加入适当 稀释的金黄色葡萄球菌后,制成3*6+2 个平板。 • 5、青霉素发酵液效价的测定: 发酵结束后 5000rpm 离心5min．每个被测样品用3 套平皿 进行测定；37℃培养18-24h 后,量取抑菌圈直径 的大小。 • 6、填正交实验表格,确定最优培养基配方。
针对三因子进行正交实验
• 乳糖----------22.5g 或葡萄糖----------7.5g • 醋酸铵----------8.0g • 苯乙酸---------1.0g
青霉素培养基因子水平表
因子
乳糖/葡萄糖 20/10g 22.5/7.5g 25/5g
醋酸铵 7.0g 8.0g 9.0g
正交实验表特点
• （1）任何两因素之间的都是全面实验，从而保持 了可比性。即任何两个因素的各种不同水平的搭 配在实验中都出现了，并且出现了相同的次数。 • （2）任一因素个水平的重复次数相等。 • （3）绝大多数正交表中各列是等价的，可以任意 取用。因此，正交表的实验结果非常易于分析， 以至于不需要进行复杂的统计计算，就可直接求 出各因素影响的大小、效应的变化趋势等。
青霉素分泌期
菌丝自溶期
青霉素发酵培养基成分：
碳源：青霉菌能利用多种碳源如乳糖、蔗糖、葡萄糖
目前采用淀粉水解糖，糖化液进行流加。 等。
氮源：可采用玉米浆（0.3%-0.4%）、花生饼粉、精制 前体：为生物合成含有苄基基团的青霉素G，需要在发
棉籽饼粉或麸皮粉等有机氮源，及醋酸铵（提供氮源，同时提供 碳源）、氯化氨、硫酸氨、硝酸氨等无机氮源。 酵中加入前体如苯乙酸或苯乙酰胺。由于它们对青霉素有 一定毒性，故一次加入量不能大于0.1%，并采用多次流 加方式加入。 霉素有毒害作用，应严格控制发酵液中铁含量在 30ug/mL以下。
无机盐：包括硫、磷、钙、镁、钾等盐类。铁离子对青
青霉素发酵培养基基本配方
• • • • • • • • • • • 乳糖----------22.5g, 葡萄糖----------7.5g, 醋酸铵----------8.0g, Na2SO-----------40.5g, MgSO4•7H2O----------0.25g, FeSO4•7H2O----------0.1g, CuSO4•5H2O----------0.005g, MnSO4•7H2O----------0.02g, CaCl2•2H2O----------0.05g, ZnSO4•7H2O----------0.02g, 苯乙酸---------1.0g, 蒸馏水---------1000ml, pH 6.5 121℃灭菌 20min
碳源PK：乳糖比葡萄糖更优越
青霉素的生物合成，受糖分解代谢产物 的阻遏，如合成青霉素的酰基转移酶就 会被阻遏。 在青霉素发酵过程中，被青霉素迅速利 用的葡萄糖有利于菌体生长，但抑制青 霉素的合成。 被缓慢利用的乳糖，水解成单糖的速度 正好符合青霉素生产期合成青霉素的需 要，而又不会产生高浓度的分解产物来 抑制青霉素的合成，是生产青霉素的优 越碳源。
前体物质
前体：某些化合物加入到发酵培养基中， 能直接被微生物在生物合成过程结合到产 物分子中去，而其自身的结构并没有多大 变化，但是产物的产量却因加入而有较大 的提高。
青霉素：分子量356
苯乙酸:分子量136
Hale Waihona Puke Baidu
青霉素产生菌的生长过程
分生孢子发芽期 菌丝繁殖期 菌丝生长期
脂肪粒形成期
脂肪粒减少，小空孢 大空孢 自溶
1 1 2 3 1 2 3 1 2 3
正交实验表：
列号 试验号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 k1 k2 k3 1 1 2 3 1 2 3 1 2 3 2 乳糖/葡糖糖 1 1 1 2 2 2 3 3 3 3 醋酸铵 1 2 3 2 3 1 3 1 2 4 苯乙酸 1 3 2 2 1 3 3 2 1 抑菌圈 （g/L）
极差R
列号 试验号 • 1 2 3 4 5 6 7 8 9
• 但是，由于乳糖价格 较贵，成本较高，故 在生产实践中常通过 间隙或滴加葡萄糖的 方法控制培养液中糖 的含量，以符合菌体 生长和青霉素生物合 成的需要。 • 这样，在青霉素的生 产中，降低了生产成 本的同时，又提高了 青霉素的产量。
青霉素培养室
培养基优化步骤：
• 1、发酵培养基的配制:按照正交表配制50ml。(三 组:每组配制一种培养基,各接种一瓶,250ml 三角 瓶装液量为50ml) • 2、摇瓶培养:从一级斜面菌株接种到三角瓶液体 培养基, 25℃200rpm 培养6-7 天,可进行青霉素 的效价测定。 • 3、金黄色葡萄球菌菌悬液的制备:将37℃培养1618h 的斜面菌种,用0.9%生理盐水洗下，菌悬液稀 释至波长650nm 透光率为20%的溶液,需要12ml。
生产青霉素的菌种
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•
目前，国内青霉素生产菌按其在深层培养中菌 丝的形态分为丝状菌和球状菌两种。 根据丝状菌产生孢子的颜色又分为黄孢子丝状 菌和绿孢子丝状菌，常用菌种为绿孢子丝状菌， 如产黄青霉菌。
青霉素制备的一般流程图
菌种 孢子制备 种子制备 发酵阶段
前体
发酵
发酵液预处理及种子加滤
提取及精制 成品检验 成品包装 提取阶段
青霉素培养基优化
培养基优化的基本原理
• 一个批发酵(流加发酵):可以分为生长期和产物形 成期两个阶段。 • 第一阶段:控制菌体的生长,目的是使长好的菌体能 够处于最佳的产物合成状态,即如何控制有利于微 生物催化产物合成所需酶系的形成.。 • 第二阶段:控制产物的合成;找出影响反应速度变化 的主要因素并加以控制使产物的形成速度处于最 佳或底物的消耗最经济。