阿维菌素的发酵

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阿维菌素的发酵

一、实验目的

学习阿维菌素的发酵过程

二、实验原理

阿维菌素的发酵共分三大工序:菌种、发酵、提取。配合三个工序进行分析化验和有关产物测定。

衡量抗生素发酵液中抗菌物质的含量称效价。抗生素效价测定可采用化学法或生物效价测定法。本实验采用高效液相色谱法测定抗生素的效价。

三、实验材料

1. 菌株阿维菌素链霉菌斜面菌种。

2. 培养基培养阿维菌素链霉菌所用的斜面培养基、分离培养基、种子培养基、发酵培养基。见附录Ⅲ。

3. 仪器及药品接种环,培养皿,三角瓶,摇床,离心管,高效液相色谱柱,漩涡振荡器,微孔滤膜,淀粉酶,丙酮,乙酸乙酯,无菌水。

四、实验方法

1. 实验用菌种的制备

(1)单孢子悬液的制备

向阿维菌素链霉菌孢子斜面中加入10mL无菌水,用接种环刮取孢子,震荡打碎,过滤得到单孢子悬液。

(2)自然分离

将得到的单孢子悬液稀释,分别涂布于含有分离培养基的平皿中,在28℃条件下培养7~9天。

2. 发酵培养基和待检测发酵液样品的制备

(1)水解淀粉的制备

称取玉米淀粉200g,先加入少量水混合均匀,加热使其糊化,降温至60℃,然后在糊化

的淀粉液中加入的淀粉酶,恒温搅拌10min,最后加热至沸腾状态,保温5min,使残留的淀粉酶失活,降温待用。

(2)液体发酵

铲取面积为×㎝2大小的斜面培养物,将其接种至种子瓶的培养基中,28℃摇床培养22h 后,按发酵摇瓶装料体积的5%接种至发酵瓶中,28℃培养9天。

(3)检测发酵液中阿维菌素样品的制备

取5mL摇瓶发酵液于离心管中,3000r/m离心10min,弃去上清夜。在发酵液的沉淀物(菌丝体)中加入2mL丙酮,在漩涡式混合器上震荡1min,静置10min,如此重复3次。然后加入3mL乙酸乙酯,震荡1min,静置10min,3000r/m离心10min,最后小心地吸取其中的上清夜作为样品,待检测。

3. 阿维菌素含量的测定

利用高效液相色谱法(HPLC)检测

(1)HPLC条件

色谱柱:Kromasil C18 5μm 200×

流动相: CH2OH∶H2O﹦88∶12(V/V)

流速:min

检测波长:244nm

(2)标准曲线的测定

配制一系列不同浓度的阿维菌素B1标准溶液(500~3000μg/mL),分别取各浓度标准溶液的过滤液5μL注入高效液相色谱仪中,测定其吸收峰值面积,然后对浓度(Y)和吸收峰面积(X)进行一元线性回归,得到一元线性回归方程。

(3)效价的计算方法

将乙酸乙酯萃取所得的上清夜用μm的微孔滤膜过滤,准确吸取滤液5μl注入HPLC中,记录色普图,将B1峰面积代入上述的回归方程中,计算得到发酵液中B1组分发酵单位(μg/mL)。

4. 发酵液中菌体浓度的计算

取体积为V1(mL)的发酵液,3000r/m离心10min后,得到上清夜的体积计量为,V2(mL),

那么发酵液的菌体浓度为:

菌体浓度=[(V1-V2)/ V1]×100%

五、实验报告

绘制标准曲线,并记录实验结果。

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