α-淀粉酶的生产工艺设计

α-淀粉酶的发酵生产工艺摘要：α-淀粉酶广泛分布于动物、植物和微生物中，能水解淀粉产生糊精、麦芽糖、低聚糖和葡萄糖等，是工业生产中应用最为广泛的酶制剂之一。

目前，α-淀粉酶已广泛应用于变性淀粉及淀粉糖、焙烤工业、啤酒酿造、酒精工业、发酵以及纺织等许多行业。

1.菌种的选育1. 1 细菌的分离与初步鉴定：将土壤系列稀释，把10-3 、10-4、10-5分别涂布到淀粉培养基上，27℃倒置培养2天，将长出的菌落接入斜面。

将细菌从斜面接种到淀粉培养基培养2天，用碘液染色，记录透明圈大小和菌落直径，计算D/d值。

保菌供下次实验用。

1．2 紫外线诱变育种：取活化后的菌种配成菌悬液、稀释；倒淀粉培养基平板，将菌悬液涂布其表面；用紫外线处理平板0、2min、4min、6min、8min、10min，每个处理2次重复；放到黑暗中倒置培养，37℃培养48h，分别计数诱变组和对照组平板上的菌落数，并计算致死率；加入碘液，分别测量诱变组和对照组菌落的透明圈直径和菌落直径，计算D/d值；将D/d值最大的菌种保存到斜面培养基上。

1.3 诱变方法以及变异菌株的筛选①诱变出发菌株在完全培养基中培养至对数生长期后期。

②以NTG为诱变剂，按一定处理剂量(μg/ml)，在一定pH值的缓冲液中30℃恒温振荡处理1~4 h。

③经高速离心分离，移植于液体完全培养基进行后培养。

④经稀释涂布在含有1%淀粉BY固体培养基上，经24 h培养形成小菌落。

⑤把单菌落分别移植于含2%淀粉BY液体培养基中，30℃培养36 h。

⑥用2#定性滤纸制成5 mm disc(小圆纸片)，并用2%琼脂BY培养基灭菌后加入较大剂量青霉素(抑菌)。

倒入200 mm×300mm长方形不锈钢玻璃培养皿中，冷却凝固。

然后把5 mm disc 纸顺序放在培养基表面。

⑦用微量注射器分别吸取培养液，移植到相应的disc上。

把disc培养皿经37℃，24h分别培养。

⑧把KI-I2液用喷雾器均匀分布在disc培养皿培养基的表面上，并挑出淀粉水解圈大的disc，用相对应的1 ml培养液接种摇瓶，进行发酵测定酶活力。

把各种斜面菌株经活化培养，接种于1%淀粉培养基的三角瓶中，进行摇瓶比较实验。

将菌株作逐一对比，从中筛选出酶活较高的产酶菌株。

经菌种诱变选育α-淀粉酶高产菌株为诱变的出发菌株，经NTG反复多次处理，并经淀粉水解圈初筛和摇瓶复筛，来选育α-淀粉酶高产菌株。

经NTG反复多次处理，α-淀粉酶活力有较大幅度提高。

在经5次NTG处理之后，其变异株α-淀粉酶活达到34 200 (U/ml)，较出发菌株提高了4.2倍以上，说明该诱变处理及选育方法是行之有效的。

经NTG处理所得的变异菌株的产酶稳定性较差,必须经反复多次单菌落分离和摇瓶比较，逐渐筛选出产酶稳定性好的菌株。

2 培养基的优化配制2.1培养基的制作（1）培养基的类型培养基的种类很多，可以根据组成、状态和用途等进行分类，按照用途可以分成孢子培养基，种子培养基和发酵培养基。

微生物大规模发酵设计主要用到孢子,种子和发酵培养基这三种类型。

（2）孢子培养基孢子培养基配制的目的是供菌体繁殖孢子的，常采用的是固体培养基，对这类培养基的要能使菌体生长快速，产生数量多而优质的孢子，并且不会引起菌体变异。

对孢子培养基的要求：①营养不要太丰富；②所用无机盐的浓度要适量；③注意培养基的pH和湿度。

α-淀粉酶的孢子培养基配置如下：将麸皮5％、豆饼粉3％、蛋白胨0.25%、琼脂2%（pH 7.1）制成斜面培养基，在0.1MPa蒸汽灭菌20 min 。

（3）种子培养基种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长得粗壮成为活力强的种子。

对于种子培养基的营养要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也比较高些，浓度以稀薄为好，可以达到较高的溶解氧，供大量菌体生长和繁殖。

α-淀粉酶的种子培养基的配置：将豆饼1%、蛋白胨和酵母膏各0.4%、氯化钠0.05%配置成种子培养基(pH 7.1～7.2)，在0.1MPa蒸汽灭菌20 min。

（4）发酵培养基发酵培养基的要营养要适当丰富和完全适合于菌种的生理特性和要求，使菌种迅速生长、健壮，能在比较短的周期充分发挥产生菌合成发酵产物的能力，但要注意成本和能耗。

α-淀粉酶的发酵培养基配方是：麸皮70％、小米糠20％、木薯粉10%、烧碱0.5%，加水使水量达60％，常压蒸汽灭菌1h.本发酵属于一级种子罐扩大培养，二级发酵。

设计流程如下：孢子→锥形瓶→种子罐→发酵罐（1）孢子制备将保存在淀粉琼脂斜面上的枯草芽孢杆菌孢子用无菌水洗下，接种到锥形瓶中，在35℃静置培养2～4天，待长出大量孢子后作为接种用的种子。

(2)种子制备将保藏的菌种接种到马铃薯茄子瓶斜面（20%马铃薯煎出汁加MgSO4·7H2O 5 mg/L，琼脂2%，pH 6.7～7.0），37℃培养3天。

然后接入到20L种子罐，37℃搅拌，通风培养12～14小时。

此时菌种进入对数生长期（镜检细胞密集，粗壮整齐，大多数细胞单独存在，少数呈链状，发酵液pH 6.3～6.8,酶活5～10U/mL），再接种到发酵罐。

(3)发酵罐培养培养基的配制：用麦芽糖液配置成含麦芽糖6％、豆粕水解液6％～7％、Na2HPO4·12H2O0.8％、(NH4)2SO4 0.4％、CaCl2 0.2％、NH4Cl0.15％、豆油1kg、深井水20L，调pH至6.5～7.0。

发酵罐培养基经消毒灭菌冷却后接入3%～5%种子培养成熟液。

培养条件为：温度37±1℃，罐压0.5kg／cm2，风量1～20h 为1：0.48vvm，20 h后1：0.67vvm，培养时间为28～36 h。

2.2 耐高温α-淀粉酶的生产方法耐高温α－淀粉酶生产工艺，采用地衣芽孢杆菌为菌株，通过一级种子罐发酵、大罐发酵、过滤、成品处理制得。

2.2.1 耐高温α-淀粉酶的生产原料有采用地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）1.5吨种子罐发酵，玉米淀粉6%~10%，玉米浆1%~3%，豆粕2%~5%，磷酸二氢钾0.3%~0.6%，磷酸氢二钾0.5%~2%，柠檬酸钠0.1%~0.3%，35吨发酵罐发酵, 玉米淀粉15%~30%，玉米粉5%~10%，豆粕1%~8%，玉米浆2%~5%，磷酸二氢钾0.1%~0.8%，磷酸氢二钾0.8%~2%，柠檬酸钠0.05%~0.4%等。

2.2.2 耐高温α－淀粉酶培养基制作（1）选取菌种：采用地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis)。

（2）1.5吨种子罐发酵，培养基配方：玉米淀粉6%~10%，玉米浆1%~3%，豆粕2%~5%，磷酸二氢钾0.3%~0.6%，磷酸氢二钾0.5%~2%，柠檬酸钠0.1%~0.3%，余量为水，各组分以重量百分比计；加高温淀粉酶液化，消后pH6.2-6.5；用茄子瓶接入种母，温度37±1℃，通风量25-40m/h，pH值6.4，培养时间24-36小时。

（3）35吨发酵罐发酵，培养基配方：玉米淀粉15%~30%，玉米粉5%~10%，豆粕1%~8%，玉米浆2%~5%，磷酸二氢钾0.1%~0.8%，磷酸氢二钾0.8%~2%，柠檬酸钠0.05%~0.4%，余量为水，各组分以重量百分比计；加高温淀粉酶液化，pH6.2-6.4；温度42±1℃，风量400-1000m/h，pH值6.4-6.8，培养时间80-100小时；在上述条件下补料分批发酵：以淀粉浓度为150~280g/L 为发酵初糖浓度，以质量百分比40%~70%的淀粉糖溶液作为发酵补料物，在DE值降至10~60mg/ml时以阀门开启程度的大小为依据开始持续流加补料，维持发酵液中DE值约为10~60mg/ml，控制总糖浓度达到220~320g/L时停止补料。

（4）提取浓缩工艺：经絮凝、压滤，二次过滤后，采用超滤膜浓缩，保持料液浓缩过程中温度20℃－－45℃；最后采用精滤板框过滤机，配合硅藻土预涂工艺进行过滤除菌，最终生产出成品。

2.2.3耐高温α-淀粉酶的另一种生产方法向成熟的发酵液中加入占发酵液重量1％-3％的钙离子保护剂或2％-5％淀粉中的至少一种，在70-90℃的条件下，进行热处理。

将制得的纯化的耐高温。

淀粉酶送至压力喷雾塔进行喷雾干燥，制得酶粉，将酶粉调配后，分装即得成品。

该耐高温。

淀粉酶呈固体状态，酶活力达2万单位／g以上，具有较高的稳定性，易贮存和运输。

2.2.4用菌种枯草芽孢杆菌T2来提取耐高温α－淀粉酶枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是当今工业酶制剂的主要生产菌种之一，主要用于生产淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等。

本实验利用高产α－淀粉酶的枯草芽孢杆菌T2生产α－淀粉酶。

（一）用此菌种来提取α－淀粉酶的生产原料枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）T2，蛋白胨5g，酵母膏2.5g，葡萄糖0.5g,可溶性淀粉2.5g，KH2PO4 1g，MgSO4.7H2O 0.25g，CaCl2.2H2O 0.1g，H2O 500mL，pH7.0。

（二）此培养基的制备1.培养基的制备与灭菌发酵培养基：蛋白胨5g，酵母膏2.5g，葡萄糖0.5g,可溶性淀粉2.5g，KH2PO4 1g，MgSO4.7H2O 0.25g，CaCl2.2H2O 0.1g，H2O 500mL，pH7.0。

分装于100mL锥形瓶中，每瓶50mL，121℃灭菌20min。

2.接种与产酶培养接种环灼烧灭菌后，轻轻刮取斜面种子培养基中的少量菌体，接入液体培养基中，并使环在液体与管壁接触的部位轻轻摩擦，使菌体分散于液体中。

37℃振荡培养48 h。

3.离心将发酵液置高速冷冻离心机中10000r/min离心10 min，除菌体，上清液即为α－淀粉酶粗酶液。

2.3 a一淀粉酶发酵培养基优化2．3．1不同碳源对发酵产酶的影响单独选择面粉、大米粉、糊精、淀粉、荞麦、高粱粉、玉米淀粉、蔗糖、葡萄糖作为碳源，替代基础发酵培养基中的玉米粉，其余培养基成分和发酵条件不变。

测定酶活结果，由图1可见，面粉、大米粉、淀粉、荞麦作为碳源时，都有利于米曲霉产酶，而高粱粉、玉米淀粉、蔗糖、葡萄糖对产酶的促进作用较低。

其中面粉对产酶的促进作用最大，因此选择面粉作为最佳唯一碳源。

2．3．2不同有机氮源对发酵产酶的影响在以面粉为唯一的碳源的条件下，选择玉米浆、蛋白胨、酵母膏、尿素、牛肉膏代替黄豆饼粉作为有机氮源，其余条件不变。

测定酶活结果由图2可看出，牛肉膏作为有机氮源有利于米曲霉产酶，而玉米浆、蛋白胨、酵母膏、尿素作为有机氮源时，对产酶的促进作用较低。

从工业生产的角度，牛肉膏的成本太高，产酶促进作用只较黄豆饼粉作为有机氮源的高一些，因此选择黄豆饼粉作为有机氮源。