高效液相色谱 ppt课件
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液相色谱法ppt课件
二、液相色谱分离原理及分类 和气相色谱一样，液相色谱分离系统也由两相——固定
相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键 合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树 脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动 相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的 吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异 进行分离。色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶
分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。 极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性
吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化
21
第四节 液—固色谱法
镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。 碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等。
各种吸附剂中，最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝。
5
第一节 概 述
等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可 能的。
③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般 有利于色谱分离条件的选择。 （3）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质 在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而 在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。 （4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易， 而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺 乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应 用中，这两种色谱技术是互相补充的。
所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用 了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可 达4.9107Pa）;谱（每米塔板数可达几 万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流
1
第一节 概 述
出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、 分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、 高效或现代液相色谱法。
相和流动相组成。液相色谱的固定相可以是吸附剂、化学键 合固定相（或在惰性载体表面涂上一层液膜）、离子交换树 脂或多孔性凝胶；流动相是各种溶剂。被分离混合物由流动 相液体推动进入色谱柱。根据各组分在固定相及流动相中的 吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异 进行分离。色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶
分子筛及聚酰胺等。非极性吸附剂最常见的是活性炭。 极性吸附剂可进一步分为酸性吸附剂和碱性吸附剂。酸性
吸附剂包括硅胶和硅酸镁等，碱性吸附剂有氧化铝、氧化
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第四节 液—固色谱法
镁和聚酰胺等。酸性吸附剂适于分离碱，如脂肪胺和芳香胺。 碱性吸附剂则适于分离酸性溶质，如酚、羧和吡咯衍生物等。
各种吸附剂中，最常用的吸附剂是硅胶，其次是氧化铝。
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第一节 概 述
等，作为分析时选择余地大；而气相色谱并不可 能的。
③ 液相色谱通常在室温下操作，较低的温度，一般 有利于色谱分离条件的选择。 （3）由于液体的扩散性比气体的小105倍，因此，溶质 在液相中的传质速率慢，柱外效应就显得特别重要；而 在气相色谱中，柱外区域扩张可以忽略不计。 （4）液相色谱中制备样品简单，回收样品也比较容易， 而且回收是定量的，适合于大量制备。但液相色谱尚缺 乏通用的检测器，仪器比较复杂，价格昂贵。在实际应 用中，这两种色谱技术是互相补充的。
所用的固定相柱效低，分析周期长。而现代液相色谱法引用 了气相色谱的理论，流动相改为高压输送（最高输送压力可 达4.9107Pa）;谱（每米塔板数可达几 万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流
1
第一节 概 述
出物进行连续检测。因此，高效液相色谱具有分析速度快、 分离效能高、自动化等特点。所以人们称它为高压、高速、 高效或现代液相色谱法。
《高效液相》课件
蛋白质分离与纯化
蛋白质分离
高效液相色谱技术可以用于蛋白质的分离和纯化，通过不 同的分离模式和固定相选择，实现对蛋白质的快速分离和 纯化。
蛋白质性质分析
通过高效液相色谱技术可以对蛋白质的性质进行分析，如 蛋白质的分子量、等电点等，为蛋白质的结构和功能研究 提供有力支持。
蛋白质相互作用研究
高效液相色谱技术可以用于研究蛋白质之间的相互作用， 如蛋白质与配体、抑制剂等之间的相互作用，有助于深入 了解蛋白质的功能和作用机制。
原理
利用不同物质在固定相和流动相之间 的分配系数差异进行分离，通过检测 器进行检测，收集各个组分，达到分 析样品组分的目的。
发展历程
01
02
03
04
起源
20世纪初，俄国植物学家茨 维特发明了色谱法。
1940年代
气相色谱法（GC）出现，并 逐渐发展成熟。
1960年代
高效液相色谱法（HPLC）开 始发展，并逐渐取代气相色谱
02
高效液相色谱仪
仪器组成
进样器
将样品注入色谱柱，是 色谱仪的重要部件之一
。
色谱柱
用于分离样品中的各组 分，由固定相和流动相
组成。
检测器
检测色谱柱流出的组分 ，并将其转换为电信号
。
数据处理系统
用于采集、处理和显示 检测器输出的信号。
重要部件介绍
01
02
03
色谱柱填料
常用的填料有硅胶、氧化 铝、活性炭等，根据不同 分离需求选择合适的填料 。
《高效液相》ppt课件
目录
• 高效液相色谱法简介 • 高效液相色谱仪 • 高效液相色谱分离技术 • 高效液相色谱在生物医药领域的应用 • 高效液相色谱实验技术 • 高效液相色谱技术前沿与展望
高效液相色谱-HPLCppt课件.ppt
色谱法的分类
按固定相的形态分:
平面色谱 o 纸色谱
o 薄层色谱
柱色谱
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法的分类示意图
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪ 高压梯度洗脱（高压混合，高压进柱，2个 泵。）
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
▪安捷伦泵：小视频 ▪色谱学堂：泵
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
色谱法原理及分类
什么是色谱法 色谱法溯源 Tswett（茨维特)的实验 色谱法原理 色谱法的分类
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
什么是色谱法
色谱法是一种现代的分离分析方法 1906年正式命名(见诸文献) 20世纪30年代开始广泛研究和应用 高效液相色谱法的广泛应用始于20世纪70年代
1. 紫外—可见光度检测器：
①固定波长：254nm ， 低压汞 灯。
② 可 调 波 长 ： 190 ～ 800mm ， 钨灯，氘灯。
UV
③光电二极管矩阵检测器： 190～700nm。
接色谱柱 石英窗 光电倍增管
废液
▪篮球比赛是根据运动队在规定的比赛 时间里 得分多 少来决 定胜负 的，因 此，篮 球比赛 的计时 计分系 统是一 种得分 类型的 系统
waters-e高效液相色谱ppt课件
4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用甲醇水溶液冲洗。 5.长时间不用仪器，应该将柱子取下用堵头封好保存，注意不能用纯水冲洗及
保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水极性太强且易长霉。 。 6.开机时，流速和柱压要逐渐增加。 7.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
流动相流出检测器可被送至废液瓶，或按需被收集。 当流动相含有一个分开的化合物谱带，高效液相色谱可以收集含有纯
化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。
注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形 成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。
高 检将效测电器信液连号相接转计换色算为谱机色数谱如据图站 ，何在，工显高示效作屏液上相展色现谱出系来统。单元先记录电信号，再
液相色谱的基本流程图
流动相
进样阀 泵
色谱柱
泵输液 进样
分离
检测器
检测
AB C
DE
G
F
记录
液 液相相流色色动谱谱相实：的验种所类各需及的部配基比分本，参示等数度-意-或亦梯图称度色谱条件
固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量
四元梯度洗脱的溶剂输送动进样系统 柱温箱 液晶显示器 内置的柱塞杆密封垫清洗系统 溶剂瓶托盘 键盘用户界面及软盘驱动器
打开电源至on位置，开机依次接通 2695 分离单元、检测
2器开、机计算机和打印机的电源。接通后，约 20s 仪器开始自
检，约 1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化。
溶 流【剂动M管相en理脱u/气系St确a统tu认s的所】有，准溶进备剂入管“路St都at充us满（溶1 剂），”按屏幕
保存柱子，而应该用有机相(如甲醇等)，因为纯水极性太强且易长霉。 。 6.开机时，流速和柱压要逐渐增加。 7.要注意柱子的PH值范围，不得注射强酸强碱的样品，特别是碱性样品。
流动相流出检测器可被送至废液瓶，或按需被收集。 当流动相含有一个分开的化合物谱带，高效液相色谱可以收集含有纯
化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。
注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形 成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。
高 检将效测电器信液连号相接转计换色算为谱机色数谱如据图站 ，何在，工显高示效作屏液上相展色现谱出系来统。单元先记录电信号，再
液相色谱的基本流程图
流动相
进样阀 泵
色谱柱
泵输液 进样
分离
检测器
检测
AB C
DE
G
F
记录
液 液相相流色色动谱谱相实：的验种所类各需及的部配基比分本，参示等数度-意-或亦梯图称度色谱条件
固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量
四元梯度洗脱的溶剂输送动进样系统 柱温箱 液晶显示器 内置的柱塞杆密封垫清洗系统 溶剂瓶托盘 键盘用户界面及软盘驱动器
打开电源至on位置，开机依次接通 2695 分离单元、检测
2器开、机计算机和打印机的电源。接通后，约 20s 仪器开始自
检，约 1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化。
溶 流【剂动M管相en理脱u/气系St确a统tu认s的所】有，准溶进备剂入管“路St都at充us满（溶1 剂），”按屏幕
高效液相色谱分析(主要分离类型与原理)课件
高效液相色谱分析(主要 分离类型与原理)课件
• 高效液相色谱分析简介 • 高效液相色谱的主要分离类型 • 高效液相色谱的分离原理 • 高效液相色谱分析实验操作与注意事项 • 高效液相色谱分析的应用实例
目录
Part
01
高效液相色谱分析简介
高效液相色谱分析的定义
高效液相色谱分析（HPLC）是一种分离和检测复杂样品中各种组分的方法。它利用不同 物质在固定相和流动相之间的分配平衡来实现分离。
THANKS
感谢您的观看
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Part
03
高效液相色谱的分离原理
高效液相色谱的固定相与流动相
固定相
是色谱柱中的填充物，用于吸附 和固定样品中的组分。常见的固 定相包括硅胶、氧化铝、活性炭 等。
流动相
是携带样品通过色谱柱的液体或 气体，与固定相相互作用，使各 组分得以分离。
高效液相色谱的分离过程
样品在流动相中溶解并被 带入色谱柱。
实验操作前的准备
实验器材与试剂准备
确保所需的色谱柱、检测器、流动相 、样品等都已准备好，并确保试剂的 质量和纯度。
实验条件设定
仪器校准与维护
确保色谱仪器的准确性和稳定性，进 行必要的校准和日常维护。
根据实验需求，设定合适的流动相比 例、流速、检测波长等参数。
实验操作步骤与要点
样品处理
根据实验要求，对样品进 1
Part
02
高效液相色谱的主要分离类型
吸附色谱
STEP 01
原理
STEP 02
应用
利用固定相吸附剂对不同 组分的吸附能力差异实现 分离。
STEP 03
特点
固定相的吸附能力可以通 过改变流动相的组成进行 调节。
• 高效液相色谱分析简介 • 高效液相色谱的主要分离类型 • 高效液相色谱的分离原理 • 高效液相色谱分析实验操作与注意事项 • 高效液相色谱分析的应用实例
目录
Part
01
高效液相色谱分析简介
高效液相色谱分析的定义
高效液相色谱分析（HPLC）是一种分离和检测复杂样品中各种组分的方法。它利用不同 物质在固定相和流动相之间的分配平衡来实现分离。
THANKS
感谢您的观看
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Part
03
高效液相色谱的分离原理
高效液相色谱的固定相与流动相
固定相
是色谱柱中的填充物，用于吸附 和固定样品中的组分。常见的固 定相包括硅胶、氧化铝、活性炭 等。
流动相
是携带样品通过色谱柱的液体或 气体，与固定相相互作用，使各 组分得以分离。
高效液相色谱的分离过程
样品在流动相中溶解并被 带入色谱柱。
实验操作前的准备
实验器材与试剂准备
确保所需的色谱柱、检测器、流动相 、样品等都已准备好，并确保试剂的 质量和纯度。
实验条件设定
仪器校准与维护
确保色谱仪器的准确性和稳定性，进 行必要的校准和日常维护。
根据实验需求，设定合适的流动相比 例、流速、检测波长等参数。
实验操作步骤与要点
样品处理
根据实验要求，对样品进 1
Part
02
高效液相色谱的主要分离类型
吸附色谱
STEP 01
原理
STEP 02
应用
利用固定相吸附剂对不同 组分的吸附能力差异实现 分离。
STEP 03
特点
固定相的吸附能力可以通 过改变流动相的组成进行 调节。
高效液相色谱分析(影响分离的因素与操作条件的选择)PPT课件可修改文字
超载，分离切分使待分离组分成 为主成分（富集）后，再次分离 制备。
02:06:45
3. 制备型液相色谱
制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进 样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。
制备柱：内径20～50mm，柱长50cm。
02:06:45
请选择内容
第一节 高效液相色谱的特点与仪器
feature and instrument of HPLC
气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其 选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱 的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。
02:06:45
二、分离类型选择
choice of separation types
02:06:45
三、 HPLC的应用
application of HPLC
二、分离类型的选择
choice of separation types
三、液相色谱的应用
application of HPLC
四、液相制备色谱
preparative liquid chromatography
02:06:45
一、影响分离的因素
factors influenced separation
1.色谱柱的柱容量（柱负荷）
对分析柱：不影响柱效时的最大进样量； 对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量； 超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。
超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降 低10%为宜。
02:06:45
2. 液相制备色谱的方法
收集组分时，通常有以下情况： （1）可获得良好分离，主峰 使用制备柱，超载提高效率； （2）两主成分之间的小组分；
02:06:45
3. 制备型液相色谱
制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进 样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。
制备柱：内径20～50mm，柱长50cm。
02:06:45
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第一节 高效液相色谱的特点与仪器
feature and instrument of HPLC
气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其 选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱 的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。
02:06:45
二、分离类型选择
choice of separation types
02:06:45
三、 HPLC的应用
application of HPLC
二、分离类型的选择
choice of separation types
三、液相色谱的应用
application of HPLC
四、液相制备色谱
preparative liquid chromatography
02:06:45
一、影响分离的因素
factors influenced separation
1.色谱柱的柱容量（柱负荷）
对分析柱：不影响柱效时的最大进样量； 对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量； 超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。
超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降 低10%为宜。
02:06:45
2. 液相制备色谱的方法
收集组分时，通常有以下情况： （1）可获得良好分离，主峰 使用制备柱，超载提高效率； （2）两主成分之间的小组分；
高效液相色谱法教学精【全】ppt课件
§1-3 色谱柱的分离效率
一、塔板理论 塔板理论认为: 一根柱子可以分为n
段，每段内组分在两相间迅速达到平衡， 把每一段称为一块理论塔板。
设柱长为L，理论塔板高度为H，则
H=L/Ｎ
Ｎ为理论塔板数。
理论塔板数一N
①色谱峰对称 ： N 16(tR )2
说明：
tW
a. 在给定的操作条件下，N几乎相同
三、高效液相色谱法的特点
高压: 以液体作为流动相，液体流经色谱柱时，
受到阻力较大 必须对流动相施加高压。 一般可达到150～300kg／cm2， 甚至可达700kg／cm2以上。
高速:
分析时间较经典液相色谱少得多（交 换速度快），一个复杂样品的分析仅需几 分钟到几十分钟。
高效:
气相色谱的分离效能很高，高效液相 色谱的柱效则更高（化学键合相），一般 约可达 6000理论塔板／米
②一定色谱条件下，对k’有差异的组
分，则柱效愈高，分离效果愈好。
塔板理论的特点和不足：
(1)当L一定时，N 越大(H 越小)，被测组
分在柱内被分配的次数越多，柱效越 高，所得色谱峰越窄。 (2)柱效不能表示被分离组分的实际分离
效果：如两组分的分配系数K 相同，
无论该色谱柱的柱效多大，都无法 分离。
① 柱效较高，ΔK(分配系数)较大，完全分离。 ② ΔK 不是很大，柱效较高，峰较窄，基本分离。 ③ 柱效较低，ΔK 较大，但分离的不好。 ④ ΔK 小，柱效低，分离效果更差。
一．分离度的数学表达式：
Rs
2(tR 2 tR1 ) W2 W1
2(tR 2 tR1 )
1.699 [Y1/ 2(2) Y1/ 2(1) ]
于世林编著)
第一章 高效液相色谱法基本原理 §1－1 概述 一、色谱法
高效液相色谱仪使用与操作规程(学生用PPT培训课件
高效液相色谱仪使用与操作 规程(学生用ppt培训课件
目录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的安装与调试 • 高效液相色谱仪的使用步骤 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 安全注意事项 • 高效液相色谱仪的发展趋势与展
望
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分 析复杂混合物中各组分的仪器， 广泛应用于化学、制药、食品、 环保等领域。
检测器技术升级
发展高灵敏度、高稳定性和高可 靠性的检测器，提高检测精度和
可靠性。
应用领域拓展
新药研发
高效液相色谱技术在药物分析、药物代谢和药物 动力学等领域发挥重要作用。
环境监测
用于检测水体、土壤和空气中的污染物和有害物 质，为环境保护提供有力支持。
食品安全
用于检测食品中的农药残留、添加剂、毒素等有 害物质，保障食品安全。
确保实验室环境干燥、 清洁，避免仪器受潮 或落尘。
操作时应避免剧烈振 动仪器，以防损坏内 部组件。
仪器安全
定期检查仪器管路是否漏液，若 有漏液应及时处理。
仪器应放置在通风橱内，以防气 体泄漏对实验人员造成危害。
仪器使用完毕后应关闭所有电源， 并按照仪器说明书进行保养。
数据安全与保密
操作过程中避免无关人员靠近 仪器，以防误操作导致数据丢 失或损坏。
仪器保养与校正
01
02
03
04
定期对仪器进行全面检查，包 括泵、进样阀、色谱柱和检测
器等部件。
根据仪器使用情况，适时清洗 或更换泵内滤网、色谱柱和检
测器。
按照厂家推荐，使用专用工具 和材料进行保养和校正。
定期对仪器进行性能验证，确 保其准确性和可靠性。
目录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的安装与调试 • 高效液相色谱仪的使用步骤 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 安全注意事项 • 高效液相色谱仪的发展趋势与展
望
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分 析复杂混合物中各组分的仪器， 广泛应用于化学、制药、食品、 环保等领域。
检测器技术升级
发展高灵敏度、高稳定性和高可 靠性的检测器，提高检测精度和
可靠性。
应用领域拓展
新药研发
高效液相色谱技术在药物分析、药物代谢和药物 动力学等领域发挥重要作用。
环境监测
用于检测水体、土壤和空气中的污染物和有害物 质，为环境保护提供有力支持。
食品安全
用于检测食品中的农药残留、添加剂、毒素等有 害物质，保障食品安全。
确保实验室环境干燥、 清洁，避免仪器受潮 或落尘。
操作时应避免剧烈振 动仪器，以防损坏内 部组件。
仪器安全
定期检查仪器管路是否漏液，若 有漏液应及时处理。
仪器应放置在通风橱内，以防气 体泄漏对实验人员造成危害。
仪器使用完毕后应关闭所有电源， 并按照仪器说明书进行保养。
数据安全与保密
操作过程中避免无关人员靠近 仪器，以防误操作导致数据丢 失或损坏。
仪器保养与校正
01
02
03
04
定期对仪器进行全面检查，包 括泵、进样阀、色谱柱和检测
器等部件。
根据仪器使用情况，适时清洗 或更换泵内滤网、色谱柱和检
测器。
按照厂家推荐，使用专用工具 和材料进行保养和校正。
定期对仪器进行性能验证，确 保其准确性和可靠性。
《高效液相色谱仪》课件
《高效液相色谱仪》ppt课件
目 录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的组成和工作原理 • 高效液相色谱仪的操作流程 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 高效液相色谱仪的实验技术与应用实例
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分 析复杂混合物中各组分的仪器， 基于物质在固定相和流动相之间 的分配差异实现分离。
。
食品工业
用于检测食品中的添加剂、农 药残留和营养成分等。
高效液相色谱仪的发展历程
起源
20世纪50年代初，基于经典液 相柱色谱的原理，开发出了高
效液相色谱法。
发展
20世纪60年代，出现了填充柱 和柱切换技术，提高了分离效 率。
革新
20世纪70年代，出现了高效微 粒固定相和新型检测器，提高 了灵敏度和选择性。
流动相的纯化和过滤
确保流动相的纯度和清洁度，以避免对色谱柱和检测器造成污染。
流动相的脱气
使用真空脱气法或超声波脱气法去除流动相中的气泡，以避免对色 谱分离造成干扰。
色谱柱的安装与选择
安装色谱柱
按照仪器说明书正确安装色谱柱 ，确保密封性和稳定性。
色谱柱的选择
根据样品的性质和分离要求，选择 合适的色谱柱类型和规格。
检测器对流出的组分进行 检测，并将信号记录下来 ，形成色谱图。
高效液相色谱仪的分离原理
分配原理
组分在固定相和流动相之 间的分配平衡是实现物质 分离的基础。
吸附与解吸平衡
组分在固定相上的吸附与 流动相中的溶解度差异导 致分离。
分子间作用力
分子间的相互作用力（如 范德华力、氢键等）影响 组分的吸附与解吸平衡。
物的分子结构和化学键信息。
目 录
• 高效液相色谱仪简介 • 高效液相色谱仪的组成和工作原理 • 高效液相色谱仪的操作流程 • 高效液相色谱仪的维护与保养 • 高效液相色谱仪的实验技术与应用实例
01
高效液相色谱仪简介
定义与特点
定义
高效液相色谱仪是一种分离和分 析复杂混合物中各组分的仪器， 基于物质在固定相和流动相之间 的分配差异实现分离。
。
食品工业
用于检测食品中的添加剂、农 药残留和营养成分等。
高效液相色谱仪的发展历程
起源
20世纪50年代初，基于经典液 相柱色谱的原理，开发出了高
效液相色谱法。
发展
20世纪60年代，出现了填充柱 和柱切换技术，提高了分离效 率。
革新
20世纪70年代，出现了高效微 粒固定相和新型检测器，提高 了灵敏度和选择性。
流动相的纯化和过滤
确保流动相的纯度和清洁度，以避免对色谱柱和检测器造成污染。
流动相的脱气
使用真空脱气法或超声波脱气法去除流动相中的气泡，以避免对色 谱分离造成干扰。
色谱柱的安装与选择
安装色谱柱
按照仪器说明书正确安装色谱柱 ，确保密封性和稳定性。
色谱柱的选择
根据样品的性质和分离要求，选择 合适的色谱柱类型和规格。
检测器对流出的组分进行 检测，并将信号记录下来 ，形成色谱图。
高效液相色谱仪的分离原理
分配原理
组分在固定相和流动相之 间的分配平衡是实现物质 分离的基础。
吸附与解吸平衡
组分在固定相上的吸附与 流动相中的溶解度差异导 致分离。
分子间作用力
分子间的相互作用力（如 范德华力、氢键等）影响 组分的吸附与解吸平衡。
物的分子结构和化学键信息。
仪器分析― 高效液相色谱法PPT课件
填充的固定相颗粒直径多在150~200m范围内。即使这样，
流速仍然很低(<1mL/min)，分析时间仍然很长！ 当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，
但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。
4
• 为了解决分析时间及柱效问题，人们认识 到：最为有效地增加柱效的唯一方法是减 小填充物的粒径（3~10 m ）！
HPLC仪器包括： 1. 高压输液装置; 2. 进样系统; 3. 分离系统; 4. 检测系统; 5. 此 外 还 配 有 梯 度淋洗、自动进样 和数据处理装置。
其工作过程如图 8-2所示。
图8-2 HPLC仪器工作过程示意图
9
高效液相色谱法 HPLC High Performance Liquid Chromatography
选择原则。
3
8.1 概 述
高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。 按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色谱(液固色 谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱)。此外， 还有亲和色谱、平板色谱(薄层色谱)等。
早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1~5cm, 长50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，
• 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
• 结论：从色谱分析的发展来看，HPLC比GC更为有
用、更具发展前途！
7
3. 应用 由于HPLC分离分析的高
灵敏度、定量的准确性、适 于非挥发性和热不稳定组分 的分析，因此，在工业、科 学研究，尤其是在生物学和
不溶于水 非极性
极性增加 非离子极性
16
高效液相色谱法 HPLC High Performance Liquid Chromatography
流速仍然很低(<1mL/min)，分析时间仍然很长！ 当加压增加流速(真空或空气泵)时，尽管分析时间减少，
但柱塔板高度Hmin也相应增加了！或者说柱效下降了。
4
• 为了解决分析时间及柱效问题，人们认识 到：最为有效地增加柱效的唯一方法是减 小填充物的粒径（3~10 m ）！
HPLC仪器包括： 1. 高压输液装置; 2. 进样系统; 3. 分离系统; 4. 检测系统; 5. 此 外 还 配 有 梯 度淋洗、自动进样 和数据处理装置。
其工作过程如图 8-2所示。
图8-2 HPLC仪器工作过程示意图
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高效液相色谱法 HPLC High Performance Liquid Chromatography
选择原则。
3
8.1 概 述
高效液相色谱(HPLC)是以溶剂液体为流动相的色谱方法。 按照固定相不同可分为：液液分配色谱；吸附色谱(液固色 谱)；离子交换色谱；尺寸排阻色谱(凝胶渗透色谱)。此外， 还有亲和色谱、平板色谱(薄层色谱)等。
早期液相色谱，包括Tswett的工作，都是在直径1~5cm, 长50~500cm的玻璃柱中进行的。为保证有一定的柱流速，
• 操作温度：GC需高温；HPLC通常在室温下进行。
• 结论：从色谱分析的发展来看，HPLC比GC更为有
用、更具发展前途！
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3. 应用 由于HPLC分离分析的高
灵敏度、定量的准确性、适 于非挥发性和热不稳定组分 的分析，因此，在工业、科 学研究，尤其是在生物学和
不溶于水 非极性
极性增加 非离子极性
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高效液相色谱法 HPLC High Performance Liquid Chromatography
高效液相色谱法培训PPT课件
注意事项与常见问题解答
样品处理注意事项
01
避免样品污染、损失或变质，确保处理过程的准确性和可重复
性。
常见问题及解决方法
02
针对样品处理过程中可能出现的问题，如回收率低、干扰物质
多等，提供相应的解决方法。
安全与防护
03
注意有毒有害试剂的使用安全，做好个人防护和环境保护工作。
04 方法开发与优化策略
梯度洗脱程序设计思路
初始比例确定
根据待测组分的极性差异，选 择合适的初始流动相比例。
梯度斜率设置
根据组分的分离情况，调整梯 度斜率，使各组分在合适的保 留时间内洗脱出来。
梯度时间设置
确保梯度洗脱过程中，各组分 能够充分分离，同时避免过长 的分析时间。
梯度曲线类型
根据实际需求选择合适的梯度 曲线类型，如线性梯度、凹形
梯度或凸形梯度等。
方法验证内容及标准
精密度
准确度
通过添加回收率试验，验证方法 的准确度，确保测定结果可靠。
考察方法的重复性和中间精密度， 确保测定结果的稳定性。
线性范围
确定方法的线性范围，确保待测 组分浓度在该范围内时，测定结 果准确可靠。
专属性
考察方法对待测组分的选择性， 确保其他共存物质不干扰测定。
长期稳定性
考察样品在规定的储存条件下放置一定时间后的稳定性，以确定 样品的保质期和储存条件。
方法学考察
对分析方法本身进行稳定性考察，包括方法的耐用性、重复性和 中间精密度等指标的评估。
质量控制图绘制和应用
质量控制图绘制
根据长期稳定性考察数据，绘制质量控 制图，包括平均值、标准差和控制限等 指标。
VS
发展历程及应用领域
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名 称 恒流或恒压 脉冲 更换流动相 梯度洗脱 再循环 价格 气动放大泵 恒压 无 不方便 需两台泵 不可 高 螺旋传动注射泵 恒流 无 不方便 需两台泵 不可 中等 单活塞往复泵 恒流 有 方便 可 可 较低 双活塞往复泵 恒流 小 方便 可 可 高 隔膜往复泵 恒流 有 方便 可 可 中等
第二节 高效液相色谱仪器 （动画）
4（6）个主要部分： 高压输液系统； 脱气装置； 梯度洗脱； 进样系统； 分离系统； 检测系统； 此外还配有自动进样及数据处理等辅助装置。
第二节 高效液相色谱仪器
第二节 高效液相色谱仪器
1．高压输液系统
由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流 动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输 液系统。
第一节 概 述
1．高效液相色谱法与经典液相色谱法
HPLC优点：高速、高效、高灵敏度、高自动化。
高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。 由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色 谱配备了高压输液设备，流速最高可达 10cm3·min-1.
如分离苯的羟基化合物，7个组分只需1min就可完成。
第一节 概 述
2．HPLC与GC
(1)GC分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它 们仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的 那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主 要采用HPLC进行分离和分析。
(2)GC采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即 不产生相互作用力，仅起运载作用。而HPLC中流动相 可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生 一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因 此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制 和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了 极大方便。
第一节 概 述
(3)GC一般都在较高温度下进行的，而HPLC法则经常可 在室温条件下工作。
总之，HPLC是吸取了GC与经典液相色谱优点， 并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目 前HPLC已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重 大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、 多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分 离和分析。
对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径0.9 cm，流动相速度为30cm3·h-1，需用20多小时才能分离出2 0种氨基酸；而用HPLC，只需lh之内即可完成。
又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采 用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组分.
恒压泵特点：能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱 系统阻力而变化，故保留时间的重视性差。
它们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流 泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应 用最多的是机械往复泵。
第二节 高效液相色谱仪器
输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。机械泵 中又有螺旋传动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵 和往复式隔膜泵。几种输液泵的基本性能见下表。
色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（ 即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的 大小，决定色谱过程的保留行为。
根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱 、液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子 排阻色谱等类型。
第二节 高效液相色谱仪器
第二节 高效液相色谱仪器
一、流程（process of HPLC）
第二节 高效液相色谱仪器
双活塞往复泵的输液 流量比单活塞泵小得多。
HPLC主要缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。
第一节 概 述
3. 液相色谱分离原理及分类
和GC一样，LC分离系统也由固定相和流动相组成。 其固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体 表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动 相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱 柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系 数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进igh Performance Liquid Chromatography，HPLC
第一节 概 述
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代 末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术， 随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广 泛的化学分离分析的重要手段。
它是在经典液相色谱基础上，引入了气相 色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固 定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效 率高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更 好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面 进行比较：
它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高 压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成。
高压输液泵
核心部件。压力：150～350×105 Pa。 应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围 宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。
第二节 高效液相色谱仪器
常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。 恒流泵特点：在一定操作条件下，输出流量保持恒定而 与色谱柱引起阻力变化无关；
第二节 高效液相色谱仪器
双活塞往复泵：
如下图a所示，双活塞往复泵有一个精心设计的偏 心凸轮，用同步电机或变速直流电机驱动偏心凸轮， 偏心凸轮再推动两活塞作往复运动。偏心凸轮短半径 端所对应的活塞向外伸，使该活塞的下单向阀打开吸 入流动相，与此同时，偏心凸轮的长半径端所对应的 另一活塞被推入，使其上单向阀打开，并将流动相送 至色谱柱。于是，两活塞交替伸缩，往复运动，获得 的排液特性如图b所示，即具有稳定的输出流量，这 样就能避免单活塞泵液流脉冲的问题。
首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色 谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时， 流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分 离，然后依先后顺序进入 检测器，记录仪将检测器 送出的信号记录下来，由 此得到液相色谱图。
第二节 高效液相色谱仪器
第二节 高效液相色谱仪器
二、主要部件（main assembly of HPLC）
第二节 高效液相色谱仪器 （动画）
4（6）个主要部分： 高压输液系统； 脱气装置； 梯度洗脱； 进样系统； 分离系统； 检测系统； 此外还配有自动进样及数据处理等辅助装置。
第二节 高效液相色谱仪器
第二节 高效液相色谱仪器
1．高压输液系统
由于高效液相色谱所用固定相颗粒极细，因此对流 动相阻力很大，为使流动相较快流动，必须配备有高压输 液系统。
第一节 概 述
1．高效液相色谱法与经典液相色谱法
HPLC优点：高速、高效、高灵敏度、高自动化。
高速是指在分析速度上比经典液相色谱法快数百倍。 由于经典色谱是重力加料，流出速度极慢；而高效液相色 谱配备了高压输液设备，流速最高可达 10cm3·min-1.
如分离苯的羟基化合物，7个组分只需1min就可完成。
第一节 概 述
2．HPLC与GC
(1)GC分析对象只限于分析气体和沸点较低的化合物，它 们仅占有机物总数的20％。对于占有机物总数近80％的 那些高沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质，目前主 要采用HPLC进行分离和分析。
(2)GC采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力，即 不产生相互作用力，仅起运载作用。而HPLC中流动相 可选用不同极性的液体，选择余地大，它对组分可产生 一定亲和力，并参与固定相对组分作用的剧烈竞争。因 此，流动相对分离起很大作用，相当于增加了一个控制 和改进分离条件的参数，这为选择最佳分离条件提供了 极大方便。
第一节 概 述
(3)GC一般都在较高温度下进行的，而HPLC法则经常可 在室温条件下工作。
总之，HPLC是吸取了GC与经典液相色谱优点， 并用现代化手段加以改进，因此得到迅猛的发展。目 前HPLC已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重 大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、 多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分 离和分析。
对氨基酸分离，用经典色谱法，柱长约170cm，柱径0.9 cm，流动相速度为30cm3·h-1，需用20多小时才能分离出2 0种氨基酸；而用HPLC，只需lh之内即可完成。
又如用25cm×0.46cm的Lichrosorb－ODS(5μ)的柱，采 用梯度洗脱，可在不到0.5h内分离出尿中104个组分.
恒压泵特点：能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱 系统阻力而变化，故保留时间的重视性差。
它们各有优缺点。目前恒流泵正逐渐取代恒压泵。恒流 泵又称机械泵，它又分机械注射泵和机械往复泵两种，应 用最多的是机械往复泵。
第二节 高效液相色谱仪器
输液泵按工作方式分为气动泵和机械泵两大类。机械泵 中又有螺旋传动注射泵、单活塞往复泵、双活塞往复泵 和往复式隔膜泵。几种输液泵的基本性能见下表。
色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（ 即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的 大小，决定色谱过程的保留行为。
根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱 、液液分配色谱、化合键合色谱、离子交换色谱以及分子 排阻色谱等类型。
第二节 高效液相色谱仪器
第二节 高效液相色谱仪器
一、流程（process of HPLC）
第二节 高效液相色谱仪器
双活塞往复泵的输液 流量比单活塞泵小得多。
HPLC主要缺点：仪器设备费用昂贵，操作严格。
第一节 概 述
3. 液相色谱分离原理及分类
和GC一样，LC分离系统也由固定相和流动相组成。 其固定相可以是吸附剂、化学键合固定相（或在惰性载体 表面涂上一层液膜）、离子交换树脂或多孔性凝胶；流动 相是各种溶剂。被分离混合物由流动相液体推动进入色谱 柱。根据各组分在固定相及流动相中的吸附能力、分配系 数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异进igh Performance Liquid Chromatography，HPLC
第一节 概 述
高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代 末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术， 随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广 泛的化学分离分析的重要手段。
它是在经典液相色谱基础上，引入了气相 色谱的理论，在技术上采用了高压泵、高效固 定相和高灵敏度检测器，因而具备速度快、效 率高、灵敏度高、操作自动化的特点。为了更 好地了解高效液相色谱法优越性，现从两方面 进行比较：
它是高效液相色谱仪最重要的部件，一般由储液罐、高 压输液泵、过滤器、压力脉动阻力器等组成。
高压输液泵
核心部件。压力：150～350×105 Pa。 应符合密封性好，输出流量恒定，压力平稳，可调范围 宽，便于迅速更换溶剂及耐腐蚀等要求。
第二节 高效液相色谱仪器
常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。 恒流泵特点：在一定操作条件下，输出流量保持恒定而 与色谱柱引起阻力变化无关；
第二节 高效液相色谱仪器
双活塞往复泵：
如下图a所示，双活塞往复泵有一个精心设计的偏 心凸轮，用同步电机或变速直流电机驱动偏心凸轮， 偏心凸轮再推动两活塞作往复运动。偏心凸轮短半径 端所对应的活塞向外伸，使该活塞的下单向阀打开吸 入流动相，与此同时，偏心凸轮的长半径端所对应的 另一活塞被推入，使其上单向阀打开，并将流动相送 至色谱柱。于是，两活塞交替伸缩，往复运动，获得 的排液特性如图b所示，即具有稳定的输出流量，这 样就能避免单活塞泵液流脉冲的问题。
首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色 谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时， 流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分 离，然后依先后顺序进入 检测器，记录仪将检测器 送出的信号记录下来，由 此得到液相色谱图。
第二节 高效液相色谱仪器
第二节 高效液相色谱仪器
二、主要部件（main assembly of HPLC）