基因工程实验

实验一大肠杆菌基因组DNA的提取及电泳鉴定
一、琼脂糖凝胶电泳注意的问题：
1. 缓冲系统：在没有离子存在时，电导率最小，DNA不迁移，或迁移极慢，在高离子强度的缓冲液中，电导很高并产热，可能导致DNA变性，因此应注意缓冲液的使用是否正确。

长时间高压电泳时，常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。

2. 琼脂糖：不同厂家、不同批号的琼脂糖，其杂质含量不同，影响DNA的迁移及荧光背景的强度，应有选择地使用。

3. 凝胶的制备：凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致，溶解的凝胶应及时倒入板中，避免倒入前凝固结块。

倒入板中的凝胶应避免出现气泡，影响电泳结果。

4. 样品加入量：一般情况下，0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量，加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定，过多的量会造成加样孔超载，从而导致拖尾和弥散，对于较大的DNA此现象更明显。

5. 电泳系统的变化会影响DNA的迁移，加入DNA标准参照物进行判定是必要的。

6. DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率，平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。

7. DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度，迁移分子的形状及大小。

采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子，制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。

小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。

二、如果提取的DNA中含有蛋白质和RNA污染,应如何解决?
蛋白污染可以考虑用酚氯仿多抽提几次,记得吸上清的时候小心点,宁可浪费也别吸到界面.一般后续还需要用氯仿/异戊醇抽提来去除酚.这样基本蛋白污染就可以去干净.实在不行,抽提一次后,就用蛋白酶K消化30min,再抽提.
如果DNA多,RNA污染就添加RNase A消化,你可以中途取少量跑胶检测,RNA去干净了再抽提,再沉淀DNA.
三、如果提取的DNA产量较低，分析原因并提出解决办法。

1）样本材料老化或反复动容导致DNA含量下降。

解决：应选择新鲜的材料样品，不能及时处理的样品应立即放入液氮或-70℃低温保存，以避免DNA降解。

2）样品破壁或裂解不完全，DNA未充分释放。

解决：动植物材料应在液氮中充分研磨匀浆，G+细菌就、酵母等破壁较困难的样品应用溶菌酶、Lyticase酶或机械协助破壁。

3）样品过多导致细胞裂解不充分
解决：不同来源样品根据查阅资料，加量不同。

4）DNA吸附不充分
解决：如在上吸附柱前未加入无水乙醇，或用低浓度乙醇代替无水乙醇，则导致DNA不能充分沉淀，与硅胶膜吸附不彻底，因此在样品裂解后加适量无水乙醇，在加上吸附柱使DNA 与硅胶模充分吸附。

5）DNA洗脱不当
解决：洗脱缓冲液pH值过低会阻碍DNA从硅胶模上洗脱下来，应确保洗脱液pH在7.0~8.5之间。

实验二PCR扩增大肠杆菌甘露-1-磷酸脱氢酶基因及PCR产物的纯化
一、简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用（Mg离子、dNTP、引物DNA、缓冲液、Taq DNA聚合酶）
二、如果检测结果中出现了很多非特异性条带，可能有哪些原因？
①引物特异性不强；②Mg2+浓度过高；③引物二聚体形成；④退火温度过低；⑤循环次数过多
三、PCR过程中预变性3min，最后保温10min的目的分别为
3min是为了使母链被充分打开，10min是为了充分延伸
实验三碱性裂解法提取表达质粒载体PET-28a及电泳鉴定
一、质粒的基本性质有哪些
1,环状DNA分子能够自我复制,或整合到染色体上,随染色体复制.(最重要一点,可复制)
2,有多个限制酶切点(便于切割)
3,有标记基因(便于进行检验)
二、碱裂解细胞抽提质粒的基本原理是什么？
三、操作时应注意的问题
1、溶液一、溶液三冰浴效果好
2、溶液二现用现配
3、溶液三加入后,注意复性时间,太长太短都不行.
4、转管吸取上清液时,不要带入蛋白沉淀,宁缺勿滥.
5、最后干燥时,时间也不宜过长.
6、提取过程应尽量保持低温.
7、提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提.
8、沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全.沉淀DNA也可用异丙醇（一般使用等体积）,且沉淀完全,速度快,但常把盐沉淀下来,所以多数还是用乙醇.
四、多克隆位点
多克隆位点（multiple cloning site, MCS），是包含多个（最多20个）限制性酶切位点
（restriction site）的一段很短的DNA序列。

也称为多位点接头（polylinker），是基因工程中常用到的载体质粒的标准配置序列。

实验四载体质粒、PCR产物的双酶切及酶切产物的纯化
一、使用工具酶时应注意些什么
首先酶都是具有专一性的，对待不同的操作均要选择相适应的酶的种类。

其次在使用工具酶的时候还要注意环境的温度，PH值等环境。

否则会影响酶的活性
二、酶切反应中添加酶的量应该控制在什么范围内?为什么
常规的酶切一般要维持在10-50ul,酶切鉴定10-20ul就可以
三、如果一个DNA 酶解液在电泳后发现DNA 未被切动,你认为可能是什么原因
1.酶失活.
2.DNA序列有问题
实验五、载体片段与PCR产物的连接
一、
二、
不同限制性内切酶处理DNA片段之间可以进行连接吗？为什么
可以，只要都是平端，就都可以
实验六、感受态细胞的制备和重组质粒的转化
一、如何培养宿主菌
根据菌株的不同，选择不同的培养基；根据质粒的不同，选择不同的选择压力，比如抗生素，缺陷培养基等等。

二、制备感受态细胞的原理
感受态细胞（competent cell）：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA 的生理状态。

主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。

由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。

三、为提高转化率，要考虑哪些重要因素
1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度,尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制.DH5α菌株OD600为0.5 时细胞密度是5 ×107/ml ）；2．所有操作均应在无菌条件和冰上进行；
3．经CaCl2处理的细胞,在低温条件下,一定的时间内转化率随时间的推移而增加,24小时达到最高,之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）；
4．化合物及无机离子的影响：在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO 或还原剂等物质处理细菌,可使转化效率大大提高（100-1000 倍）；5．所使用的器皿必须干净.迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率；
6．质粒的大小及构型的影响：用于转化的应主要是超螺旋的DNA ；
7．一定范围内,转化效率与外源DNA 的浓度呈正比；
实验七重组子的鉴定
一、质粒转化后得到的阳性克隆有哪些方法可以鉴定?并说明鉴定的依据。

1. 菌落PCR。

设计引物扩增质粒特有的目的片段，如果阳性克隆里面有改片段，则说明转化成功。

2 快抽质粒。

将阳性菌落划平板，几个小时后，富集菌，然后快速抽提。

看质粒大小有没有插入目的片段。

3 提质粒，酶切鉴定。

4 提质粒测序。

二、说明在重组子鉴定实验中要分别得到怎么样的电泳结果才能说明重组质粒中具有真正确的有甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因
将重组质粒进行酶切,然后电泳,最后分析条带,如果重组质粒酶切后的一条电泳条带与甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因的电泳条带在同一直线上,则说明重组成功。