基因工程实验
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实验一大肠杆菌基因组DNA的提取及电泳鉴定
一、琼脂糖凝胶电泳注意的问题:
1. 缓冲系统:在没有离子存在时,电导率最小,DNA不迁移,或迁移极慢,在高离子强度的缓冲液中,电导很高并产热,可能导致DNA变性,因此应注意缓冲液的使用是否正确。长时间高压电泳时,常更新缓冲液或在两槽间进行缓冲液的循环是可取的。
2. 琼脂糖:不同厂家、不同批号的琼脂糖,其杂质含量不同,影响DNA的迁移及荧光背景的强度,应有选择地使用。
3. 凝胶的制备:凝胶中所加缓冲液应与电泳槽中的相一致,溶解的凝胶应及时倒入板中,避免倒入前凝固结块。倒入板中的凝胶应避免出现气泡,影响电泳结果。
4. 样品加入量:一般情况下,0.5cm宽的梳子可加0.5ug的DNA量,加样量的多少依据加样孔的大小及DNA中片段的数量和大小而定,过多的量会造成加样孔超载,从而导致拖尾和弥散,对于较大的DNA此现象更明显。
5. 电泳系统的变化会影响DNA的迁移,加入DNA标准参照物进行判定是必要的。
6. DNA样品中盐浓度会影响DNA的迁移率,平行对照样品应使用同样的缓冲条件以消除这种影响。
7. DNA迁移率取决于琼脂糖凝胶的浓度,迁移分子的形状及大小。采用不同浓度的凝胶有可能分辨范围广泛的DNA分子,制备琼脂糖凝胶可根据DNA分子的范围来决定凝胶的浓度。小片段的DNA电泳应采用聚丙烯酰胺凝胶电泳以提高分辨率。
二、如果提取的DNA中含有蛋白质和RNA污染,应如何解决?
蛋白污染可以考虑用酚氯仿多抽提几次,记得吸上清的时候小心点,宁可浪费也别吸到界面.一般后续还需要用氯仿/异戊醇抽提来去除酚.这样基本蛋白污染就可以去干净.实在不行,抽提一次后,就用蛋白酶K消化30min,再抽提.
如果DNA多,RNA污染就添加RNase A消化,你可以中途取少量跑胶检测,RNA去干净了再抽提,再沉淀DNA.
三、如果提取的DNA产量较低,分析原因并提出解决办法。
1)样本材料老化或反复动容导致DNA含量下降。
解决:应选择新鲜的材料样品,不能及时处理的样品应立即放入液氮或-70℃低温保存,以避免DNA降解。
2)样品破壁或裂解不完全,DNA未充分释放。
解决:动植物材料应在液氮中充分研磨匀浆,G+细菌就、酵母等破壁较困难的样品应用溶菌酶、Lyticase酶或机械协助破壁。
3)样品过多导致细胞裂解不充分
解决:不同来源样品根据查阅资料,加量不同。
4)DNA吸附不充分
解决:如在上吸附柱前未加入无水乙醇,或用低浓度乙醇代替无水乙醇,则导致DNA不能充分沉淀,与硅胶膜吸附不彻底,因此在样品裂解后加适量无水乙醇,在加上吸附柱使DNA 与硅胶模充分吸附。
5)DNA洗脱不当
解决:洗脱缓冲液pH值过低会阻碍DNA从硅胶模上洗脱下来,应确保洗脱液pH在7.0~8.5之间。
实验二PCR扩增大肠杆菌甘露-1-磷酸脱氢酶基因及PCR产物的纯化
一、简述PCR扩增技术的原理及各种试剂的作用(Mg离子、dNTP、引物DNA、缓冲液、Taq DNA聚合酶)
二、如果检测结果中出现了很多非特异性条带,可能有哪些原因?
①引物特异性不强;②Mg2+浓度过高;③引物二聚体形成;④退火温度过低;⑤循环次数过多
三、PCR过程中预变性3min,最后保温10min的目的分别为
3min是为了使母链被充分打开,10min是为了充分延伸
实验三碱性裂解法提取表达质粒载体PET-28a及电泳鉴定
一、质粒的基本性质有哪些
1,环状DNA分子能够自我复制,或整合到染色体上,随染色体复制.(最重要一点,可复制)
2,有多个限制酶切点(便于切割)
3,有标记基因(便于进行检验)
二、碱裂解细胞抽提质粒的基本原理是什么?
三、操作时应注意的问题
1、溶液一、溶液三冰浴效果好
2、溶液二现用现配
3、溶液三加入后,注意复性时间,太长太短都不行.
4、转管吸取上清液时,不要带入蛋白沉淀,宁缺勿滥.
5、最后干燥时,时间也不宜过长.
6、提取过程应尽量保持低温.
7、提取质粒DNA过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提.
8、沉淀DNA通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA沉淀完全.沉淀DNA也可用异丙醇(一般使用等体积),且沉淀完全,速度快,但常把盐沉淀下来,所以多数还是用乙醇.
四、多克隆位点
多克隆位点(multiple cloning site, MCS),是包含多个(最多20个)限制性酶切位点
(restriction site)的一段很短的DNA序列。也称为多位点接头(polylinker),是基因工程中常用到的载体质粒的标准配置序列。
实验四载体质粒、PCR产物的双酶切及酶切产物的纯化
一、使用工具酶时应注意些什么
首先酶都是具有专一性的,对待不同的操作均要选择相适应的酶的种类。其次在使用工具酶的时候还要注意环境的温度,PH值等环境。否则会影响酶的活性
二、酶切反应中添加酶的量应该控制在什么范围内?为什么
常规的酶切一般要维持在10-50ul,酶切鉴定10-20ul就可以
三、如果一个DNA 酶解液在电泳后发现DNA 未被切动,你认为可能是什么原因
1.酶失活.
2.DNA序列有问题
实验五、载体片段与PCR产物的连接
一、
二、
不同限制性内切酶处理DNA片段之间可以进行连接吗?为什么
可以,只要都是平端,就都可以
实验六、感受态细胞的制备和重组质粒的转化
一、如何培养宿主菌
根据菌株的不同,选择不同的培养基;根据质粒的不同,选择不同的选择压力,比如抗生素,缺陷培养基等等。
二、制备感受态细胞的原理
感受态细胞(competent cell):理化方法诱导细胞,使其处于最适摄取和容纳外来DNA 的生理状态。主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大,直观的说,使得细胞膜表面出现一些孔洞,便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性,这种孔洞会被细胞自身所修复。
三、为提高转化率,要考虑哪些重要因素
1.细菌的生长状态:实验中应密切注视细菌的生长状态和密度,尽量使用对数生长期的细胞(一般通过检测OD600来控制.DH5α菌株OD600为0.5 时细胞密度是5 ×107/ml );2.所有操作均应在无菌条件和冰上进行;
3.经CaCl2处理的细胞,在低温条件下,一定的时间内转化率随时间的推移而增加,24小时达到最高,之后转化率再下降(这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的);
4.化合物及无机离子的影响:在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子(如Mn2+或Co2+)、DMSO 或还原剂等物质处理细菌,可使转化效率大大提高(100-1000 倍);5.所使用的器皿必须干净.迹量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率;
6.质粒的大小及构型的影响:用于转化的应主要是超螺旋的DNA ;
7.一定范围内,转化效率与外源DNA 的浓度呈正比;