蛋白质酪氨酸磷酸酶SHP_1的中药抑制剂筛选
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A0
1. 2. 7 抑制类型 的 测 定 以 不 同 浓 度 的 p2NPP 为 底 物 , 向 MOPS 缓 冲 液 中 加 入 5 μL ΔSHP21 (10 mg /L ) , 将中药提取液进行梯度稀释 , 分别加 5μL中药稀释液于 100μL 反应体系中 , 于 37 ℃反 应 20 m in, 用 100μL 1. 6 mol/L NaOH终止反应后 , 在 405 nm 波长处测定其光吸收值 , 再以反应速度 的倒数对底物浓度的倒数作图.
蛋白包括 SHP21全酶的催化区和 C2末端. 将重组体 pT72ΔSHP21质粒转化到大肠杆菌 DE3细胞中进行
高效表达.
1. 2. 2 ΔSHP21的分离纯化 将含 ΔSHP21质粒的菌种于 LB +Amp 培养基中扩大培养 , 诱导表达后将
菌体破碎液经过 Q 2Sepharose Fast Flow和 SP2Sephadex离子交换层析柱进行分离纯化 , 收集 ΔSHP21.
ΔSHP21, 反应总体系为 100 μL , 37 ℃反应 5 m in 后 , 加入 800 μL 0. 2 mol/L NaOH , 终止反应 , 于
405 nm处测定光吸收值.
酶活力定义为 : 37 ℃时在上述测定条件下每分钟分解 1 nmol底物的酶量为一个活力单位. 计算公
式为 :
酶活力 (U )
(1. 吉林大学 生命科学学院 , 长春 130012; 2. 吉林省中医药科学院 , 长春 130021; 3. 美国俄克拉荷马大学 健康科学中心 , 俄克拉荷马城 73104, 美国 )
摘要 : 用含有蛋白质酪氨酸磷酸酶 SHP21 催化结构域 (ΔSHP21)的质粒转化大肠杆菌 , 得到 ΔSHP21的高效表达 , 经分离纯化后 , 以 ΔSHP21为靶标 , 通过体外酶反应动力学实验 , 对 157 种中药水提液的抑制效果进行研究 , 筛选出两种对 ΔSHP21具有显著抑制作用的中药 : 山茱 萸和蒲公英 , 并对其 IC50及抑制类型做了进一步研究. 为建立蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂的 筛选方法和中药在治疗免疫疾病和糖尿病上的开发和应用提供了理论依据. 关键词 : 包含 SH2结构域的蛋白质酪氨酸磷酸酶 1 ( SHP21) ; 中药 ; 抑制剂 ; 筛选 中图分类号 : Q55 文献标识码 : A 文章编号 : 167125489 (2008) 0621211206
pH = 7. 0, 含 1 mmol/L DTT, 0. 1 mol/L NaC l, 1 mmol/L EDTA , 1 g /L B SA ) 中 加入 5 μL ΔSHP21
(10 mg /L )及 5μL 稀释 100倍后的中药提取液 , 反应总体系为 100μL , 于 37 ℃反应 20 m in, 用 100μL
第 6期
李婉南 , 等 : 蛋白质酪氨酸磷酸酶 SHP21的中药抑制剂筛选
1213
入中药提取液的实验体系为空白对照 , 其光吸收值为 A0 , 其余加入中药提取液的各实验体系的光吸收 值为 A , 则各加入不同浓度的中药抑制剂后 ΔSHP21的相对剩余活性为 :
相对剩余活性 = 1 - A0 - A ×100%.
1. 6 mol/L NaOH终止反应后 , 在 405 nm 波长处测定其光吸收值 , 以未加入中药提取液的实验体系为
空白对照 , 其光吸收值为 A0 , 其余加入中药提取液的各实验体系光吸收值为 A , 则各中药对 ΔSHP21的 抑制率为 :
抑制率 = A0 - A ×100%.
A0
1. 2. 6 半数抑制浓度 ( IC50 )的测定 以 p2NPP ( 20 mmol/L ) 为底物 , 向 MOPS缓冲液中wenku.baidu.com入 5 μL ΔSHP21 (10 mg /L ) , 将中药提取液进行梯度稀释 , 分别加 5 μL 中药稀释液于 100 μL 反应体系中 , 于 37 ℃反应 20 m in, 用 100μL 1. 6 mol/L NaOH终止反应后 , 在 405 nm 波长处测定其光吸收值 , 以未加
1. 2. 3 ΔSHP21 的酶活测定 以对 2硝基苯磷酸 ( p2NPP, 10 mmol/L ) 为底物 , 向 NaAc2HAc 缓冲液
(25 mmol/L , pH = 5. 5, 含 1 mmol/L EDTA , 1 mmol/L DTT, 体积分数为 20%的甘油 ) 中加入 5μL
收稿日期 : 2008201215. 作者简介 : 李婉南 (1975～) , 女 , 汉族 , 博士 , 讲师 , 从事蛋白质酪氨酸结构与功能的研究 , E2mail: wyshshk@ 163. com. 联系人 : 付学奇 (1960～) , 男 , 汉族 , 博士 , 教授 , 博士生导师 , 从事细胞信号传导与药物筛选的研究 , E2mail: fxq@ jlu. edu. cn. 基金项目 : 吉林省科技发展计划项目基金 (批准号 : 20060563; 200705394; 20080434).
第 46卷 第 6期 2008年 11月
吉 林 大 学 学 报 (理 学 版 ) JOURNAL OF J IL IN UN IVERSITY ( SC IENCE ED ITION )
Vol. 46 No. 6 Nov 2008
蛋白质酪氨酸磷酸酶 SHP21的中药抑制剂筛选
李婉南 1 , 李 莹 1 , 庄 妍 1 , 李 贺 1 , 陈颖丽 2 , 赵志壮 1, 3 , 付学奇 1
=
A ×V ε ×L ×t
×δ ×106 ,
其中 A 为光密度 , L 为比色皿内径 ( cm ) , V 为反应总体系 (mL ) , t为反应时间 (m in) , ε = 1. 78 ×104
L / (mol·cm ) , δ为稀释倍数.
1. 2. 4 中药组分的提取 称取 20 g中药生药 , 用 200 mL 蒸馏水浸泡 1 h, 大火煎至沸腾后 , 改为小火
蛋白质酪氨酸磷酸酶 ( Protein Tyrosine Phosphatase, PTPs) 与蛋白质酪氨酸激酶 ( Protein Tyrosine Kinases, PTKs)协同作用 , 控制着蛋白质酪氨酸的磷酸化过程 , 调节细胞生长发育 , 并在细胞信号传导 过程中发挥重要作用 [ 1 ] , 许多生理和病理现象都与此相关 [ 2 ]. 研究表明 , 一些疾病如某些癌症 、糖尿 病 、白血病 、免疫缺陷病 、努南氏综合症等正是由于 PTPs的基因突变或异常表达导致的 [ 3, 4 ] , 因此 PTPs已经成为继 PTKs之后又一个热门的研究领域. SHP21 ( SH22Containing Tyrosine Phosphatase 1) , 又 称为 HCP, SHPTP1或 PTP1C, 是含有 SH2结构域的具有高度保守序列的蛋白质酪氨酸磷酸酶的亚家
( 1. College of L ife S ciences, J ilin U n iversity, Changchun 130012, Ch ina; 2. A cadem y of T rad itiona l Ch inese M ed icine and Herbs of J ilin P rovince, Changchun 130021, Ch ina;
Screen ing Trad itiona l Ch inese M ed ic ines for Inh ib itors of Prote in Tyrosine Phospha ta se SHP21
L IW an2nan1 , L I Ying1 , ZHUAN G Yan1 , L I He1 , CHEN Ying2li2 , ZHAO Zhi2zhuang1, 3 , FU Xue2qi1
煎煮 30 m in, 滤出药液 , 再向药渣中加入 150 mL 蒸馏水 , 以相同方法煎煮 , 滤出药液. 将两次药液合
并 , 于 4 ℃沉淀取上清液备用. 中药水提物浓度为生药质量 /水提液体积.
1. 2. 5 中药抑制效果的测定 以 p2NPP ( 20 mmol/L ) 为底物 , 向 MOPS2NaOH 缓冲液 ( 25 mmol/L ,
许多传统中药在增强免疫力和治疗糖尿病及其并发症方面有显著作用 , 本文应用基因工程技术和 蛋白质的分离纯化技术 , 得到蛋白质酪氨酸磷酸 SHP21的催化结构域 ΔSHP21, 并以 ΔSHP21为靶标 , 通过体外实验 , 对 157种中药水提液对 ΔSHP的抑制作用进行了研究和比较.
1 材料与方法
3. Hea lth S ciences Cen ter, O k lahom a U n iversity, O k lahom a C ity 73104, USA )
Ab s tra c t: W ith pT7 as a vector, ΔSHP21, a recombinant p rotein containing the catalytic dom ain of p rotein tyrosine pho sphatase SHP21, was highly exp ressed in E. coli cells. The enzym e was further purified to near homogeneity. W ith the purified recombinant enzyme as a target, aqueous extracts of 157 traditional Chinese herb medicines were analyzed for their abilities to inhibit SHP21. Two most potent inhibitors, namely, cornel and dandelion, were identified, and their IC50 values and inhibitory types were further analyzed. This study thus established a good system to screen inhibitors of SHP21 and demonstrated the potential of traditional Chinese medicines in treatment of immunological diseases and diabetes. Ke y wo rd s: SH22containing tyrosine phosphatase 1 ( SHP21) ; traditional Chinese herb; inhibitor; screening
1. 1 材 料
157种中药 , 均购自长春市吉林大药房 ; 其他试剂均为国产分析纯.
1. 2 实验方法
1. 2. 1 ΔSHP21基因的克隆表达 参照文献 [ 9 ]的方法 , 将编码 SHP21全酶 2132595位氨基酸残基的
cDNA 片段 PCR 扩增 , 连接到含有 N de Ⅰ和 H ind Ⅲ两种限制性内切酶位点的表达载体 pT7上 , 其编码
1212
吉 林 大 学 学 报 (理 学 版 )
第 46卷
族中的重要成员 [ 5, 6 ] , 是一种胞浆蛋白 , 其 N 端有 2个 SH2结构域 , C端有 1个催化功能结构域. 研究 表明 , SHP21抑制淋巴细胞的激活从而在免疫系统中有重要负调节作用 , SHP21 的缺失会导致自身免 疫缺陷 [6 ]. 最新研究表明 , SHP21与 Ⅱ型糖尿病的发生有关 , SHP21活力的下降或丢失会提高胰岛素 灵敏性及葡萄糖耐受性 , 即 SHP21在调节血糖代谢方面有重要作用 [7 ]. 以上研究表明 , 通过抑制体内 SHP21的活性 , 能增强免疫力并且降低糖尿病患者的血糖. 因此 , 研究和筛选 SHP21的抑制剂对预防 和治疗 ΔSHP21活力增高所导致的相关疾病具有重要意义 [ 8 ].
1. 2. 7 抑制类型 的 测 定 以 不 同 浓 度 的 p2NPP 为 底 物 , 向 MOPS 缓 冲 液 中 加 入 5 μL ΔSHP21 (10 mg /L ) , 将中药提取液进行梯度稀释 , 分别加 5μL中药稀释液于 100μL 反应体系中 , 于 37 ℃反 应 20 m in, 用 100μL 1. 6 mol/L NaOH终止反应后 , 在 405 nm 波长处测定其光吸收值 , 再以反应速度 的倒数对底物浓度的倒数作图.
蛋白包括 SHP21全酶的催化区和 C2末端. 将重组体 pT72ΔSHP21质粒转化到大肠杆菌 DE3细胞中进行
高效表达.
1. 2. 2 ΔSHP21的分离纯化 将含 ΔSHP21质粒的菌种于 LB +Amp 培养基中扩大培养 , 诱导表达后将
菌体破碎液经过 Q 2Sepharose Fast Flow和 SP2Sephadex离子交换层析柱进行分离纯化 , 收集 ΔSHP21.
ΔSHP21, 反应总体系为 100 μL , 37 ℃反应 5 m in 后 , 加入 800 μL 0. 2 mol/L NaOH , 终止反应 , 于
405 nm处测定光吸收值.
酶活力定义为 : 37 ℃时在上述测定条件下每分钟分解 1 nmol底物的酶量为一个活力单位. 计算公
式为 :
酶活力 (U )
(1. 吉林大学 生命科学学院 , 长春 130012; 2. 吉林省中医药科学院 , 长春 130021; 3. 美国俄克拉荷马大学 健康科学中心 , 俄克拉荷马城 73104, 美国 )
摘要 : 用含有蛋白质酪氨酸磷酸酶 SHP21 催化结构域 (ΔSHP21)的质粒转化大肠杆菌 , 得到 ΔSHP21的高效表达 , 经分离纯化后 , 以 ΔSHP21为靶标 , 通过体外酶反应动力学实验 , 对 157 种中药水提液的抑制效果进行研究 , 筛选出两种对 ΔSHP21具有显著抑制作用的中药 : 山茱 萸和蒲公英 , 并对其 IC50及抑制类型做了进一步研究. 为建立蛋白质酪氨酸磷酸酶抑制剂的 筛选方法和中药在治疗免疫疾病和糖尿病上的开发和应用提供了理论依据. 关键词 : 包含 SH2结构域的蛋白质酪氨酸磷酸酶 1 ( SHP21) ; 中药 ; 抑制剂 ; 筛选 中图分类号 : Q55 文献标识码 : A 文章编号 : 167125489 (2008) 0621211206
pH = 7. 0, 含 1 mmol/L DTT, 0. 1 mol/L NaC l, 1 mmol/L EDTA , 1 g /L B SA ) 中 加入 5 μL ΔSHP21
(10 mg /L )及 5μL 稀释 100倍后的中药提取液 , 反应总体系为 100μL , 于 37 ℃反应 20 m in, 用 100μL
第 6期
李婉南 , 等 : 蛋白质酪氨酸磷酸酶 SHP21的中药抑制剂筛选
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入中药提取液的实验体系为空白对照 , 其光吸收值为 A0 , 其余加入中药提取液的各实验体系的光吸收 值为 A , 则各加入不同浓度的中药抑制剂后 ΔSHP21的相对剩余活性为 :
相对剩余活性 = 1 - A0 - A ×100%.
1. 6 mol/L NaOH终止反应后 , 在 405 nm 波长处测定其光吸收值 , 以未加入中药提取液的实验体系为
空白对照 , 其光吸收值为 A0 , 其余加入中药提取液的各实验体系光吸收值为 A , 则各中药对 ΔSHP21的 抑制率为 :
抑制率 = A0 - A ×100%.
A0
1. 2. 6 半数抑制浓度 ( IC50 )的测定 以 p2NPP ( 20 mmol/L ) 为底物 , 向 MOPS缓冲液中wenku.baidu.com入 5 μL ΔSHP21 (10 mg /L ) , 将中药提取液进行梯度稀释 , 分别加 5 μL 中药稀释液于 100 μL 反应体系中 , 于 37 ℃反应 20 m in, 用 100μL 1. 6 mol/L NaOH终止反应后 , 在 405 nm 波长处测定其光吸收值 , 以未加
1. 2. 3 ΔSHP21 的酶活测定 以对 2硝基苯磷酸 ( p2NPP, 10 mmol/L ) 为底物 , 向 NaAc2HAc 缓冲液
(25 mmol/L , pH = 5. 5, 含 1 mmol/L EDTA , 1 mmol/L DTT, 体积分数为 20%的甘油 ) 中加入 5μL
收稿日期 : 2008201215. 作者简介 : 李婉南 (1975～) , 女 , 汉族 , 博士 , 讲师 , 从事蛋白质酪氨酸结构与功能的研究 , E2mail: wyshshk@ 163. com. 联系人 : 付学奇 (1960～) , 男 , 汉族 , 博士 , 教授 , 博士生导师 , 从事细胞信号传导与药物筛选的研究 , E2mail: fxq@ jlu. edu. cn. 基金项目 : 吉林省科技发展计划项目基金 (批准号 : 20060563; 200705394; 20080434).
第 46卷 第 6期 2008年 11月
吉 林 大 学 学 报 (理 学 版 ) JOURNAL OF J IL IN UN IVERSITY ( SC IENCE ED ITION )
Vol. 46 No. 6 Nov 2008
蛋白质酪氨酸磷酸酶 SHP21的中药抑制剂筛选
李婉南 1 , 李 莹 1 , 庄 妍 1 , 李 贺 1 , 陈颖丽 2 , 赵志壮 1, 3 , 付学奇 1
=
A ×V ε ×L ×t
×δ ×106 ,
其中 A 为光密度 , L 为比色皿内径 ( cm ) , V 为反应总体系 (mL ) , t为反应时间 (m in) , ε = 1. 78 ×104
L / (mol·cm ) , δ为稀释倍数.
1. 2. 4 中药组分的提取 称取 20 g中药生药 , 用 200 mL 蒸馏水浸泡 1 h, 大火煎至沸腾后 , 改为小火
蛋白质酪氨酸磷酸酶 ( Protein Tyrosine Phosphatase, PTPs) 与蛋白质酪氨酸激酶 ( Protein Tyrosine Kinases, PTKs)协同作用 , 控制着蛋白质酪氨酸的磷酸化过程 , 调节细胞生长发育 , 并在细胞信号传导 过程中发挥重要作用 [ 1 ] , 许多生理和病理现象都与此相关 [ 2 ]. 研究表明 , 一些疾病如某些癌症 、糖尿 病 、白血病 、免疫缺陷病 、努南氏综合症等正是由于 PTPs的基因突变或异常表达导致的 [ 3, 4 ] , 因此 PTPs已经成为继 PTKs之后又一个热门的研究领域. SHP21 ( SH22Containing Tyrosine Phosphatase 1) , 又 称为 HCP, SHPTP1或 PTP1C, 是含有 SH2结构域的具有高度保守序列的蛋白质酪氨酸磷酸酶的亚家
( 1. College of L ife S ciences, J ilin U n iversity, Changchun 130012, Ch ina; 2. A cadem y of T rad itiona l Ch inese M ed icine and Herbs of J ilin P rovince, Changchun 130021, Ch ina;
Screen ing Trad itiona l Ch inese M ed ic ines for Inh ib itors of Prote in Tyrosine Phospha ta se SHP21
L IW an2nan1 , L I Ying1 , ZHUAN G Yan1 , L I He1 , CHEN Ying2li2 , ZHAO Zhi2zhuang1, 3 , FU Xue2qi1
煎煮 30 m in, 滤出药液 , 再向药渣中加入 150 mL 蒸馏水 , 以相同方法煎煮 , 滤出药液. 将两次药液合
并 , 于 4 ℃沉淀取上清液备用. 中药水提物浓度为生药质量 /水提液体积.
1. 2. 5 中药抑制效果的测定 以 p2NPP ( 20 mmol/L ) 为底物 , 向 MOPS2NaOH 缓冲液 ( 25 mmol/L ,
许多传统中药在增强免疫力和治疗糖尿病及其并发症方面有显著作用 , 本文应用基因工程技术和 蛋白质的分离纯化技术 , 得到蛋白质酪氨酸磷酸 SHP21的催化结构域 ΔSHP21, 并以 ΔSHP21为靶标 , 通过体外实验 , 对 157种中药水提液对 ΔSHP的抑制作用进行了研究和比较.
1 材料与方法
3. Hea lth S ciences Cen ter, O k lahom a U n iversity, O k lahom a C ity 73104, USA )
Ab s tra c t: W ith pT7 as a vector, ΔSHP21, a recombinant p rotein containing the catalytic dom ain of p rotein tyrosine pho sphatase SHP21, was highly exp ressed in E. coli cells. The enzym e was further purified to near homogeneity. W ith the purified recombinant enzyme as a target, aqueous extracts of 157 traditional Chinese herb medicines were analyzed for their abilities to inhibit SHP21. Two most potent inhibitors, namely, cornel and dandelion, were identified, and their IC50 values and inhibitory types were further analyzed. This study thus established a good system to screen inhibitors of SHP21 and demonstrated the potential of traditional Chinese medicines in treatment of immunological diseases and diabetes. Ke y wo rd s: SH22containing tyrosine phosphatase 1 ( SHP21) ; traditional Chinese herb; inhibitor; screening
1. 1 材 料
157种中药 , 均购自长春市吉林大药房 ; 其他试剂均为国产分析纯.
1. 2 实验方法
1. 2. 1 ΔSHP21基因的克隆表达 参照文献 [ 9 ]的方法 , 将编码 SHP21全酶 2132595位氨基酸残基的
cDNA 片段 PCR 扩增 , 连接到含有 N de Ⅰ和 H ind Ⅲ两种限制性内切酶位点的表达载体 pT7上 , 其编码
1212
吉 林 大 学 学 报 (理 学 版 )
第 46卷
族中的重要成员 [ 5, 6 ] , 是一种胞浆蛋白 , 其 N 端有 2个 SH2结构域 , C端有 1个催化功能结构域. 研究 表明 , SHP21抑制淋巴细胞的激活从而在免疫系统中有重要负调节作用 , SHP21 的缺失会导致自身免 疫缺陷 [6 ]. 最新研究表明 , SHP21与 Ⅱ型糖尿病的发生有关 , SHP21活力的下降或丢失会提高胰岛素 灵敏性及葡萄糖耐受性 , 即 SHP21在调节血糖代谢方面有重要作用 [7 ]. 以上研究表明 , 通过抑制体内 SHP21的活性 , 能增强免疫力并且降低糖尿病患者的血糖. 因此 , 研究和筛选 SHP21的抑制剂对预防 和治疗 ΔSHP21活力增高所导致的相关疾病具有重要意义 [ 8 ].