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第四章疏水层析

疏水层析：亦称疏水作用层析(hydrophobic interaction chromatography，HIC)，从分离纯化生命物质的机制来看，它也属于吸附层析一类。

疏水层析和反相层析(reversed phase chromatography)分离生命物质的依据是一致的，即:

视有效成分和固定相之间相互作用的疏水力差异性大小，将有效成分分离出来。

反相层析：

与基质结合的配体密度大，疏水性强，对蛋白质类物质具有较大的吸附力；

欲将吸附物解析下来，须用含有机溶剂的流动相(降低极性)洗脱，方可见效。

洗脱液的极性降低，常常会引起大分子活性物质变性，

因此反相层析一般较适合分离纯化小分子质量的肽类和辅基等物质。

疏水层析(所用基质的性能与反相层析不同)：

与基质结合的配体密度小，疏水性弱，对蛋白质及其复合物仅产生温和的吸附作用，吸附物容易被解析下来。

故，较适合分离纯化盐析后或高盐洗脱下来的物质。

这不仅使有效成分的纯度得到提高，而且还保持了其原来的结构和生物活性。

第一节基本原理

一、疏水作用

就球形蛋白质的结构而言，其分子中的疏水性残基数是从外向内逐步增加的。

一般球形蛋白和膜蛋白的结构均较稳定，在很大程度上是取决于分子中的疏水性作用。

亲水性强的蛋白质与疏水性固定相结合作用原理

一是:靠蛋白质表面的一些疏水补丁(hydrophobic patch)；

二是:令蛋白质发生局部变性(可逆变性较理想)，暴露出掩藏于分子内的疏水性残基；

三是:高盐作用。疏水层析的特性所致，即在高盐浓度下，暴露于分子表面的疏水性残基才能与疏水性固定相作用(这与普通吸附层析和离子交换层析的操作是绝然不同的)。

一般在lmol／L (NH4)2SO4 或2mol／L NaCl 高浓度盐溶液中，亲水性较强的组分物质，会发生局部可逆性变性，并能被迫与疏水的固定相结合在一起，

然后通过降低流动相的离子强度，即可将结合于固定相的物质，按其结合能力大小，依次进行解吸附。

也就是：疏水作用弱(即亲水性强)的物质，用高浓度盐溶液洗脱时，会先被洗下来。

当盐溶液浓度降低时，疏水作用强的物质才会随后被洗下来。

（相同盐浓度下，疏水作用弱的物质先被洗下来疏水作用强的物质随后被洗下来）对于疏水性很强的物质，则需要在流动相添加适量有机溶剂降低极性才能达到解吸附的目的。

二、吸附剂

固定相: 由基质和配体(疏水性基团)两部分构成。

配体对疏水性物质具有一定的吸附力。

基质则有亲水性和非亲水性之分。

亲水性基质与（吸附疏水性物质的）配体构成的固定相，称亲水性吸附剂。

疏水性基质与（吸附疏水性物质的）配体构成的固定相，称疏水性吸附剂。

1．亲水性吸附剂

基质主要是：交联琼脂糖(Sepharose CL-4B)

配体是：苯基或辛基化合物

基质与配体通过耦合方法构成稳定的

苯基(或辛基)-Sepharose Cl-4B吸附剂

2．非亲水性吸附剂

基质有：

硅胶、树脂(苯乙烯、二乙烯聚合物)等

配体为：苯基、辛基、烷基(C4、C8、C18)等。

二者通过共价结合构成非亲水性吸附剂。

第二节操作与应用

一、层析柱的制备

1．层析柱规格

所使用层析柱之规格与普通层析的相似

2．固定相

在进行常压疏水层析时，大多数是选用苯基(或辛基)-Sepharose Cl-4B吸附剂作固定相。

苯基-Sepharose Cl-4B适合于分离纯化与芳香族化合物具有亲和力的物质。

辛基-SepharoseCl-4B则适用于分离纯化亲脂性较强的物质。

3．装柱

将选定的亲水性吸附剂如苯基-Sepharose C1-4B悬浮于乙醇溶液中，浸泡一段时间；

采用离心(或过滤)方法，弃上清液，收集沉淀物；

并以50％(m／V)浓度悬浮于样品缓冲液中；

尔后，按常规方法装入层析柱，经洗涤、平衡完毕，即可加样。

二、加样与洗脱

加样前，在样品溶液中要补加适量的盐类。

(如上所述，加1mol／L(NH2)2SO4或2mol／LNaCl，以使样品中的有效成分变性，并能与固定相很好地相互吸附。)

把此样品溶液徐徐加入固定相(使有效成分与固定相之间作用0.5-1h)后，先用平衡缓冲液洗涤，再用降低盐浓度的平衡缓冲溶液洗脱，

与此同时，要用部分收集器分段收集洗脱下来的溶液，并对收集的每部分溶液进行检测。

固定相进行再生处理后可重复使用。

三、应用实例

1．纯化鸡胗钙调蛋白

取新鲜鸡胗(除去结缔组织)切成1cm3小块，

置组织捣碎机中，加2倍于固形物体积的缓冲液(50mmol／L Tris-HCl，pH8.0，2mmol／L EDTA，1mmol／Lα-巯基乙醇)高速匀浆三次(30s／次)，

离心(8000 r／min，4℃，0.5h)收集鸡胗钙调蛋白抽提液(沉淀重复抽提一次)，合并抽提液，加硫酸铵盐析(pH8.0，60％饱和度)，除去大量杂蛋白，

上清液采用等电点沉淀(用H2S04调pH=4.0)，离心收集含有效成分的沉淀物，

加蒸馏水悬浮，用三羟甲基氨基甲烷(Tris)调pH=7.5～8.0，令其缓慢溶解，

经透析，离心得到溶液

上阴离子DEAE-Sephadex A50层析柱(pH8.0)（离子交换层析），

用梯度缓冲液(10mmol／Ltris-HCl，pH8.0-0.2mol／L NaCl-1mmol／L EDTA-1mmol／Lα-巯基乙醇，盐浓度变化范围为0.2~0.7mol／L NaCl)洗脱，

通过分部收集和活性测定，合并有效成分溶液进行疏水层析。

此层析用的固定相为苯基-Sepharose CL-4B，用其纯化钙调蛋白的流程见图4-1。