黑曲霉酸性_甘露聚糖酶的纯化及部分性质研究

文章编号:1000-1573(2007)01-0055-05

黑曲霉酸性β2甘露聚糖酶的

纯化及部分性质研究

朱 1,　李剑芳2,　邬敏辰1

(1.江南大学医学系,江苏无锡214064;2.江南大学食品学院,江苏无锡214064)

摘　要:黑曲霉(Aspergillus niger )WM20-11固态发酵成熟曲,经磷酸缓冲液浸提、硫酸铵分步盐析、DEAE -Sepharose fast flow 阴离子交换层析、Sephadex G -100凝胶过滤层析等分离纯化手段,最终获得了Native -PA GE 、SDS -PA GE 纯的酸性β2甘露聚糖酶组分,其纯化倍数为25108,收率为511%。Sephadex G -100凝胶过

滤层析和SDS -PA GE 测得纯酶的相对分子质量分别为39kD 和40kD ,表明该酶以单体形式存在;IEF -PA GE 测得该酶的等电点为4.0;含糖量测定为1916%;酶蛋白氨基酸组成中(Asp +G lu )/(Lys +Arg )为3174。关　键　词:酸性β-甘露聚糖酶;黑曲霉;纯化;性质中图分类号:Q 556.2 文献标识码:A

Studies on purif ication and some properties of the acidic

β2m annanase from Aspergillus niger

ZH U Jie 1,LI Jian 2fang 2,WU Min 2chen 1

(1.Department of Medicine ,S outhern Y angtze University ,Wuxi 214064,China ;2.School of Food Science ,S outhern Y angtze University ,Wuxi 214064,China )

Abstract :The acidic β2mannanase from Aspergill us niger WM20211was purified by buffer extrac 2tion ,ammonium sulfate precipitation ,DEAE 2Sepharose fast flow and Sephadex G 2100column chromatographies.The purified enzyme was homogeneous on Native 2PA GE and SDS 2PA GE.After these steps the enzyme was purified by 251082fold with a recovery of 511%.Molecular weight of the β2mannanase was determined as 39kD on Sephadex G 2100gel filtration and 40kD on SDS 2PA GE ,which indicated that the β2mannanase was a monomer.The isoelectric point was estimated to be 410by IEF 2PA GE.Its carbohydrate content was 1916%.The ratio of (Asp +G lu )/(L ys +Arg )was 3174.

K ey w ords :acidic β2mannanase ;Aspergill us niger ;purification ;properties

β2甘露聚糖酶(β2mannanases )通常指β2D 21,42内切甘露聚糖酶(EC 31211178),能特异性水解均一甘露聚糖和非均一甘露聚糖主链内部的β21,42D 2甘露糖苷键,广泛存在于微生物和动植物中[1]。β2甘露聚糖酶可降解魔芋粉、角豆胶和瓜儿豆胶等可食性植物胶为甘露低聚糖,后者能显著促进人体肠道内以双歧杆菌和乳酸菌为代表的有益菌群的增殖,提高机体抗氧化能力[2],降低血糖和改善血液成分[3],以及降低血清总胆固醇和甘油三酯水平等[4]。在饲料工业中,β2甘露聚糖酶可用作饲料添加剂,提高饲料的消化利用率及促进动物的生产性能。在造纸、纺织、洗涤、石油开采和生物技术研究

收稿日期:2006-06-20

基金项目:江南大学校级科研项目(210000-52212052)

作者简介:朱 (1969-),女,江苏无锡人,硕士,讲师,主要从事生物化学与分子生物学研究.

通讯作者:邬敏辰(1962-),男,江苏无锡人,博士,副教授,硕士生导师,主要从事发酵工程与分子生物学研究.

E 2mail :bioch @

第30卷第1期2007年1月

河北农业大学学报

JOURNAL OF AGRICUL TURAL UNIVERSITY OF HEBEI

Vol.30No.1Jan .2007

等诸多领域,β2甘露聚糖酶也有广泛的应用[5]。

本课题组从众多丝状真菌中选育了1株宇佐美曲霉和1株黑曲霉酸性β2甘露聚糖酶高产菌株,对其固态发酵条件进行了探索[1,6]。本研究进一步分离纯化了黑曲霉WM20211固态发酵曲中的β2甘露聚糖酶组分,拟测定该纯酶的某些基本性质和化学组成,为该酶蛋白N末端氨基酸残基的测定、酶基因的克隆和高效表达奠定基础。

1　材料和方法

1.1　菌株

黑曲霉(Aspergill us niger)WM20-11酸性β2甘露聚糖酶高产菌株,由江南大学医学系分子生物学研究室选育和保存。

1.2　主要试剂

DEAE2Sepharose fast flow,Sephadex G2100购自Pharmacia公司;SDS2PA GE低分子量标准蛋白,丙烯酰胺,N,N′2甲叉双丙烯酰胺,N,N,N′,N′2四甲基乙二胺,十二烷基磺酸钠,过硫酸铵均购自上海华美公司(进口分装);牛血清白蛋白,鸡卵白蛋白,胰蛋白酶购自上海伯奥公司;Ampholine(p H315～1010)为Amersham Bio2Sciences公司产品;角豆胶,甘露糖和细胞色素C购自Sigma公司;其他试剂均为国产分析纯。

1.3　主要仪器

冷冻离心机(IEC MUL TI2RF);层析系统;分光光度计(WFZ8002D3B);垂直蛋白电泳系统(Mini2 PRO TEAN II);等电聚焦电泳仪(D YY212C);凝胶成像系统(Touching995);氨基酸自动分析仪(A GI2 L EN T1100)。

1.4　分离纯化步骤

除特别注明外,分离纯化过程均在10℃以下进行;所用缓冲液均为pH710、0102m ol/L的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液(以下简称磷酸缓冲液)。

1.4.1　粗酶液制备　固态发酵曲用6倍体积磷酸缓冲液40℃振荡浸提30min,过滤收集第1次滤液;再用4倍体积缓冲液洗涤滤渣,过滤收集第2次滤液。将第1、2次滤液合并,即为β2甘露聚糖酶粗酶液。

1.4.2　硫酸铵盐析　采用分步盐析法。粗酶液中添加(N H4)2SO4至50%饱和度,4℃静置过夜,离心(4℃,8000r/min,20min),弃沉淀;上清液继续添加(N H4)2SO4至80%饱和度,4℃静置过夜,离心,沉淀备用。

1.4.3　第1次阴离子交换层析　将沉淀溶解、脱盐,对磷酸缓冲液透析,上样至已用磷酸缓冲液平衡的DEAE2Sepharose fast flow阴离子层析柱(116cm×

30cm)上,阶段洗脱。洗脱方式为:依次用含0115、0130和0145mol/L NaCl的磷酸缓冲液洗脱,流速014mL/min,部分收集(4mL/管),测定各管的β2甘露聚糖酶活性。合并较高酶活性的收集液,透析,聚乙二醇20000浓缩。

1.4.4　第2次阴离子交换层析　将第1次阴离子分离的浓缩酶液再次上样至同一层析柱上。洗脱方式为:依次用含0117、0125和0133mol/L NaCl的磷酸缓冲液洗脱,流速012mL/min,部分收集(2 mL/管),测定各管的β2甘露聚糖酶活性。合并较高酶活性的收集液,透析,浓缩。

1.4.5　凝胶过滤层析　将第2次阴离子分离的浓缩酶上样至已用磷酸缓冲液平衡的Sephadex G2100凝胶层析柱(116cm×100cm)上,同一缓冲液洗脱,流速012mL/min,部分收集(2mL/管)。合并较高酶活性的收集液,脱盐,浓缩或冷冻干燥。获得的纯β2甘露聚糖酶样品,用于酶学性质、化学组成及N末端氨基酸残基的测定。

1.5　测定方法

1.5.1　β2甘露聚糖酶活性测定　按文献[7]并略作改动。于210mL510g/L角豆胶底物溶液(p H 418、011mol/L醋酸缓冲液配制)中加入015mL适当稀释的酶液,60℃反应10min;3,5-二硝基水杨酸显色法(DNS法)测定还原糖。在上述条件下,以每分钟水解底物产生1μmol还原糖(以甘露糖计)的酶量为1个β2甘露聚糖酶单位(IU);比酶活性定义为每mL样品液或每mg蛋白中含有的酶活性单位数(IU/mL或IU/mg)。

1.5.2　蛋白质量浓度测定　参照Lowry等[8]的方法进行,以牛血清白蛋白为标准蛋白;在酶的分离纯化过程中,蛋白质量浓度以OD280值表示。

1.5.3　聚丙烯酰胺凝胶电泳　Native2PAGE采用不连续垂直板电泳系统[8],分离胶和浓缩胶浓度分别为75g/L和30g/L;SDS2PAGE也采用不连续垂直板电泳系统[10],分离胶和浓缩胶浓度分别为120g/L和30g/L。

1.5.4　等电聚焦电泳　参照文献[11]的方法进行,等电聚焦电泳(IEF-PAGE)采用进口Ampholine(pH 315～1010)为两性电解质载体,胶浓度为54g/L。电泳结束后,顺电场方向切下1～2道空白泳道,再按泳道垂直方向切成510mm等距离的小块,捣碎,用2mL三蒸水浸泡20min后测定p H值,绘制p H-距离(mm,离正极)标准曲线。

1.5.5　相对分子质量测定　分别采用Sephadex G2 100凝胶过滤和SDS-PA GE两种不同的相对分子质量测定体系。前者测定的是全酶蛋白的相对分子质量,后者是酶蛋白亚基的相对分子质量。

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河北农业大学学报第30卷